Identification and characterisation of ependyma-specific genes and their proteins [Elektronische Ressource] = Identifizierung und Charakterisierung von Ependym-spezifischen Genen und deren Proteine / vorgelegt von Wolfgang Hirschner

De
IdentificationandcharacterisationofependymaspecificgenesandtheirproteinsIdentifizierungundCharakterisierungvonEpendymspezifischenGenenundderenProteineDISSERTATIONderFakultätfürChemieundPharmaziederEberhardKarlsUniversitätTübingenzurErlangungdesGradeseinesDoktorsderNaturwissenschaften2007vorgelegtvonWolfgangHirschnerTagdermündlichenPrüfung:13.04.2007Dekan:Prof.Dr.LarsWesemann1.Berichterstatter:Prof.Dr.B.Hamprecht2.Berichterstatter:Prof.Dr.H.WiesingerDanksagungHerzlichen Dank an Prof. Dr. Bernd Hamprecht für seine permanenteDiskussionsbereitschaft,diezahlreichenAnregungenundseinEngagement,dasesmirermöglichthatmehrereinternationaleKongressebesuchenzudürfen.VielenDankanProf.Dr.HeinrichWiesingerfürdieÜbernahmedesKoreferatsundseinehochinteressanteVorlesung„EnzymologiedesNervensystems“.BeiDr.StephanVerleysdonkbedankeichmichherzlichfürseineüberausengagierteBetreuung, das stetige Interesse am Erfolg des Projektes und für seineMotivationskünste, die mich auch in schwierigen Phasen der Arbeit nicht den Mutverlieren ließen. Der Erfolg dieser Arbeit basiert wesentlich auf seineraußergewöhnlichenUnterstützungDanke an Carina Kramer und Dr.
Publié le : lundi 1 janvier 2007
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Identificationandcharacterisationofependyma
specificgenesandtheirproteins

IdentifizierungundCharakterisierungvon
EpendymspezifischenGenenundderenProteine


DISSERTATION

derFakultätfürChemieundPharmazie
derEberhardKarlsUniversitätTübingen

zurErlangungdesGradeseinesDoktors
derNaturwissenschaften

2007

vorgelegtvon

WolfgangHirschner































TagdermündlichenPrüfung:13.04.2007




Dekan:Prof.Dr.LarsWesemann


1.Berichterstatter:Prof.Dr.B.Hamprecht
2.Berichterstatter:Prof.Dr.H.Wiesinger






Danksagung

Herzlichen Dank an Prof. Dr. Bernd Hamprecht für seine permanente
Diskussionsbereitschaft,diezahlreichenAnregungenundseinEngagement,dases
mirermöglichthatmehrereinternationaleKongressebesuchenzudürfen.

VielenDankanProf.Dr.HeinrichWiesingerfürdieÜbernahmedesKoreferatsund
seinehochinteressanteVorlesung„EnzymologiedesNervensystems“.

BeiDr.StephanVerleysdonkbedankeichmichherzlichfürseineüberausengagierte
Betreuung, das stetige Interesse am Erfolg des Projektes und für seine
Motivationskünste, die mich auch in schwierigen Phasen der Arbeit nicht den Mut
verlieren ließen. Der Erfolg dieser Arbeit basiert wesentlich auf seiner
außergewöhnlichenUnterstützung

Danke an Carina Kramer und Dr. HansMartin Pogoda für die Durchführung der
Zebrafisch Experimente, die entscheidend zum Erfolg des Projektes beigetragen
haben.

ElkeMaierdankeichfürdieperfekteAnfertigungderzahlreichenHirnKryoschnitte.

Danke an Prof. Dr. Günther Jung und Prof. Dr. KarlHeinz Wiesmüller für die
SynthesederPeptide.

Dr.MatthiasLautnerdankeichfürdieBereitstellungdesBullenspermas.

Dr.MirnaRappsageichDankefürdieBereitstellungdesThrombins.

Prof. Dr. Jürgen Seitz und Gerhard Jennemann sowie Prof. Dr. Andreas
ReichenbachundDr.WolfgangHärtigdankeichfürdiefreundlicheAufnahme

in ihren Arbeitsgruppen, ihr Interesse an meiner Arbeit und die
wissenschaftlicheBetreuung.
DemArbeitskreisvonProf.Dr.GabrieleDodt,insbesondereDr.KatjaNausowieder
Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Frank Madeo, vor allem Dr. Eva Herker und Dr. Silke
Wissing danke ich für tatkräftige Hilfe beiderDurchführungdesYeastTwoHybrid
Screens.

Bei Dr. Brigitte PfeifferGuglielmi bedanke ich mich für die Bereitstellung des
Glycogenphosphorylase Antikörpers und die hilfreichen Ratschläge für die
AnfertigungderKryopräparateunddieDurchführungderImmunhistochemie.

Ulrike Thiess danke ich für die professionelle technische Durchführung der
LightcyclerAnalysenundihrenunermüdlichenEinsatz.

Danke an Barbara Birk für die exellente technische Unterstützung und die
zahlreichenamWochenendedurchgeführtenMedienwechsel.

MeinDankgiltRuthSchmidfürdieÜberlassungderselektioniertenAstrogliaKultur.

Herzlichen Dank an die Doktoranden des Arbeitskreises von Dr. Stephan
Verleysdonk,BhawaniShankarKowtharapuundDanielaScheiblefürdiegemeinsam
initiierten und durchgeführten Projekte, sowie an meine weiteren Kollegen Dr.
Benedikt Dolderer, Klaus Frommer, Steffen Kistner, Felix Tritschler und Annette
SchwetzlerfürdiehervorragendeZusammenarbeit.

Dr. Radovan Murin sage ich vielen Danke für die Fragen, Denkanstöße und
Kommentare,sowiefürseineZeitundGeduldbeiderBewältigungderTückendes
MicrosoftOfficePaketes. Danke auch für die Bereitstellung des Druckers zum
AusdruckdieserArbeit.

DankeanDr.JohnWellardfürseinewissenschaftlicheundmentaleUnterstützung
andforthedemonstrationhowrichtheenglishlanguagecanbe.




Danke auch an Prof. Dr. Ralf Dringen und seinen Mitarbeitern Dr. Johannes
Hirrlinger, Dr. HansHerrmann Höpken, Julia Hullmann, Tobias Minich, Petra
Pawlowski, Dr. Cornelia Rüdig und Jens Waak für ihre permanente
Kooperationsbereitschaft.

Vielen Dank an die Mitarbeiter des Lehrstuhl I Claudia Heberle, Hermann
Liggesmeyer, Erika Mikeler, Katharina Rehn und Heide Schmid für ihre ständige
HilfsbereitschaftundihroffenesOhrfürmeineAnliegen.

Einen Dank möchte ich auch an alle Mitarbeiter des Interfakultären Instituts für
BiochemiefürIhreUnterstützungaussprechenunddem"CasinoTeam“einVergelt’s
GottfürdienettenStundenbeiKaffeeundkostenlosgerauchtenZigaretten.“

VielenDankanmeineElternBertaundAlfredHirschnerundanmeineGroßeltern,
die mich stets in jeglicher Hinsicht unterstützen und mir meinen bisherigen
Lebenswegüberhaupterstermöglichthaben.

BeimeinerFreundinDr.CorinnaBährbedankeichmichherzlichdafür,daßsietrotz
5½jährigerWochenendbeziehungundganzbesondersinschwierigenZeitenzu
mirgestandenhat.
Abbreviations
Abbreviations


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according to the instructions for authors of FEBS Journal (available online at
http://www.blackwellpublishing.com/products/journals/suppmat/ejb/ejbtab4.htm).
Suchabbreviationsareusedinthetextandthelegendsoffiguresandtableswithout
priordefinition.

AMV avianmyeloblastosisvirus
ANP atrialnatriureticpeptide
AP alkalinephosphatase
Apaf apoptoticproteaseactivatingfactor
APC astroglialprimaryculture
APS ammoniumperoxodisulfate
AQP aquaporin
ATCC AmericanTypeCultureCollection
BBS BardetBiedlsyndrome
CIAP calfintestinealkalinephosphatase
CNS centralnervoussystem
CP crossingpoint
CSF cerebrospinalfluid
Cy3 carbocyanin3
DAPI 4’,6diamidino2phenylindole
ddH O doublydeionizedwater2
DIG digoxigenin
DMEM Dulbecco’smodifiedEagle’smedium
DMSO dimethylsulfoxide
dNTP deoxyribonucleosidetriphosphate
DTT dithiothreitol
E efficiencyofPCRreaction
ECL enhancedchemiluminescence
EGFP enhancedgreenfluorescentprotein
EPC ependymalprimaryculture
EST expressedsequencetag
Abbreviations
FCS fetalcalfserum
Fig Figure
FITC fluoresceinisothiocyanate
2
g earth’sgravitationalacceleration(9.81m/s )
GFP greenfluorescentprotein
GPBB brainisoformofglycogenphosphorylase
HBSS Hank’sbalancedsaltsolution
hpf hourspostfertilisation
hyh hydrocephalywithhopgait
IFIB InterfacultyInstituteforBiochemistry,UniversityofTuebingen
IFT intraflagellartransport
JNK cJunNterminalkinase
KLH keyholelimpethemocyanin
LB Lysogenybroth
MEM MinimalEssentialMedium
MOPS 3(Nmorpholinopropanesulfonicacid)
NCBI NationalCenterforBiotechnologyInformation,Bethesda,USA
NPs natriureticpeptides
NSF Nethylmaleimidesensitivefactor
OD opticaldensity(absorbance)
PBS phosphatebufferedsaline
PC personalcomputer
PCP planarcellpolarity
PFA paraformaldehyde
PS penicillin/streptomycin
rpm revolutionsperminute
RT 1.reversetranscriptase
2.reversetranscription
3.roomtemperature
SCO subcommissuralorgan
SOC mediumforbacterialliquidculture;superoptimalbroth,catabolite
repression
αSNAP solubleNSFattachmentprotein
SNARE solubleNSFattachmentproteinreceptor
Abbreviations
SOURCE databasename;seehttp://source.stanford.edu
Spag6 spermassociatedantigen6
SVZ subventricularzone
TEMED N,N,N’,N’tetramethylethylenediamine
Tris tris(hydroxymethyl)aminomethane
wdr16CoMO wdr16controlmorpholino
wdr16MO wdr16antisensemorpholino
Content
Content


1.Introduction........................................................................................................... 1
1.1.Thecerebralliquorsystem ..............................................................................................1
1.2.Theependyma..................................................................................................................2
1.2.1.Tanycytes..................................................................................................................2
1.2.2.Normalependymalcells ...........................................................................................2
1.2.3.Ependymaldevelopmentandproliferation...............................................................3
1.3.Thesubcommissuralorgan..............................................................................................3
1.4.Functionofependymalcells............................................................................................3
1.4.1.Involvementoftheependymainneurongeneration ................................................4
1.4.2.Involvementofependymalcellsincerebralenergymetabolism .............................4
1.4.3.Participationoftheependymainbrainwaterandosmoregulation ..........................5
1.5.Hydrocephalus .................................................................................................................5
1.6.Cilia .................................................................................................................................6
1.7.TheWD406repeatproteinfamily ....................................................................................7
1.8.SubtractivecDNAlibraries .............................................................................................7
1.9.Scopeofthethesis ...........................................................................................................9
2.Results................................................................................................................. 10
2.1.Identificationofependyma6specificcDNAfragments..................................................10
2.2.BioinformaticcharacterisationofEpe10/Wdr16...........................................................11
2.2.1.AnalysesoftheprimaryandtertiarystructureofEpe10/Wdr16............................11
2.2.2.IdentificationofEpe10/Wdr16orthologs...............................................................13
2.2.3.AnalysisoftheevolutionaryrelationshipbetweenEpe10/Wdr16orthologs .........15
2.2.4.BioinformaticanalysisofWdr16splicevariantsinhumanandrat ......................16
2.2.5.Evidenceforgeneorthologybetweenratwdr16anditshomologouszebrafish
sequence............................................................................................................................16
2.3.Analysisofthewdr16transcriptionprofile...................................................................17
2.3.1.ConventionalRT6PCR............................................................................................17
2.3.2.Real6timeRT6PCR ................................................................................................18
2.3.3.ExperimentalinvestigationofputativeWdr16splicevariantsintherat ...............21
2.4.DeterminationofimmunoreactivityandspecificityfortheWdr16antiserum..............22
2.4.1.ELISA.....................................................................................................................22
2.4.2.Westernblot............................................................................................................23
2.5.Analysisoftissue6specificWdr16proteinexpressionbyWesternblotting..................25
2.5.1.Rattissuesandcellcultures....................................................................................25
2.5.2.Wdr16indevelopingrattestis,ependymalprimarycultureandastroglialprimary
culture ...............................................................................................................................25
2.5.3.Bullsperm...............................................................................................................26
2.5.4.HepG2cellline.......................................................................................................27
2.6.Analysisofmammaryglandforwdr16expression.......................................................28
2.6.1.Real6timeRT6PCR ................................................................................................28
2.6.2.Westernblot............................................................................................................29
2.7.Comparisonoftranscriptionkineticsbetweenwdr16,sperm6associatedantigen6,
hydinandpolaris ..................................................................................................................30
2.8.AntigenaffinityandspecificityofWdr16antiseruminimmunostainings ...................32
2.9.AffinitypurificationofWdr16antibody .......................................................................33
2.9.1.ELISA.....................................................................................................................33
Content
2.9.2.WesternBlot ...........................................................................................................35
2.10.Immunostainingofcellcultures ..................................................................................35
2.10.1.ImmunostainingofependymalprimarycultureforWdr16..................................35
2.10.2.Immunocytochemicaldoublestainingsofependymalprimaryculturesand
astroglialprimaryculturesforWdr16andα6tubulin ......................................................36
2.10.3.ImmunocytochemicaldoublestainingsofprimaryculturesforWdr16andthe
brainisoformofglycogenphosphorylase ........................................................................37
2.11.Immunohistochemistry ................................................................................................38
2.11.1.StainingofrattestisforWdr16atdifferentanimalage .......................................38
2.11.2.StainingofadultratbrainforWdr16 ...................................................................38
2.11.3.Doubleimmunostainingofdevelopingratbrain..................................................40
2.11.3.1.Wdr16andα6tubulinstainingsofembryonicratbrainatday19of
gestation........................................................................................................................40
2.11.3.2.StainingofbrainfromnewbornratforWdr16andα6tubulin.......................41
2.11.3.3.CostainingofWdr16andeitherα6tubulinorthebrainisoformofglycogen
phosphorylaseinthebrainoftwoday6oldrat .............................................................43
2.12.ZebrafishembryoasasuitablemodelorganismforinvestigatingpossibleWdr16
functions ...............................................................................................................................44
2.12.1.AnalysisofthepresenceofWdr16mRNAinzebrafishembryobyin6situ
hybridisation .....................................................................................................................44
2.12.2.EfficiencyandspecificityoftheWdr16antisensemorpholino ...........................45
2.12.3.ConsequencesofWdr16knockdowninzebrafishembryos.................................46
2.13.Yeast6TwoHybridScreen ..........................................................................................48
3.Discussion........................................................................................................... 49
3.1.PotentialofsubtractiveependymalcDNAlibraries ......................................................49
3.2.ComparisonofWdr16withotherWD406repeatproteins .............................................49
3.3.CongruencebetweenWdr16andtheexpressionofkinocilia .......................................50
3.4.Expressionofthewdr16geneinthehepatocellularcarcinomacelllineHepG2..........53
3.5.ColocalisationofWdr16andthebrainisoformofglycogenphosphorylase ................53
3.6.ComparisonofWdr16knockdown6associatedhydrocephaluswithotheranimalmodels
ofhydrocephalus...................................................................................................................54
3.7.Impactofciliaonthegenerationofcellpolarityandintracellularsignalling...............56
3.8.PutativefunctionofWdr16 ...........................................................................................57
3.9.Outlookandperspectives...............................................................................................59
4.Materialsandmethods ....................................................................................... 60
4.1.Materials ........................................................................................................................60
4.1.1.Devices ...................................................................................................................60
4.1.2.Generalmaterial .....................................................................................................62
4.1.3.Chemicals ...............................................................................................................62
4.1.4.Kits..........................................................................................................................64
4.1.5.Reagentsformolecularbiology..............................................................................65
4.1.6.Enzymesformolecularbiology..............................................................................65
4.1.7.Constituentsandreagentsforbacterialandmammaliancellculturemedia ..........66
4.1.8.Antigenicpeptide....................................................................................................66
4.1.9.Antibodies...............................................................................................................67
4.1.9.1.Primaryantibodies...........................................................................................67
4.1.9.2.Secondaryantibodies.......................................................................................67
4.1.10.Bacterialstrains ....................................................................................................67
4.1.11.Mammaliancells...................................................................................................68
4.1.12.Animals.................................................................................................................68
4.1.13.Vectors..................................................................................................................68

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