Identification et caractérisation fonctionnelle de gènes régulateurs de la voie de biosynthèse des flavonoïdes chez la Vigne

Imene Hichri

Description

Sous la direction de Virginie Lauvergeat
Thèse soutenue le 12 novembre 2009: Bordeaux 1
Les composés phénoliques de la baie, et plus particulièrement les flavonoïdes (flavonols, tanins condensés, anthocyanes), constituent un des paramètres clés contrôlant la qualité organoleptique du raisin et du vin. Ils représentent également une source de molécules antioxydantes d’intérêt grandissant pour les industries pharmacologiques, agro-alimentaires et cosmétiques. De nombreux travaux réalisés sur les plantes modèles ont démontré que la régulation de la voie de biosynthèse des flavonoïdes est essentiellement gouvernée par des facteurs de transcription de type MYB, bHLH et des protéines de type WD40. Chez la Vigne (Vitis vinifera L.), plusieurs facteurs de transcription de type MYB régulant la voie des anthocyanes et/ou des tanins condensés ont déjà été identifiés. Cependant, aucun facteur de transcription de type bHLH ou WD40 n’a encore été caractérisé. Différentes approches ont été mises en œuvre pour identifier de nouveaux régulateurs de la voie des flavonoïdes chez la Vigne. Dans un premier temps, le facteur de transcription VvMYB5b a été utilisé comme appât dans une approche de double hybride non ciblé chez la Levure (Saccharomyces cerevisiae). Dans un deuxième temps, le promoteur d’un gène codant une enzyme centrale de la voie de biosynthèse des flavonoïdes, VvDFR, a été choisi afin de développer une approche de simple hybride non ciblé chez la Levure. Enfin, une approche ciblée vers des « gènes candidats » a permis l’identification des facteurs de transcription de type bHLH VvMYC1 et VvMYCA1. Le profil d’expression de VvMYCA1 correspond à celui de l’accumulation des tanins condensés dans la pellicule, et celui de VvMYC1 corrèle avec le profil de synthèse des flavonols, des anthocyanes et des tanins condensés dans la baie de raisin, ainsi que dans les inflorescences. De plus, VvMYC1 peut interagir avec différents partenaires MYB de Vigne régulant la synthèse des anthocyanes et/ou des tanins condensés, à la fois dans la Levure mais également in planta, où l’interaction VvMYC1/VvMYBs affecte l’expression de gènes structuraux tels que l’UFGT et l’ANR. Cette interaction induit une synthèse d’anthocyanes, aussi bien en système homologue qu’en système hétérologue (Tabac et Arabidopsis). Enfin, des essais complémentaires impliquant le promoteur de VvMYC1 ont permis de démontrer que VvMYC1, en interagissant avec VvMYBPA1, peut moduler sa propre expression in vivo.
-Vigne
-facteurs de transcription
-flavonoïdes
-MYB
-régulation
-bHLH
-transcription
Phenolic compounds, and more specifically flavonoids (flavonols, condensed tannins and anthocyanins), are key components of the grapevine and wine quality. Because of their antioxidant activities, these compounds are of interest in pharmacological and cosmetic industries, as well as being beneficial to the human diet. Previous work on model plants showed that the flavonoid pathway was mainly regulated by the MYB and bHLH transcription factors, and WD40 proteins. In the grapevine (Vitis vinifera L.), only MYB regulators have been identified until now, and no bHLH or WD40 have been characterised. In this work, several approaches were used to identify new transcription factors involved in grapevine flavonoid biosynthesis. Firstly, the VvMYB5b protein was used as a bait in a large scale two hybrid experiment in yeast (Saccharomyces cerevisiae). Secondly, the promoter of the VvDFR gene, coding a central enzyme of the flavonoid pathway, was chosen to conduct a large scale one hybrid experiment, also in yeast. Finally, a “gene candidate” approach allowed identification of the bHLH transcription factors VvMYC1 and VvMYCA1. VvMYCA1 expression profile in berry skin and seeds correlates with condensed tannins synthesis, whereas VvMYC1 transcript accumulation in these tissues and the grapevine inflorescence correlates with condensed tannins, anthocyanins and flavonols accumulation. In yeast, VvMYC1 could physically interact with different MYB partners regulating the anthocyanin or the condensed tannins biosynthesis. This interaction was confirmed by transient promoter assays in grape cell suspensions, where co-expression of VvMYC1 with specific MYB partners activated the UFGT and ANR promoters. Likewise, this interaction induced anthocyanin accumulation in grape cells, as well as in tobacco leaves and Arabidopsis. Eventually, additional transient promoter assays revealed that VvMYC1 is involved, with VvMYBPA1, in feedback regulation of its own expression.
Source: http://www.theses.fr/2009BOR13875/document

Sujets

• Vigne
• Facteur de transcription
• Régulation

Informations

• Publié par: Thesee
• Nombre de lectures: 150
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 24 Mo

Extrait

N° d’ordre : 3875
THESE

PRESENTEE A

L’UNIVERSITE BORDEAUX 1

ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE

PAR

Imène Hichri

POUR OBTENIR LE GRADE DE

DOCTEUR

SPECIALITE : BIOLOGIE VEGETALE




Identification et caractérisation fonctionnelle de gènes
régulateurs de la voie de biosynthèse des flavonoïdes chez
la Vigne



soutenue le 12 Novembre 2009




Devant le jury composé de :


Mme Jacqueline Grima-Pettenati Directrice de Recherches, CNRS TOULOUSE Rapporteur
M Philippe Hugueney Directeur de Recherches, INRA COLMAR Rapporteur

Mme Rossitza Atanassova Professeur, Univ. de POITIERS Examinatrice
Mme Stéphanie Cluzet Maître de Conférences, Univ. BORDEAUX 2 Examinatrice
M Serge Delrot Professeur, Univ. BORDEAUX 2 Examinateur
Mme Virginie Lauvergeat Maître de Conférences, Univ. BORDEAUX 1 Dir. de thèse


1
RESUME






Les composés phénoliques de la baie, et plus particulièrement les flavonoïdes (flavonols,
tanins condensés, anthocyanes), constituent un des paramètres clés contrôlant la qualité
organoleptique du raisin et du vin. Ils représentent également une source de molécules
antioxydantes d’intérêt grandissant pour les industries pharmacologiques, agro-alimentaires et
cosmétiques. De nombreux travaux réalisés sur les plantes modèles ont démontré que la
régulation de la voie de biosynthèse des flavonoïdes est essentiellement gouvernée par des
facteurs de transcription de type MYB, bHLH et des protéines de type WD40. Chez la Vigne
(Vitis vinifera L.), plusieurs facteurs de transcription de type MYB régulant la voie des
anthocyanes et/ou des tanins condensés ont déjà été identifiés. Cependant, aucun facteur de
transcription de type bHLH ou WD40 n’a encore été caractérisé.
Différentes approches ont été mises en œuvre pour identifier de nouveaux régulateurs de la
voie des flavonoïdes chez la Vigne. Dans un premier temps, le facteur de transcription
VvMYB5b a été utilisé comme appât dans une approche de double hybride non ciblé chez la
Levure (Saccharomyces cerevisiae). Dans un deuxième temps, le promoteur d’un gène codant
une enzyme centrale de la voie de biosynthèse des flavonoïdes, VvDFR, a été choisi afin de
développer une approche de simple hybride non ciblé chez la Levure.
Enfin, une approche ciblée vers des « gènes candidats » a permis l’identification des
facteurs de transcription de type bHLH VvMYC1 et VvMYCA1. Le profil d’expression de
VvMYCA1 correspond à celui de l’accumulation des tanins condensés dans la pellicule, et
celui de VvMYC1 corrèle avec le profil de synthèse des flavonols, des anthocyanes et des
tanins condensés dans la baie de raisin, ainsi que dans les inflorescences. De plus, VvMYC1
peut interagir avec différents partenaires MYB de Vigne régulant la synthèse des anthocyanes
et/ou des tanins condensés, à la fois dans la Levure mais également in planta, où l’interaction
VvMYC1/VvMYBs affecte l’expression de gènes structuraux tels que l’UFGT et l’ANR.
Cette interaction induit une synthèse d’anthocyanes, aussi bien en système homologue qu’en
système hétérologue (Tabac et Arabidopsis). Enfin, des essais complémentaires impliquant le
promoteur de VvMYC1 ont permis de démontrer que VvMYC1, en interagissant avec
VvMYBPA1, peut moduler sa propre expression in vivo.

Mots clés : Vigne-flavonoïdes-régulation-transcription-facteurs de transcription-MYB- bHLH









2
ABSTRACT




Phenolic compounds, and more specifically flavonoids (flavonols, condensed tannins and
anthocyanins), are key components of the grapevine and wine quality. Because of their
antioxidant activities, these compounds are of interest in pharmacological and cosmetic
industries, as well as being beneficial to the human diet. Previous work on model plants
showed that the flavonoid pathway was mainly regulated by the MYB and bHLH
transcription factors, and WD40 proteins. In the grapevine (Vitis vinifera L.), only MYB
regulators have been identified until now, and no bHLH or WD40 have been characterised.
In this work, several approaches were used to identify new transcription factors involved in
grapevine flavonoid biosynthesis. Firstly, the VvMYB5b protein was used as a bait in a large
scale two hybrid experiment in yeast (Saccharomyces cerevisiae). Secondly, the promoter of
the VvDFR gene, coding a central enzyme of the flavonoid pathway, was chosen to conduct a
large scale one hybrid experiment, also in yeast.
Finally, a “gene candidate” approach allowed identification of the bHLH transcription
factors VvMYC1 and VvMYCA1. VvMYCA1 expression profile in berry skin and seeds
correlates with condensed tannins synthesis, whereas VvMYC1 transcript accumulation in
these tissues and the grapevine inflorescence correlates with condensed tannins, anthocyanins
and flavonols accumulation. In yeast, VvMYC1 could physically interact with different MYB
partners regulating the anthocyanin or the condensed tannins biosynthesis. This interaction
was confirmed by transient promoter assays in grape cell suspensions, where co-expression of
VvMYC1 with specific MYB partners activated the UFGT and ANR promoters. Likewise, this
interaction induced anthocyanin accumulation in grape cells, as well as in tobacco leaves and
Arabidopsis. Eventually, additional transient promoter assays revealed that VvMYC1 is
involved, with VvMYBPA1, in feedback regulation of its own expression.

Key words: Grapevine-flavonoids- regulation-transcription-transcription factors-MYB-bHLH

















3
ABREVIATIONS


3’UTR 3’ Untranslated Region (région non traduite en 3’)
5’UTR 5’ Untranslated Region (région non traduite en 5’)
aa acide aminé
ABA Acide Abscissique
ADN Acide Désoxyribonucléique
ADNc Acide Désoxyribonucléique complémentaire
ADN-T Acide Désoxyribonucléique de Transfert
ANA Acide Naphtalène Acétique
ARN Acide Ribonucléique (m: messager, r: ribosomal)
ARN pol II ARN polymérase II
ARS Séquence de Réplication Autonome
BAP 6-Benzylaminopurine
BET Bromure d’Ethidium
CTAB Bromure d’hexadécyltriméthylammonium
dA/T/C/GTP désoxyAdénos/Thymid/Cytos/Guanos/ine 5’Triphosphate
DAPI 4’6’ Di Amidino-2-Phényl Indole
DEPC Diéthyl Pyrocarbonate
DMSO Diméthylsulfoxyde
dNTP désoxynucléoside 5’Triphosphate
DPBA Diphénylboric Acid 2-aminoéthyl ester
DTT Dithiothréitol
EBG Early Biosynthetic Genes (gènes de biosynthèse précoces)
EMS Ethyl Méthyl Sulfonate
EMSA Electrophoretic Mobility Shift Assay
EST Expressed Sequence Tag
FT Facteur de Transcription
GTF General Transcription Factor
IAA Alcool Isoamylique
IPTG Isopentényl-β-D-thiogalactopyranoside
EDTA Acide éthylène diamine tétraacétique
HPLC Chromatographie Liquide à Haute Performance
LB « Left Border » (bordure gauche d’un ADN-T)
LB Luria Bertani
LBG Late Biosynthetic Genes (gènes de biosynthèse tardifs)
MES Acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique
MS Murashige et Skoog
NaAc Acétate de sodium
NASC Nottingham Arabidopsis Stock Center
NLS Nuclear Localization Signal (signal de localisation nucléaire)
NOS Nopaline Synthase
NptII Néomycine Phosphotransférase II
ON Over Night (~ 16h)
ONPG O-Nitrophényl β-D-Galactopyranoside
ORF Open Reading Frame (cadre de lecture ouverte)
PAs Proanthocyanidines
PCR Polymerase Chain Reaction (réaction de polymérisation en chaîne)
PEG Polyéthylène Glycol
Pfu Pyrococcus furiosus
PB Pinot Blanc
PG Pinot Gris
PIC Preinitiation Complex (complexe de pré-initiation)
4
PMSF Phénylméthylsulphonyl Fluoride
PN Pinot Noir
PVPP Polyvinylpolypyrrolidone
RB « Right Border » (bordure droite d’un ADN-T)
RE Réticulum Endoplasmique
RNase Ribonucléase
RNasin Ribonuclease Inhibitor
RT Reverse Transcription
SD Synthetic Dropout
SDS Dodécylsulfate de Sodium
Taq Thermophilus aquaticus
TBP TATA box Bin