Impact d'un inhibiteur de protéases à sérine, le TFPI-2, sur le microenvironnement tumoral pulmonaire, Impact of a serine proteinase inhibitor expression, TFPI-2 (Tissue Factor Pathway Inhibtor-2 on the tumoral pulmonary microenvironment

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Sous la direction de Pascale Reverdiau, Sophie Iochmann
Thèse soutenue le 11 février 2009: Tours
Le TFPI-2 (Tissue factor pathway inhibitor 2 est un inhibiteur de la plasmine qui peut limiter la génération de métalloprotéases (MMP) et réduire ainsi le potentiel invasif des cellules tumorales, essentiel à la formation de métastases. Deux clones cellulaires inactivés pour le TFPI-2 par une stratégie d’ARN interférence ont été réalisés (miRNA-1b et -2b). Ces clones ont un pourcentage de migration et d’invasion 2 à 3 fois supérieur au clone contrôle, associé à une plus grande adhérence à la laminine et au collagène IV et à une augmentation de l’expression des MMP-1 et –3. En cocultures directes avec des fibroblastes pulmonaires sains, une augmentation des MMP-3, -7 et–13 a été observée avec les clones miRNA-1b et -2b. En présence des milieux conditionnés des ces clones, une potentialisation de la surexpression des MMP-1, -3, -7 a été observée. Cette étude nous a permis de démontrer que le TFPI-2 a un impact sur les gènes impliqués dans le remodelage de la MEC, notamment lors des interactions entre les cellules tumorales et les cellules stromales.
-Tfpi-2
TFPI-2 (Tissue factor pathway inhibitor-2), an inhibitor of serine proteinases, particularly plasmin, can indirectly regulate the activation of MMPs, thus regulating ECM degradation and tumour cell invasion. Our results demonstrated that TFPI-2 silencing was associated with a 2 and 3-fold increase in invasive ability through basement membrane components, for clones NCI-H460 miRNA-1b and -2 respectively, associated with an increased in the relative attachment towards laminin and collagen IV and MMP-1 and MMP–3 overexpression. In direct coculture with fibroblasts, an increase in MMP-3, -7 and -13 transcriptional expression was observed when CCD19-Lu cells were cocultured with both miRNA-1b or -2b clones. In indirect coculture, allowing contact between fibroblasts and NCI-H460 clones conditioned media, an increase in MMP-1, -3 and -7 fibroblastic expression was measured. This study has demonstrated that TFPI-2 can influence ECM remodelling-associated genes and then act as a pericellular proteolysis inhibitor, particularly at the tumour-stroma interface.
Source: http://www.theses.fr/2009TOUR4007/document
Publié le : jeudi 27 octobre 2011
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UNIVERSITÉ FRANÇOIS - RABELAIS
DE TOURS


ÉCOLE DOCTORALE : Santé, Sciences, Technologies
INSERM U618 : Protéases et Vectorisation Pulmonaires
Equipe 3 : Aérosols et Cancer Bronchopulmonaire

THÈSE présentée par :
Guillaume GAUD

Soutenue le : 11 Février 2009


Pour obtenir le grade de : Docteur de l’Université François - Rabelais
Discipline : Sciences de la Vie et de la Santé


Impact de l’expression d’un inhibiteur de
protéases à sérine, le TFPI-2, sur le
microenvironnement tumoral pulmonaire


THÈSE dirigée par :
Mme Pascale Reverdiau Professeur, Université François Rabelais de Tours
Co-encadrement par :
Mlle Sophie Iochmann Maître de conférences, Université François Rabelais de Tours

RAPPORTEURS :
Mme Valérie Trichet Maître de conférences, Université de Nantes
Mr Vincent Lagente Professeur, Université de Rennes


JURY :
Mr Philipe Birembaut Professeur, Université de Reims
Mr Francis Gauthier Professeur, Université François Rabelais de Tours
Mlle Sophie Iochmann Maître de conférences, Université François Rabelais de Tours
Mr Vincent Lagente Professeur, Université de Rennes
Mme Pascale Reverdiau Professeur, Université François Rabelais de Tours
Mme Valérie Trichet Maître de conférences, Université de Nantes























2
REMERCIEMENTS
Ce travail a été réalisé au sein de l’unité INSERM U618 dirigée par le Professeur Francis
GAUTHIER et ce doctorat a pu être effectué grâce au soutien financier de la Région Centre.
J’exprime mes sincères remerciements au Professeur Yves Gruel pour m’avoir accueilli au
sein de son équipe

Je tiens à exprimer ma reconnaissance au Professeur Pascale REVERDIAU et au Docteur
Sophie IOCHMANN pour avoir encadré mes premiers pas dans la recherche. Votre rigueur,
votre curiosité scientifique et votre esprit critique m’ont beaucoup appris. Je tiens à vous
remercier tout particulièrement pour votre disponibilité lors de ces longs mois de rédaction où
vous avez été présentes à chaque étape pour me diriger dans cet exercice.

J’adresse mes plus sincères remerciements aux membres du jury :
- le Professeur Francis GAUTHIER qui m’a accueilli dans l’unité U618 et a accepté
de faire partie de mon jury,
- le Professeur Vincent LAGENTE et le Docteur Valérie TRICHET qui me font
l’honneur d’être les rapporteurs de ma thèse,
- le Professeur Philippe BIREMBAUT qui a accepté de juger cette thèse.

Merci à l’équipe d’enseignants en Biochimie qui m’a guidé lors de mes trois années de
monitorat : Les Professeurs Francis Gauthier et Fréderic ESNARD, Les Docteurs Fabien
LECAILLE, Michelle FERRER, Sylvie ATTUCCI et Lydie NADAL-DESEBARATS les
Docteurs Emanuel GODAT et Marina SHKRELI.

Merci aux étudiants de la promotion 2005-2008 : Kevin « Keuvin » BARANGER, l’homme
à qui il ne faut pas laisser une raquette entre les mains ; Alexandre « gromoute »
GAUTHIER, l’homme qui a inventé le poker ; et à Agnès « bouclettes » MAILLET, la
femme qui murmurait à l’oreille des souris nude. Merci également à Florian « flo »
VEILLARD, le seul homme au monde capable de manger son poids en saucisson.

Merci également à Nathalie HEUZE-VOURC’H pour ses conseils scientifiques et sa bonne
humeur perpétuelle. Par contre, je ne te remercie pas pour tes revers dévastateurs au squash...

Un grand merci au Docteur Benjamin BRILLET, à Stéphanie PETIOT et à Pierre
LAPAQUETTE pour leur participation à ce travail.
3
Merci aux « nouveaux » arrivants : Gwen, Clément, Annabelle, Noémie ; et à tous les
membres de l’unité 618.

Un immense merci à tous mes amis tourangeaux : Anne-Marie, Redot, Marina, Yo, Caro,
Flo, Julien, Greg, Amandine, Valérie ; et aux autres amis éparpillés dans le pays et de part
le monde : Aurelien, Romain, Clem, Aurelie, Zabou, Matthieu, Tonio, Martin, Yann,
Mad, oingh, Mat et les autres. Merci pour votre présence, votre humour et les vacances et
week-end passés ensemble.

Merci à Julien Fauvel, complice pendant toutes mes années universitaires et sans qui je n’en
serais peut être pas arrivé là.

Un grand merci à toute ma famille et particulièrement à mes parents, mon frère, Matthieu, et
ma belle sœur, Cécile. Votre patience et votre soutien inconditionnel ont été primordial dans
l’accomplissement de ce travail.

Un grand merci à Catherine et Jonathan TOWNER pour les bons moments passés
ensemble et ceux à venir.

Un remerciement particulier à Anne ETIENNE et Luis RODRIGUEZ, pour leur soutien et
leur chaleur.

Enfin mes derniers mots vont vers ma complice depuis tant d’années, Marianne. Tu es
certainement la plus méritante pour avoir réussi à me supporter quotidiennement pendant ces
trois années et particulièrement pendant ces derniers mois de rédaction. Une page se tourne et
nous en écrirons de nouvelles, ensemble, à l’étranger…
4
RESUME

La progression tumorale est un processus multi-étapes dépendant notamment des
interactions entre les cellules cancéreuses et le stroma environnant. Le développement du
cancer broncho-pulmonaire, première cause de mortalité par cancer chez l'homme, implique
ainsi le dialogue entre les cellules tumorales et les cellules fibroblastiques, composant
cellulaire prépondérant du microenvironnement pulmonaire. Pour former ces métastases à
distance de la tumeur primitive, les cellules tumorales pulmonaires vont franchir de
nombreuses barrières cellulaires et matricielles, notamment grâce à la plasmine et à des
métalloprotéases (MMP). Le TFPI-2 (Tissue factor pathway inhibitor 2), maintenant
considéré comme un gène suppresseur de tumeur, est un inhibiteur de la plasmine qui peut
limiter la génération de MMP et réduire ainsi le potentiel invasif des cellules tumorales. Le
laboratoire avait préalablement montré qu’une diminution de l’expression de cet inhibiteur de
protéases, associée à une hyperméthylation de son promoteur, était fréquemment observée
dans les stades les plus avancés de cancer broncho-pulmonaire. Cependant les conséquences
de cette répression transcriptionnelle du TFPI-2 dans le microenvironnement tumoral
pulmonaire restent encore mal connues.
Dans le but d’étudier ces mécanismes, une stratégie d’ARN interférence basée sur des
micro RNA (miRNA) a été développée afin d’inactiver stablement et de façon spécifique le
TFPI-2. Deux clones cellulaires pour lesquels l’inactivation du transcrit du TFPI-2 était
supérieure à 90% ont été sélectionnés (miRNA-1b et –2b). Avec les clones cellulaires
miRNA-1b et -2b, un pourcentage de migration et d’invasion 2 à 3 fois supérieur a été
observé par rapport au clone miRNA-Nég. Ces résultats sont associés à une plus grande
adhérence des cellules aux différentes protéines de la matrice extracellulaire et notamment à
la laminine et au collagène IV et à une augmentation de l’expression des MMP-1 et –3.
Deux modèles de coculture, mettant en jeu des fibroblastes pulmonaires sains (CCD-
19-Lu) et les clones de cellules tumorales inactivées pour le TFPI-2 ont été développés. Ainsi
en cocultures directes qui impliquent des contacts entre les deux types cellulaires et
permettent l’étude de signaux membranaires, une augmentation des MMP-3, -7 et–13 a été
observée avec les cellules tumorales inactivées pour le TFPI-2. En présence de milieux
conditionnés, sources de formes protéiques solubles produites par les cellules tumorales, une
potentialisation de l’expression transcriptionnelle et protéique des MMP-1, -3, -7 a également
été montrée lorsque l’expression du TFPI-2 par les cellules tumorales a été inhibée.
Cette étude nous a permis de démontrer que le TFPI-2 a un impact sur les gènes
impliqués dans le remodelage de la MEC et pourrait jouer un rôle inhibiteur de la protéolyse
péricellulaire notamment lors des interactions entre les cellules tumorales et les cellules
stromales.

Mots clés : cancer, microenvironnement, TFPI-2, MMP, ARN interférence, miRNA
5
RÉSUMÉ EN ANGLAIS

Tumour progression is a complex multistep process that depends on an evolving
crosstalk between cancer cells and the surrounding stromal tissue. The invasion process
involves extracellular matrix (ECM)-degrading proteases, including matrix metalloproteinases
(MMPs) that have been shown to be highly expressed and activated in the tumour
microenvironment. TFPI-2 (Tissue factor pathway inhibitor-2), an inhibitor of serine
proteinases, particularly plasmin, can indirectly regulate the activation of MMPs, thus
regulating ECM degradation and tumour cell invasion. In agreement with these studies, we
have demonstrated that decreased TFPI-2 gene expression and hypermethylation are
frequently associated with advanced stages of non-small cell lung cancer (NSCLC),
particularly with lymph node invasion. The consequences of TFPI-2 downregulation on MMP
expression by both tumoral and stromal cells remain unclear and could play a key role in
controlling tumour invasion by modifying the balance between ECM degrading proteases and
their inhibitors in the microenvironment.
Here, we showed that TFPI-2 transcripts can be significantly decreased in the NCI-
H460 human non-small cell lung cancer cell line using the artificial microRNA technology.
Consistent with the mRNA degradation, we observed a strong decrease of TFPI-2 protein by
both Western blotting and immunofluorescence assay, in two of the produced clones, named
NCI-H460 miRNA-1b and NCI-H460 miRNA-2b.
Our results demonstrated that TFPI-2 silencing was associated with a 2 and 3-fold
increase in invasive ability through basement membrane components, for clones NCI-H460
miRNA-1b and -2 respectively. Our experiments showed that down-regulation of TFPI-2
significantly increased the relative attachment of miRNA clone cells towards extracellular
matrix proteins, particularly for laminin and collagen IV. Moreover, the invasive behaviour of
NCI-H460 cells silenced for TFPI-2 was associated with increased MMP-1 and MMP–3
expression.
In direct coculture, allowing cell-cell contact, an increase in MMP-3, -7 and -13
transcriptional expression was observed when CCD19-Lu cells were cocultured with NCI-
H460 clones inhibited for TFPI-2. In indirect coculture, allowing contact between fibroblasts
and NCI-H460 clones conditioned media, an increase in MMP-1, -3 and -7 expression was
measured, for both transcript and protein, when CCD19-Lu were cocultured with NCI-H460
miRNA-1b and -2b conditioned medium.
This study has demonstrated that TFPI-2 can influence ECM remodelling-associated
genes and then act as a pericellular proteolysis inhibitor, particularly at the tumour-stroma
interface.

Key words : cancer, microenvironment, TFPI-2, MMPs, ARN interference, miRNA.

6
SOMMAIRE

Remerciements 3
Résumé 5
Résumé en anglais 6
Sommaire 7
Liste des tableaux 15
Liste des figures 16
Liste des annexes 19
Abbréviations 20
Introduction générale 23

INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE 24

CHAPITRE 1 : LES DIFFERENTS CONSTITUANTS DU MICROENVIRONNEMENT
TUMORAL
A- LES CELLULES DU MICROENVIRONNEMENT TUMORAL 25
I- Les cellules tumorales 25
I-1. Caractéristiques générales de la cellule tumorale 25
« » « »I-2. Les théories de l’expansion clonale et des cellules souches tumorales 26
I-3. Les cellules tumorales pulmonaires 28
I-3.1. Origine des cellules tumorales pulmonaires 28
I-3.2. Tabac et cancer broncho-pulmonaire 29
I-3.3. Les cancers broncho-pulmonaires 30
I-3.3.1. Classification des cancers broncho-pulmonaires 30
I-3.3.2. Les différents types histologiques de cancers broncho-pulmonaires 31
II – Les cellules fibroblastiques 33
II-1. Origine et caractéristiques des cellules fibroblastiques 33
II-2. Les cellules fibroblastiques associées à la tumeur 33
III – Les cellules vasculaires 34
III-1. La vascularisation de la tumeur 34
III-2. Les cellules endothéliales 35
III-2.1. Les cellules endothéliales des vaisseaux pulmonaires sains 35
III-2.2. Les cellules endothéliales des néo-vaisseaux 36
III-3. Les péricytes 37
IV – Les cellules de l’inflammation et de l’immunité 37
IV-1. Les macrophages 38
IV-2. Les cellules dendritiques 40
IV-3. Les polynucléaires neutrophiles 41
7
IV-4. Les lymphocytes 41
IV-5. Les autres cellules 42
B- LA MATRICE EXTRACELLULAIRE ET LA MEMBRANE BASALE 42
I – Les principales protéines de MEC pulmonaire 42
I-1. Le collagène 43
I-2. La fibronectine 43
I-3. L’élastine 44
I-4. Les glycosaminoglycanes et les protéoglycanes 44
I-5. La vitronectine 44
II- La membrane basale 45
II-1. Les laminines 46
II-2. Le collagène de type IV 46
II-3. Entactine et perlecan 46
III – Les modifications de la MB et la MEC dans la tumeur 47
III-1. Remodelage de la MB dans les tissus tumoraux 47
III-2. Remodelage de la MEC dans les tissus tumoraux 47
C- LES PRINCIPALES PROTEASES DU STROMA TUMORAL 48
I - Les protéases à sérine 49
I-1. Le système de la plasmine 50
I-1.1. Activation du plasminogène en plasmine 50
I-1.2. Fonctions de la plasmine 51
I-1.3. Régulation de la plasmine 51
I-1.3.1. Par les serpines 51
I-1.3.2. Par le TFPI-2 52
I-2. Les kallicréines tissulaires 60
I-2.1. Localisation génomique 60
I-2.2. Expression tissulaire et cellulaire des kallicréines 60
I-2.3. Kallicréines tissulaires et cellules cancéreuses 60
I-2.4. Structure des kallicréines tissulaires 61
I-2.5. Rôle physiologique des kallicréines tissulaires 62
I-2.6. Régulation de l’activité des kallicréines 63
I-3. L’élastase leucocytaire, la protéase 3 et la cathepsine G 63
I-3.1. Origine cellulaire 63
I-3.2. Fonctions biologiques 63
I-3.3. Protéases des polynucléaires neutrophiles et des cellules cancéreuses 64
I-3.4. Régulation des protéases des polynucléaires neutrophiles 64
II – Les cathepsines à cystéine 65
II-1. Caractéristiques générales et localisation cellulaire des cathepsines à cystéine 65
II-2. Cathepsines à cystéine et cellules cancéreuses 66
II-3. Structure et activation des cathepsines à cystéine 68
8
II-4. Fonctions des cathepsines à cystéine 68
II-5. Inhibition de l’activité des cathepsines à cystéine 69
III – Les protéases acides 69
III-1. Localisation génomique et expression cellulaire de la cathepsine D 69
III-2. Cathepsines D et cellules cancéreuses 69
III-3. Structure de la cathepsine D 70
III-4. Rôle physiologique de la cathepsine D 70
III-5. Régulation de l’activité de la cathepsine D 70
IV - Les métalloprotéases matricielles 70
IV-1. Structure et classification des MMP 70
IV-1.1. Les collagénases 72
IV-1.2. Les gélatinases 74
IV-1.3. Les stromélysines 74
IV-1.4. Les matrilysines 75
IV-1.5. Les MMP membranaires 75
IV-1.6. MMP hétérogènes 76
IV-1.7. Substrats des MMP 76
IV-2. Origine cellulaire des MMP 77
IV-3. Régulation des MMP 78
IV-3.1. Régulation transcriptionnelle des MMP 78
IV-3.2. Stabilité des ARNm 80
IV-3.3. Activation des zymogènes en forme active 80
IV-3.4. Activation des MMP au sein du microenvironnement 82
IV-3.5. Inactivation des MMP 83
IV-3.5.1. Les TIMP 84
IV-3.5.2. RECK 85
IV-3.5.3. Inhibiteurs majorant la clairance des MMP 85

CHAPITRE 2 : REGULATION DU TFPI-2 ET DES METALLOPROTEASES DU
MICROENVIRONNEMENT : IMPACT SUR LES DIFFERENTES ETAPES DU
DEVELOPPEMENT TUMORAL
A- INITIATION ET PROLIFERATION CLONALE 88
I – Altérations génétiques et épigénétiques 88
I-1. Altérations de l’information génétique dans le cancer 88
I-1.1. Altérations génétiques dans les cellules tumorales 88
I-1.2. Microenvironnement et altérations génétiques 89
I-2. Modifications épigénétiques dans le cancer 91
I-2.1. Méthylation de l’ADN et déacetylation des histones 91
I-2.2. Un variant d’épissage du TFPI-2 93
I-2.3. Régulation par microRNA endogènes 93
9
II – Modifications du cycle cellulaire et immortalité des cellules tumorales 93
II-1. Les deux voies d’activation de l’apoptose 94
II-2. Le TFPI-2, un facteur pro-apoptotique 95
III-3. Les métalloprotéases, des facteurs anti-apoptotiques 96
B-ANGIOGENESE TUMORALE 97
I – Les mécanismes de l’angiogenèse 98
II- Les protéases activatrice de l’angiogenèse 99
II-1. MMP et angiogenèse 99
II-2. Cathepsines, kallicréines et angiogenèse 100
III- Les inhibiteurs de l’angiogenèse 101
III-1. Les métalloprotéases peuvent exercer une action anti-angiogénique 101
III-2. Les protéases peuvent générer des peptides à activité anti-angiogéniques 101
III-3. Activité anti-angiogénique du TFPI-2 102
C- INVASION TUMORALE 102
I- Les différents modes de migration cellulaire 102
II – La transition épithélio-mésenchymateuse 104
II-1. Les facteurs stimulant la TEM 104
II-2. Caractéristiques générales de la TEM 106
III- Les interactions entre les cellules tumorales et le microenvironnement stimulent
l’invasion tumorale 107
III-1. Les modifications structurelles de la MEC influencent l’invasion cellulaire 107
III-2. Les matricryptines stimulent l’invasion tumorale via l’induction de l’expression
de MMP par le stroma tumoral 108
III-3. Les interactions entre les cellules du stroma tumoral stimulent l’expression
de MMP et le potentiel invasif des cellules tumorales 110
III-3.1 Surexpression des MMP par les fibroblastes du stroma 110
III-3.2. Surexpression des MMP par les cellules de l’inflammation 110
III-3.3. Implication de l’EMMPRIN dans les interactions entre les cellules du stroma
et l’invasion tumorale 111
IV- Le TFPI-2 inhibe l’invasion tumorale 111
D- DISSEMINATION METASTATIQUE 112
I – Passage des cellules tumorales dans le système vasculaire : l’intravasation 114
II– Mécanismes de résistance des cellules tumorales dans le sang 115
III – Adhérence à la paroi luminale et extravasion 116
IV – Ciblage des foyers secondaires 118
V – La colonisation et l’adaptation au nouveau microenvironnement 119
V-1. La dormance tumorale 120
V-2. La formation de niches pré-métastatiques 121
VI-TFPI-2, MMP et foyers métastatiques 122


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