Identification des critères du grain de blé (Triticum aestivum L.) favorables à la production de bioéthanol par l'étude d'un ensemble de cultivars et par l'analyse protéomique de lignées isogéniques waxy, Identification of grain wheat (Triticum aestivum L.) criteria associated with bioethanol production in studying a set of cultivars and using proteomic analysis of waxy isogenic lines

De
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Sous la direction de Gérard Branlard
Thèse soutenue le 17 novembre 2010: Clermont Ferrand 2
Dans le but d’identifier des critères de sélection du blé (T. aestivum L.) destiné à la production de bioéthanol, les objectifs de cette thèse étaient (1) de mettre en évidence les caractéristiques physico-chimiques du grain associées aux rendements en glucose et éthanol, et (2), d’étudier par approche protéomique l’effet de variants génétiques affectant la quantité d’amylose sur le métabolisme des sucres et de l’amidon. L’analyse de trente variétés implantées dans un essai multilocal pluriannuel a mis en évidence l’importance du taux de protéines, de la dureté et de la distribution des granules d’amidon sur les rendements en glucose et éthanol. Dans une moindre mesure, la composition allélique des protéines de réserves et la viscosité des arabinoxylanes ont également un effet lors de l’étape de transformation de l’amidon en sucres fermentescibles. Huit lignées isogéniques waxy de trois variétés françaises ont été implantées dans un essai multilocal. Les lignées dépourvues d’amylose ont produit moins de glucose et d’éthanol que les variétés normales. Les analyses protéomiques des protéines de l’albumen (albumines, globulines et amphiphiles) ainsi que des protéines associées aux granules d’amidon des grains matures des lignées isogéniques de la variété Trémie ont mis en évidence : (1) une relation entre le volume spécifique des GBSS et la quantité d’amylose et (2) une modification de l’expression d’enzymes impliquées dans le métabolisme des sucres et de l’amidon (Susy, AGPase, fructose biphosphate aldolase) mais aussi de protéines de stress et de défense (serpines et HSP). Ces observations suggèrent un développement du grain incomplet pour la lignée dépourvue d’amylose.
-Bioéthanol
-Amidon
-Waxy
-Protéomique
-Triticum aestivum
To identify selection criteria for wheat (T. aestivum L.) used for bioethanol production, our objectives were (1) to identify the physicochemical grain characteristics associated with glucose and ethanol yields and (2) using a proteomic approach, to study the impact on sugar and starch metabolism of genetic variants that influence the quantity of amylose. The analysis of 30 wheat varieties grown in a 3-year multi-local field trial underlined the importance of protein content, grain hardness and starch granule size distribution for glucose and ethanol yields. A minor effect of the allelic composition of the storage proteins and of viscosity on the transformation of starch in fermentable sugars was also revealed. Eight waxy isogenic lines of three French varieties were grown in a multi-local field trial. The amylose-free lines produced less glucose and ethanol than normal varieties. Proteomic analyses of endosperm proteins (albumins, globulins and amphiphilic proteins) and of proteins associated with starch granules in mature grains of isogenic lines of the Tremie variety revealed : (1) a relation between the specific volume of the GBSS and amylose quantity and (2) a modification of the expression of enzymes involved in starch and sugar metabolism (Susy, AGPase, Fructose biphosphate aldolase) and also in stress and defence proteins (serpins and HSP). These observations suggest incomplete grain development in the line without amylose.
-Bioethanol
-Starch
-Waxy
-Proteomic
-Triticum aestivum
Source: http://www.theses.fr/2010CLF22067/document
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UNIVERSITE BLAISE PASCAL UNIVERSITE D’AUVERGNE
N° D.U. : 2067 ANNEE 2010


ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE,
DE LA SANTE, AGRONOMIE, ENVIRONNEMENT
N° 530

Thèse


Présentée à l’Université Blaise Pascal
pour l’obtention du grade de


DOCTEUR D’UNIVERSITE
(Specialité : physiologie et génétique moléculaires)

soutenue le 17 Novembre 2010



Clément DEBITON



Identification des critères du grain de blé (Triticum aestivum L.)
favorables à la production de bioéthanol par l’étude d’un ensemble de
cultivars et par l’analyse protéomique de lignées isogéniques waxy





Président : Mohamed Fouad BOUZIDI Professeur, UBP, Clermont Ferrand
Rapporteurs : Véronique PLANCHOT Directeur de recherche, INRA, Nantes
Michel ROSSIGNOL Directeur de recherche, INRA, Montpellier
Examinateurs : Pascale GADONNA Maître de conférence, IPLB, Beauvais
Philippe LEREBOUR Directeur d’Unisigma GIE, Froissy
Directeur de thèse : Gérard BRANLARD Directeur de recherche, INRA, Clermont-Ferrand



Unité Mixte de Recherche 1095 INRA-Université Blaise Pascal
« Génétique, Diversité et Ecophysiologie des Céréales » - 63100 Clermont-Ferrand
tel-00625530, version 1 - 21 Sep 2011
REMERCIEMENTS


Dans ces quelques lignes je tiens à remercier toutes les personnes ayant contribuées à
l’élaboration de cette thèse.

Je souhaite tout d’abord remercier Gérard Branlard, Philippe Lerebour, et Fouad
Bouzidi d’avoir accepté d’encadrer cette thèse.
Je remercie tous les membres du CETAC (Caussade semences, Lemaire Deffontaines,
Momont et Fils, R2N, Saaten Union Recherche, Secobra recherches, Unisigma GIE) ainsi que
l’Institut Polytechnique Lasalle Beauvais (Thierry Aussenac, Pascale Gadonna, Larbi Rhazi et
David Marier) pour leur participation dans ce projet.

Je tiens à remercier tout particulièrement Emmanuelle Bancel ainsi que toutes les
personnes de l’équipe protéomique de l’INRA de Clermont-Ferrand (Marielle Merlino,
Isabelle Nadaud, Annie Faye, René Saccomano) pour leur soutien et leur gentillesse durant
cette thèse.
Merci à tous les stagiaires et non titulaires, Bastien, Aurélie, Sébastien, Géraldine,
Ayesha et Leonor pour leur aide précieuse.

Je souhaite enfin remercier les membres du comité de thèse pour leur suivi des
recherches, et les membres du jury qui ont accepté d’évaluer mon travail.











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SOMMAIRE

I. TRAVAUX ANTÉRIEURS…..……………………………………………………………1
A. LE BLÉ : ORIGINE, STRUCTURE, COMPOSITION, UTILISATIONS ...................... 2
1. Définition et origine ....................................................................................................... 2
2. Structure et composition du grain de blé........................................................................ 2
2.1 Les enveloppes et la couche à aleurone ................................................................... 2
2.2 Le germe................................................................................................................... 4
2.3 L’albumen ................................................................................................................ 4
3. Les protéines du grain de blé.......................................................................................... 5
3.1 Les protéines métaboliques ...................................................................................... 5
3.2 Les protéines de réserves.......................................................................................... 6
4. Production et utilisations du blé ..................................................................................... 7
4.1 La production du blé ................................................................................................ 7
4.2 Les utilisations du blé............................................................................................... 7
B. LES BIOCARBURANTS ................................................................................................. 8
1. Définition des biocarburants .......................................................................................... 8
2. Les enjeux du développement des biocarburants........................................................... 9
2.1 Les exigences du protocole de Kyoto ...................................................................... 9
2.2 La dépendance énergétique .................................................................................... 10
2.3 Une nouvelle filière agroindustrielle créatrice d’emploi........................................ 11
3. La production de biocarburants dans le monde............................................................ 11
3.1 La production de biodiesel ..................................................................................... 11
3.2 La production de bioéthanol................................................................................... 11
4. Processus de fabrication du bioéthanol ........................................................................ 12
4.1 Le broyage.............................................................................................................. 12
4.2 Gélatinisation et liquéfaction ................................................................................. 13
4.3 La saccharification ................................................................................................. 13
4.4 La fermentation ...................................................................................................... 14
4.5 La distillation et la déshydratation ......................................................................... 14
5. Développement et limite de la production de bioéthanol............................................. 14
C. QUEL BLÉ POUR LA PRODUCTION DE BIOÉTHANOL ? ..................................... 15
1. L’amidon et le taux de protéines : deux paramètres fortement corrélés au rendement en
bioéthanol ......................................................................................................................... 15
1.1 L’amidon et les sucres............................................................................................ 15
1.2 Le taux de protéines ............................................................................................... 16
2. Les paramètres du grain pouvant avoir un effet sur la production de bioéthanol ........ 16
2.1 La composition de l’amidon................................................................................... 16
2.2 La dureté et la distribution de la taille des granules d’amidon............................... 17
2.3 L’activité alpha amylasique.................................................................................... 17
2.4 Les polyssacharides autres que l’amidon (NSP) .................................................... 17

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D. STRUCTURE ET COMPOSITION DE L’AMIDON.................................................... 19
1. Composition de l’amidon ............................................................................................. 19
1.1 L’amylose............................................................................................................... 19
1.2 L’amylopectine....................................................................................................... 19
1.3 Les composés minoritaires de l’amidon................................................................. 20
2. Structure de l’amidon ................................................................................................... 21
2.1 A l’échelle 1-100 μm : le granule d’amidon .......................................................... 21
2.2 A l’échelle 120-500 nm : les cercles de croissance................................................ 22
2.3 A l’échelle 20-500 nm : les blocklets..................................................................... 22
2.4 A l’échelle 9 nm : les lamelles amorphes et cristallines ........................................ 22
3. La structure semi-cristalline ......................................................................................... 22
3.1 La phase cristalline................................................................................................. 22
3.2 La phase amorphe................................................................................................... 23
4. Changement d’état de l’amidon en fonction de la température et de l’humidité ......... 23
4.1 La gélatinisation ..................................................................................................... 24
4.2 La rétrogradation .................................................................................................... 25
E. LA VOIE DE BIOSYNTHÈSE DE L’AMIDON .......................................................... 26
1. L’ADP glucose pyrophosphorylase (AGPase)............................................................. 27
1.1 Généralités.............................................................................................................. 27
1.2 Rôle de l’AGPase ................................................................................................... 28
1.3 Régulation de l’AGPase ......................................................................................... 28
1.4 Le transporteur de l’ADP-glucose à travers la membrane du plastide chez les
céréales ......................................................................................................................... 29
2. Les starch synthases ..................................................................................................... 30
2.1 GBSS...................................................................................................................... 31
2.2 Les starch synthases SSI ........................................................................................ 33
2.3 Les starch synthases SSII ....................................................................................... 34
2.4 Les starch synthases SSIII...................................................................................... 35
2.5 La starch synthase SSIV......................................................................................... 36
3. Les branching enzymes ................................................................................................ 36
3.1 Généralités.............................................................................................................. 37
3.2 Propriétés................................................................................................................ 37
4. Les starch debranching enzymes.................................................................................. 38
4.1 Généralités.............................................................................................................. 38
4.2 Propriétés................................................................................................................ 39
5. Les autres enzymes intervenant dans la biosynthèse de l’amidon ............................... 40
5.1 La starch phosphorylase ......................................................................................... 40
5.2 La glucane water dikinase ...................................................................................... 41
5.3 La D-enzyme .......................................................................................................... 41
5.4 L’amylogénine, un homologue de la glycogénine ................................................. 42
6. Modèle de synthèse de l’amylopectine et de l’amylose............................................... 43
6.1 La synthèse de l’amylopectine ............................................................................... 43
6.2 La synthèse de l’amylose ....................................................................................... 44
II. PROBLÉMATIQUE DE LA THÈSE ............................................................................. 45

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III. DÉTERMINATION D’UN IDÉOTYPE DE BLÉ DESTINÉ À LA PRODUCTION
DE BIOÉTHANOL................................................................................................................ 50
A. INTRODUCTION........................................................................................................... 51
B. MATÉRIELS ET MÉTHODES ...................................................................................... 53
1. Matériel végétal et dispositif expérimental .................................................................. 53
2. Caractérisation des grains de blé.................................................................................. 53
3. Dureté et teneur en protéines........................................................................................ 54
4. Composition allélique des sous unités de haut et faible poids moléculaire ................. 54
5. Distribution de la taille des granules d’amidon............................................................ 54
6. Rendement en éthanol et glucose ................................................................................. 55
7. Tests statistiques........................................................................................................... 56
C. RÉSULTATS................................................................................................................... 57
1. Description des variétés françaises pour les caractéristiques physicochimiques et
technologiques du grain ................................................................................................... 57
1.1 Amplitude des variations observées....................................................................... 57
1.2 Analyse de variance sur les variétés françaises...................................................... 58
1.3 L’analyse en composantes principales ................................................................... 58
1.4 Les corrélations entre les différentes variables ...................................................... 59
1.5 Les corrélations avec les rendements en glucose et en éthanol.............................. 60
1.6 Effet des allèles de gluténines de haut et faible poids moléculaire sur le rendement
en glucose et éthanol. ................................................................................................... 62
2. Description des lignées isogéniques pour les caractéristiques physicochimiques et
technologiques du grain ................................................................................................... 63
2.1 Amplitude des variations observées....................................................................... 63
2.2 Analyse de variance sur les lignées isogéniques waxy .......................................... 65
2.3 Analyses en composantes principales des lignées isogéniques Soissons, Trémie et
Crousty ......................................................................................................................... 66
2.4 Analyses en composantes principales sur les lignées isogéniques de Trémie et leur
rendement en glucose et éthanol. ................................................................................. 66
2.5 Les corrélations avec les rendements en glucose et éthanol .................................. 67
D. DISCUSSION.................................................................................................................. 68
1. Les ACP des variétés françaises donnent un aperçu des relations entre les différentes
variables et le rendement en éthanol ................................................................................ 68
1.1 Premier axe : La relation entre la dureté et la taille des granules d’amidon .......... 68
1.2 Deuxième axe : les rendements en glucose et en éthanol, le PMG et le taux de
protéines ....................................................................................................................... 69
2. Le temps de chute de Hagberg faible chez les lignées isogéniques triples nulles ....... 69
3. L’effet des allèles des sous unités de gluténines de haut et faible poids moléculaire sur
les rendements en glucose et en éthanol........................................................................... 69
4. Les caractéristiques du grain corrélées aux rendements en glucose et en éthanol....... 71
5. Les lignées waxy de Trémie et le rendement en glucose ............................................. 72
6. Brève conclusion .......................................................................................................... 73

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IV. PRINCIPE DE L’ANALYSE PROTÉOMIQUE.......................................................... 74
A. DÉFINITION .................................................................................................................. 75
B. PRINCIPALES ÉTAPES DE L’ANALYSE PROTÉOMIQUE..................................... 75
1. Extraction et solubilisation des protéines..................................................................... 75
2. Le dosage des protéines................................................................................................ 76
3. L’electrophorèse bidimensionnelle .............................................................................. 76
3.1 La première dimension : l’électrofocalisation........................................................ 76
3.2 La deuxième dimension : l’électrophorèse SDS-PAGE ........................................ 77
4. La coloration des gels................................................................................................... 77
5. L’analyse d’image ........................................................................................................ 78
6. L’identification des protéines par spectrométrie de masse .......................................... 78
6.1 L’ionisation des échantillons.................................................................................. 78
6.2 L’analyse des ions chargés..................................................................................... 79
6.3 L’analyse des banques de données......................................................................... 79
V. ANALYSES PROTÉOMIQUES DES ALBUMINES, GLOBULINES ET
PROTÉINES AMPHIPHILES DES LIGNÉES ISOGÉNIQUES WAXY ....................... 81
A. ABSTRACT .................................................................................................................... 83
B. INTRODUCTION ........................................................................................................... 84
C. EXPERIMENTAL........................................................................................................... 85
1. Plant material................................................................................................................ 85
2. Protein extraction ......................................................................................................... 86
2.1 Albumins-globulins extraction............................................................................... 86
2.2 Amphiphilic proteins extraction............................................................................. 86
3. Bi-dimensional electrophoresis .................................................................................... 87
4. Image analysis .............................................................................................................. 88
5. Protein identification .................................................................................................... 88
6. Grain and starch granule characterization.................................................................... 89
7. Determination of sugar content .................................................................................... 90
8. Susy and AGPase activities.......................................................................................... 90
D. RESULTS........................................................................................................................ 91
1. Protein variations in the albumin-globulin fraction ..................................................... 91
2. Protein variations in the amphiphilic fraction .............................................................. 93
3. Sugar content, Susy activity and AGPase activity ....................................................... 95
E. DISCUSSION.................................................................................................................. 95
F. REFERENCES............................................................................................................... 100
VI. EFFETS DES TROIS ALLÈLES NULS DES GÈNES WAXY SUR LES ENZYMES
ASSOCIÉES AUX GRANULES D’AMIDON .................................................................. 104
A. ABSTRACT .................................................................................................................. 106
B. INTRODUCTION ......................................................................................................... 107
C. EXPERIMENTAL......................................................................................................... 108
1. Plant material.............................................................................................................. 108
2. Purification of starch granules.................................................................................... 109
3. Protein extraction for one dimensional electrophoresis ............................................. 109
4. Protein extraction for two-dimensional electrophoresis............................................. 110
5. Two-dimensional electrophoresis .............................................................................. 110

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6. Image analysis ............................................................................................................ 111
7. Protein identification .................................................................................................. 111
8. Amylose determination .............................................................................................. 113
D. RESULTS...................................................................................................................... 113
1. One dimensional gel electrophoresis.......................................................................... 113
2. Protein variation on the 2DE gels .............................................................................. 114
3. Protein identification .................................................................................................. 115
E. DISCUSSION................................................................................................................ 117
F. REFERENCES............................................................................................................... 122
VII. DISCUSSION ET PERSPECTIVES.......................................................................... 125
A. DÉTERMINATION D’UN TYPE DE BLÉ ADAPTÉ À LA PRODUCTION DE
BIOETHANOL .................................................................................................................. 126
1. Le taux de protéines : indicateur de la quantité de sucres fermentescibles................ 126
2. La dureté et la distribution des granules d’amidon : impacts sur l’efficacité
d’hydrolyse..................................................................................................................... 127
3. La composition en protéines de réserves et la teneur en arabinoxylanes : deux
paramètres à considérer.................................................................................................. 128
4. Les lignées isogéniques waxy et les rendements en glucose et éthanol..................... 129
B. EFFETS DES ALLÈLES NULS WAXY SUR LA PHYSIOLOGIE DU GRAIN DE
BLÉ .................................................................................................................................... 130
1. Effets des allèles nuls des trois gènes waxy sur les enzymes associées aux granules
d’amidon......................................................................................................................... 130
2. Effets des allèles nuls sur le métabolisme des sucres et de l’amidon ........................ 132

VIII. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
IX. ANNEXES
A. ANNEXES DES VARIÉTÉS FRANÇAISES
B. ANNEXES DES LIGNÉES ISOGÉNIQUES WAXY













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ABRÉVIATIONS

2DE 2-dimensional electrophoresis
3-PGA Acide 3 phosphoglycérique
AACC American Association of Cereal Chemists
ACP Analyse en composantes principales
ADEME Agence de l'Environnement et de la Maîtrise de l'Energie
ADP Adenosine diphosphate
ADPGlc Adenosine diphosphate glucose
AF Autofécondation, autofécondé
AGPase ADP-Glucose pyrophosphorylase;
ANOVA Analysis of variance
ATP Adenosine triphosphate
BC Backcross
BE Branching enzyme
CAU Caussade
CFD Clermont-Ferrand
CHAPS 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate;
CITEPA Centre Interprofessionnel Technique d'Études de la Pollution Atmosphérique
DAF Day after flowering (jour après floraison)
DArT Diversity Arrays Technology
DBE Debranching enzyme
D-enzyme D disproportionating enzyme
DP Degré de polymérisation
DTT Dithiothreitol
DW Dry Weight
E2D Electrophorèse bidimensionnelle
EBI European Bioinformatics Institute
Ebio European bioethanol fuel association
EDTA Acide éthylène diamine tetra acétique
EMBL European Molecular Biology Laboratory
EMHV Ester méthylique d’huile végétale
EST Expressed sequence tag
ETBE Ethyle Tertio Butyl ether
Frc 6P Fructose 6 phosphate
GBSS Granule Bound Starch Synthase
GES Gaz à effets de serre
GFP Green fluorescent protein
GLM General linear model
Glc 1P Glucose 1 phosphate
Glc 6P Glucose 6 phosphate
GWD Glucan water dikinase
HCA Hierarchical Clustering Analysis
HPLC High Performance Liquid Chromatography

tel-00625530, version 1 - 21 Sep 2011

IPG Immobiline pH Gradient
JRC Joint Research Center
KO Knock Out
LC-MSMS Liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry
LeD Lemaire Deffontaines
MALDI-TOF Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation – Time Of Flight
MOM Momont
MOS oligosaccharide de maltose
NADPH Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate
NDP Nucléoside diphosphate
NIL Near Isogenic Lines
NSP Non Starch Polysaccharide
NYMEX New York Mercantile Exchange
ONIGC Office national interprofessionnel des grandes cultures
PGM Phosphoglucomutase
pI Point Isoélectrique
Pi Phosphate inorganique
PM Poids Moléculaire
PMG Poids de mille grains
Ppi inorganic pyrophosphate
PVPP Polyvinylpolypyrrolidone
PWD Phosphoglucan water dikinase
SDS Sodium Dodecyl Sulfate
SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
SEC Secobra
SG-FPM Sous-unités gluténines de faible poids moléculaire
SG-HPM Sous-unités gluténines de haut poids moléculaire
SGP Starch granule protein
SRS Sequence retrieval System
SS Starch synthase
SSR Simple sequence repeats
Susy Sucrose synthase
TKW Thousand Kernel Weight
UDP Uridine diphosphate
UDPGlc Uridine diphosphate glucose
UNI Unisigma
UTP Uridine triphosphate
WTI World Texas Intermediate
Wx Waxy



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I. TRAVAUX ANTÉRIEURS


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