Identification et rôle des mécanismes d'invasion cellulaire indépendants du T3SS-1 chez Salmonella Enteritidis, Identification and role of the T3SS-1 independant invasion mechanism in salmonella enteritidis

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Sous la direction de Philippe Velge, Agnès Wiedemann
Thèse soutenue le 10 février 2011: Tours
Le principal système d’invasion chez Salmonella requiert un système de sécrétion de type III(T3SS-1) qui induit un mécanisme d’entrée de type Trigger. Cependant, d’autres invasine sont été décrites chez Salmonella mais leurs rôles dans la virulence restent peu connus. Nous avons ainsi caractérisé le rôle de Rck en tant qu’invasine chez Salmonella Enteritidis, et démontré par différentes approches que Rck induit un mécanisme d’invasion de type Zipper.L'étude de la cascade de signalisation cellulaire induite par Rck a permis de suggérer un modèle d'internalisation impliquant l’actine, le complexe Arp2/3, les GTPases Rac et Cdc42,Akt, la PI3K de classe I et Src. L'analyse du pouvoir d'invasion d'un mutant de S. Enteritidis cultivé dans des conditions où il est incapable d'exprimer les facteurs d'invasion connus : T3SS-1, Rck et PagN montre l’existence d'autre facteurs d’entrée encore non identifiés chez Salmonella qui semblent induire une invasion de type Zipper et de type Trigger. L’ensemble de ces données font de Salmonella, la première bactérie capable d’envahir les cellules soit via un mécanisme de type Trigger, dépendant au moins du T3SS-1, soit via un mécanisme de type Zipper, dépendant au moins de Rck et révèlent la complexité des mécanismes d’invasion de Salmonella.
-Invasion de type Trigger
-Invasion de type Zipper
The main invasion system of Salmonella requires a type III secretion system (T3SS-1) which promotes a Trigger entry mechanism. However, other invasins were described in Salmonella but their roles in virulence remain unclear. We have shown that Salmonella Enteritidis caninvade cells via the Rck outer membrane protein and we have demonstrated by different approaches that Rck mediates a Zipper entry process. Characterisation of the cellular transduction pathway induced by Rck enable us to propose a model of internalisation involving actin, Arp2/3, Rac and Cdc42, Akt, class I PI3K and Src. Finally, the invasion ability of a S. Enteritidis mutant grown under culture conditions that did not allow the expression of any identified invasion factors (T3SS-1, Rck and PagN) provides evidences for still non-characterised Salmonella invasion factors which seem to induce both Zipper and Trigger mechanisms. Overall, our data indicate that Salmonella is the first bacterium found tobe able to invade cells by both a Trigger mechanism at least mediated by the T3SS-1 and a Zipper entry process at least mediated by Rck. Study of the T3SS-1-independent invasion systems could bring to a better understanding of Salmonella pathogenicity, particularly in regard to the different diseases induced by Salmonella and to its great diversity of hosts.
Source: http://www.theses.fr/2011TOUR4004/document
Publié le : lundi 31 octobre 2011
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UNIVERSITÉ FRANÇOIS - RABELAIS
DE TOURS


ÉCOLE DOCTORALE Santé, Sciences et Technologies
Unité INRA IASP 311 : « Signalisation, Portage et Virulence
bactérienne »

THÈSE présentée par :
Manon Rosselin

soutenue le : 10 Février 2011


pour obtenir le grade de : Docteur de l’université François - Rabelais
Discipline/ Spécialité : Sciences de la Vie et de la Santé

Identification et rôle des mécanismes
d’invasion cellulaire indépendants du T3SS-1
chez Salmonella Enteritidis


THÈSE dirigée par :
Mr Philippe Velge Directeur de Recherches, INRA, Tours

Co-encadrante :
Mlle Agnès Wiedemann Chargée de Recherches, INRA, Tours


RAPPORTEURS :
Mme Hélène Bierne Directeur de Recherches, Institut Pasteur, Paris
Mr Olivier Marchès Lecturer, Centre for Immunology and Infectious Disease,
Londres


JURY :
Mme Hélène Bierne Directeur de Recherches, Institut Pasteur, Paris
Mr Olivier Marchès Lecturer, Centre for Immunology and Infectious Disease, Londres
Mme Anne Blanc-Potard Chargée de Recherches, CNRS, Montpellier
Mme Agnès Rosenau Professeur des Universités, Université François Rabelais, Tours
Mr Philippe Velge Directeur de Recherches, INRA, Tours
A Mireille l’Abeille Remerciements
Tout d’abord, je tiens à remercier les personnes qui ont proposé ce sujet de thèse :
Philippe Velge et Agnès Wiedemann. Un grand merci pour votre encadrement et pour toutes
les connaissances que vous m’avez transmises. Je vous remercie aussi pour vos précieux
conseils lors de la rédaction de cette thèse. Philippe, j’ai beaucoup apprécié les discussions
scientifiques que j’ai pu avoir avec toi et j’espère avoir la chance durant mes futurs post-docs
d’avoir un « Grand Chef » aussi disponible que toi. Agnès, merci de m’avoir consacré autant
de temps techniquement et scientifiquement. J’ai gagné en organisation grâce à toi (même s’il
reste encore pas mal de travail…) et lors de mes futurs post-docs, je penserai à toi au moment
de planifier, quart d’heure par quart d’heure, chacune de mes manips!
Je tiens évidemment à remercier tous les autres membres de l’équipe SPVB : Elisabeth
Bottreau pour son aide lors des manips en cellulaire, sa patience et sa gentillesse ; Sylvie
Roche, pour son caractère de cochon que j’adore ; Isabelle Virlogeux-Payant pour sa
disponibilité, tous ses conseils et pour m’avoir motivée sans relâche en cette fin de thèse, aussi
bien pour la rédaction, la soutenance que pour l’avenir ; Pierrette Menanteau pour tous les
petits moments privilégiés et les conversations qu’on a pu avoir aux pauses cigarette ; Jérôme
Trotereau, pour sa bonne humeur, son aide psychologique et scientifique durant la rédaction
de ma thèse, et ses tournois de pétanque ! ; Olivier Grepinet, pour m’avoir accueillie dans sa
pièce bureau et pour son humour (non, chui pas un boulet !!!) ; et Anne-Marie pour son aide
en immuno, son calme et sa gentillesse.
Je remercie aussi Katia Tondellier et Véronique Legrand pour leur aide précieuse et
leur gentillesse ainsi que Tomasina Campone et Evelyne Desnoe pour leur disponibilité.
Je tiens à remercier chaleureusement les rapporteurs, Mme Hélène Bierne et Mr
Olivier Marchès ainsi que Mme Anne Blanc-Potard, examinatrice, et Mme Agnès Rosenau,
Présidente du Jury pour avoir accepté d’analyser mon travail et d’y avoir, pour cela, donné
de leur temps.
Une petite pensée à tous les étudiants M1 et M2 qui sont passés dans l’équipe, aussi
bien ceux qui ont contribué à l’étude sur Rck : Lily, Anais, Rémy ques les autres comme
Yannick et Dorian. Parmi tous ces étudiants, je voudrais octroyer une mention spéciale pour
Dayvid et son sens de l’humour et son humanité.
Naturellement, je remercie Fatemeh Namdari, Salim Bougarn, Nadia Abed, Cécile
Montreuil et Roseline Guibon pour leur amitié, leur soutien et tous les trips qu’on a pu avoir ensemble. Fâtmé, petit rayon de soleil, je suis tellement heureuse de t’avoir rencontrée. Merci
pour ta générosité, ta simplicité, ta bonne humeur, ton sens de l’écoute et toutes les
soirées (chansons ou déguisement) passées ensemble. Nadia, je ne te remercierai jamais assez
pour tous tes bons conseils. Chaque équipe de recherche devrait avoir une Nadia pour aider
les petits stagiaires, aussi bien scientifiquement que pour l’avenir !!! Mon chouchou, mon
confident, avec qui je vais danser le Zouk maintenant ???? Finies les soirées COTOREP !!!
J’ai peur de ne pouvoir retrouver quelqu’un comme toi dans ma vie et c’est bien dommage!
(D’un utre côté, ça veut aussi dire que je ne passerai plus 3h au rayon olive à Auchan, et que
je pourrais acheter des infusions Minceur sans que tout le monde me regarde… Finalement
c’est peut-être pas plus mal …). Cécile, la plus ancienne de mes amies Tourangelles ! Merci
pour ton soutien et tous les bons repas que tu as pu me préparer pendant la thèse (c’est sans
parler du nombre de crèpes ingérées à Budapest) ! J’espère que tu viendras me voir quand je
serai en post-doc et qu’on aura souvent l’occasion de se boire des petits cocktails (ça fait
mieux que whisky…) Rose, merci pour ton accueil ! Je te revois encore à la porte du bureau
avec ton café et ta blague à tabac quelques jours après mon arrivée à l’INRA… Un grand
merci pour avoir été là à chaque fois que j’en avais besoin durant ces trois années de thèse.
Je tiens évidemment à remercier tous mes amis du volley : Jojo, Sisi, Matitch, Gwenn,
Carole, ptit Guitou, Super Maximus, Viviane, Vincent Donnat, Vincent Virginie, Mickael,
Damien et les autres pour leur accueil, les coupes Volley et toute nos soirées. Je tiens
particulièrement à remercier Gwenn, ma coloc sosie de nana mouskouri, pour son hospitalité
et tout ce qu’elle m’apporte en cette période difficile (« si je peux me permettre »), Super
Maximus pour les tournois de volley et tout le vin gagné, sa no prise de tête et nos missions
nocturnes ainsi que Vincent –Virginie et son mode chiant pour nos fous rires, et en mémoire
du poteau téléphonique. Ptit Guitou, je t’ai mis la moyenne : j’t’ai mis Zéro !
Je voulais aussi remercier les autres thésards : Galliano (pour sa modestie et sa
perfection à toute épreuve), Benoit, Mario, Aurore, Zyneb et toutes les autres personnes qui
m’ont aidée à décompresser quand j’en avais besoin. Bien sûr, je remercie mes amies de
toujours : Louloute, Elodie, et Charline pour leur soutien plus ou moins lointain mais des plus
importants ! Je tiens aussi à remercier deux personnes qui m’ont largement inspirée durant
ma thèse : Simone Veil, contestataire par principe, et Miss Nationale 2011, une femme simple
et naturelle avant tout.
Un grand merci à ma famille : Maman, Thierry, Nènène, Foun, Papa, Françoise,
Emmanuelle et Emrys pour m’avoir soutenue pendant ma thèse. Je vous aime plus que tout et je ne vous remercierai jamais assez pour tout ce que vous m’apportez chaque jour. Je suis
arrivée là grâce à vous.
Enfin, une pensée spéciale à Miniboubi. Merci d’être resté à mes côtés tout ce temps,
de m’avoir écoutée et de m’avoir transmis toute ta force dans les moments difficiles.
Abréviations :
ADP : Adénosine Di-Phosphate
AHL : n-Acyl Homoserine Lactone
AI : Auto-Inducteur
Arp : Actin-Related Protein
ATP : Adénosine Tri-Phosphate
COMT : Centre Organisateur des MicroTubules
CRIB : Cdc42 and Rac Interactive Domain
EGF : Epidermal Growth Factor
EGFR : Epidermal Growth Factor Receptor
GAP : GTPase –Activating Protein
GDI : Guanine Dissocation Inhibitor
GDP : Guanosine Di-Phosphate
GEF : Guanine Exchange Factors
GTP : Guanosine Tri-Phosphate
Inl : Internaline
Inv : Invasine
LPS : LipoPolySaccharide
OMP : Outer Membrane Protein
Pag : PhoP-Activated Gene
PAK : p21 Activated Protein
PH : Pleckstrin Homology
PI : PhosphoInositide
PI3K : PhophoInositide-3 Kinase
PKB : Protéine Kinase B
Rck : Resistance to Complement Killing
RTK : Recepteur à Tyrosine Kinase
SCV : Salmonella-Containing Vacuole
SH : Src Homology
SPI : Salmonella Pathogenicity Island
T3SS : Type Three Secretion System
WASP : Wiskott-Aldrich Syndrome Protein
WAVE : WAsp-like VErprolin-homologous protein Résumé
Le principal système d’invasion chez Salmonella requiert un système de sécrétion de type III
(T3SS-1) qui induit un mécanisme d’entrée de type Trigger. Cependant, d’autres invasines ont
été décrites chez Salmonella mais leurs rôles dans la virulence restent peu connus. Nous avons
ainsi caractérisé le rôle de Rck en tant qu’invasine chez Salmonella Enteritidis, et démontré
par différentes approches que Rck induit un mécanisme d’invasion de type Zipper. L'étude de
la cascade de signalisation cellulaire induite par Rck a permis de suggérer un modèle
d'internalisation impliquant l’actine, le complexe Arp2/3, les GTPases Rac et Cdc42, Akt, la
PI3K de classe I, et Src. L'analyse du pouvoir d'invasion d'un mutant de S. Enteritidis cultivé
dans des conditions où il est incapable d'exprimer les facteurs d'invasion connus : T3SS-1, Rck
et PagN montre l’existence d'autre facteurs d’entrée encore non identifiés chez Salmonella qui
semblent induire une invasion de type Zipper et de type Trigger. L’ensemble de ces données
font de Salmonella, la première bactérie capable d’envahir les cellules soit via un mécanisme
de type Trigger, dépendant au moins du T3SS-1, soit via un mécanisme de type Zipper,
dépendant au moins de Rck et révèlent la complexité des mécanismes d’invasion de
Salmonella. L'étude de ces mécanismes pourrait permettre d'expliquer les différentes
pathologies induites par Salmonella ainsi que le spectre d'hôte des différents sérotypes.

Mots-clés : Salmonella, virulence, invasion, adhésion, signalisation cellulaire, Zipper, Trigger.

Abstract
The main invasion system of Salmonella requires a type III secretion system (T3SS-1) which
promotes a Trigger entry mechanism. However, other invasins were described in Salmonella
but their roles in virulence remain unclear. We have shown that Salmonella Enteritidis can
invade cells via the Rck outer membrane protein and we have demonstrated by different
approaches that Rck mediates a Zipper entry process. Characterisation of the cellular
transduction pathway induced by Rck enables us to propose a model of internalisation
involving actin, Arp2/3, Rac and Cdc42, Akt, class I PI3K and Src. Finally, the invasion
ability of a S. Enteritidis mutant grown under culture conditions that did not allow the
expression of any identified invasion factors (T3SS-1, Rck and PagN) provides evidences for
still non-characterised Salmonella invasion factors which seem to induce both Zipper and
Trigger mechanisms. Overall, our data indicate that Salmonella is the first bacterium found to
be able to invade cells by both a Trigger mechanism at least mediated by the T3SS-1 and a
Zipper entry process at least mediated by Rck. Study of the T3SS-1-independent invasion
systems could bring to a better understanding of Salmonella pathogenicity, particularly in
regard to the different diseases induced by Salmonella and to its great diversity of hosts.

Key words: Salmonella, virulence, invasion, adhesion, cell signaling pathway, Zipper, Trigger.
Table des matières
Objectifs de thèse 15
Introduction 17
I. Salmonella 18
1. Taxonomie et nomenclature 18
2. Habitats et spectres d’hôte 18
3. Caractères biochimiques et culturaux 19
II. Les salmonelloses 20
1. Les salmonelloses animales 20
1.1 Le portage asymptomatique 20
1.2. Les gastro-entérites 21
1.2.1. Pathologie 22
1.2.2. Traitement et prévention 22
1.3. Les infections systémiques ou fièvre typhoide 22
1.3.1. Pathologie 22
1.3.2. Traitement et prévention 23
2. Les salmonelloses végétales 25
III. Le génome de Salmonella 27
IV. Facteurs et mécanismes de virulence de Salmonella 29
1. Pathogénie 29
2. Le cycle infectieux de Salmonella 31
2.1. Les facteurs d’attachement aux cellules 33
2.1.1 Les fimbriae ou pili 33
- Les fimbriae de type 1 33
- Les longs fimbriae polaires (Lpf) 34
- Les fimbriae encodés par le plasmide de virulence (Pef) 34
- Les fimbriae fins agrégatifs (ou curli ou encore SEF17 chez S. Enteritidis) 34
- Les autres fimbriae 35
2.1.2. Les adhésines non fimbriaires 35
- Les adhésines autotransporteurs ShdA et MisL 37
- SiiE 37
2.1.3. Le LPS 39
2.1.4. Le flagelle 41 2.2. Les facteurs bactériens d’invasion cellulaire 43
2.2.1. Le T3SS-1 43
2.2.1.1. SPI-1 45
2.2.1.2. Régulation de l’expression de SPI-1 45
2.2.1.3. Structure et assemblage du T3SS-1 47
2.2.1.6 Rôle du T3SS-1 dans l’infection 55
2.2.2. PagN 57
2.2.3. Rck 57
2.2.4. Régulation des facteurs d’invasion cellulaire de Salmonella par les systèmes de quorum sensing.
61
2.3. Facteurs de virulence permettant la survie et la multiplication intracellulaire 65
2.3.1. Strucure du T3SS-2 65
2.3.2. Activité des effecteurs sécrétés par le T3SS-2 67
2.3.3. Comportement intracellulaire en fonction des cellules hôtes et devenir de la bactérie dans la
cellule 69
V. Les mécanismes de transduction du signal cellulaire à partir d'un récepteur
membranaire 72
1. Notion de transduction d’un signal 72
2. Les récepteurs membranaires. 72
2.1. Les récepteurs à tyrosine kinases (RTKs) 72
2.2. Les récepteurs à 7 segments transmembranaires 74
2.3. Les intégrines 76
3 Les protéines tyrosine kinase de la famille Src 76
4. La voie PI3K (phosphoinositide 3-kinase) / Akt 78
4.1. Les PI3Ks 78
4.2. Akt 80
5. Les Rho GTPases 82
5.1. Cycle d’activation des Rho GTPases 82
5.2. Rôle des Rho GTPases dans la régulation du cytosquelette d’actine 84
6. La nucléation de l’actine suite à l’activation du complexe Arp2/3 par les protéines de la famille
WASP 86
6.1. Structure des filaments d’actine 86
6.2. Dynamique des filaments d’actine 86
6.3. Le complexe Arp2/3, nucléateur d’actine 88
6.4. Les protéines de la famille WASP et WAVE 88

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