Influence of various coeffectors on differential carbon catabolite regulation exerted by CcpA [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Nicola Horstmann

De
Influence of various coeffectors on differential carbon catabolite regulation exerted by CcpA Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades vorgelegt von Nicola Horstmann aus Erlangen Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 28.09.2006 Vorsitzender der Prüfungskommission: Prof. Dr. D.-P. Häder Erstberichterstatter: Prof. Dr. W. Hillen Zweitberichterstatter: H. Sticht Danke … Zunächst möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Wolfgang Hillen für sein Interesse an dieser Arbeit, seine Unterstützung und Ratschläge, die Möglichkeit, eigene Ideen einzubringen und die hervorragenden Arbeitsbedingungen an seinem Lehrstuhl bedanken. Herrn Prof. Dr. Heinrich Sticht danke ich für die freundliche Übernahme des Zweitgutachtens. Herrn Prof. Dr. Sticht und Wolfgang Müller danke ich zudem für ihre bioinformatischen Arbeiten zur Vorhersage neuer Wechselwirkungspartner für HPr-Ser46-P, aus denen das RbsR Projekt entstanden ist sowie für die hervorragende Zusammenarbeit. Allen jetzigen und früheren Mitgliedern des Lehrstuhls für Mikrobiologie danke ich für die nette Arbeitsatmosphäre, die gute Stimmung und etliche hilfreiche Tipps.
Publié le : dimanche 1 janvier 2006
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Influence of various coeffectors on differential carbon
catabolite regulation exerted by CcpA







Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades









vorgelegt von

Nicola Horstmann

aus Erlangen







Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der
Universität Erlangen-Nürnberg


























Tag der mündlichen Prüfung: 28.09.2006

Vorsitzender der Prüfungskommission: Prof. Dr. D.-P. Häder
Erstberichterstatter: Prof. Dr. W. Hillen
Zweitberichterstatter: H. Sticht


Danke …


Zunächst möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Wolfgang Hillen für sein Interesse an dieser
Arbeit, seine Unterstützung und Ratschläge, die Möglichkeit, eigene Ideen einzubringen
und die hervorragenden Arbeitsbedingungen an seinem Lehrstuhl bedanken.

Herrn Prof. Dr. Heinrich Sticht danke ich für die freundliche Übernahme des
Zweitgutachtens.

Herrn Prof. Dr. Sticht und Wolfgang Müller danke ich zudem für ihre bioinformatischen
Arbeiten zur Vorhersage neuer Wechselwirkungspartner für HPr-Ser46-P, aus denen das
RbsR Projekt entstanden ist sowie für die hervorragende Zusammenarbeit.

Allen jetzigen und früheren Mitgliedern des Lehrstuhls für Mikrobiologie danke ich für die
nette Arbeitsatmosphäre, die gute Stimmung und etliche hilfreiche Tipps.
Mein Dank gilt insbesondere den Mitgliedern der Bacillus gruppe: Marco Diel, Gerald
Seidel, Susanne Glagla, Mareen Sprehe, Alex Wolf, Jessi Haag, Robert Düring und Na
Cong. Marco und Gerald danke ich für die gute Einarbeitung, Gerald zudem für seine
Einführung in die Biacoretechnik, ein erfolgreiches gemeinsames Projekt und viele
Diskussionen. Mareen danke ich für die Laborgemeinschaft und so manch unglaubliche
Geschichte, Susanne für ihre Freundschaft und dass ich mit den unzähligen Schulklassen
nicht allein war. Na Cong danke ich für ihre Beiträge während ihres F2/F3 Praktikums, für
leckeres chinesisches Essen und, dass ich jetzt bestens über China bescheid weiß.

Bei allen Verantwortlichen, v. a. den Computerspezialisten, bedanke ich mich für ihre
schnelle Hilfe sowie bei Eva und Gerald für ihre Hilfe bei Chromatographenreparaturen.

Den Running Microbes Lars, Didi und Klaus danke ich für sportliche Motivation und ihre
Begleitung beim “Spaziergang” durch die Fränkische Schweiz.

Danke auch an Herrn Dr. Rösch, den Sekretärinnen Frau Prell und Frau Wehr für die
hervorragende Organisation des Lehrstuhls und an Markus Müller, der immer zur Stelle
war, wenn wir mal wieder etwas kaputt gemacht haben. Bei Manuela Hanuschik und
Hildegard Stork bedanke ich mich für die enorme Arbeitserleicherung durch ihre
Spüldienste bzw. die Herstellung unzähliger Platten und Medien.

Meinen Eltern und Barbara & Philipp danke ich für ihre persönliche Unterstützung und der
kleinen Johanna für stärkende Knuddeleinheiten.Abbreviation index


Amp Ampicillin Dimensions
APSAmmonium persulphate 3k kilo (10 )
ATP Adenosine triphosphate -3m mili (10 )
A Absorbion at λ = x nm x -6µ micro (10 )
B. Bacillus -9n nano (10 )
bp base pairs -12p pico (10 )
BSA bovine serum albumin
CAA casamino acids

CCR carbon catabolite regulation
Units Cm Chloramphenicol
°C degree Celsius DMSO dimethylsulfoxide
DNA Desoxyribonucleic acid Da Dalton
DNase Desoxyribonuclease g gram
dNTP Desoxyribonucleotide h hour
DTT dithiothreitol l liter
E. Escherichia m mete
EDTA Ethylendiamin tetraacetate M Molar
Erm Erythromycin min minute
EtOH Ethanol s second
EtBr Ethidium bromide U unit
FBP fructose 1,6-bisphosphat V volt
Fig figure W watt
GFP green fluorescent protein
Glc-6-P glucose 6-phosphate
IPTG Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside
Kan Kanamycin
LB Luria Broth
NTA Nitrilotetraacidic acid
OD Optical density λ = x nm x
ONPG o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranoside
PAA polyacrylamide
PAGE Polyacrylamid gel electrophoresis
PCR polymerase chain reaction
rpm revolutions per minute
RT room temperature
SDS sodium dodecylsulfate
Tab. Table
Tc Tetracycline
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
% v/v % (volume/volume)
% w/v % (weight/volume)
wt wild type
x-Gal 5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid





Abbreviation index


Amino acid nomenclature (IUPAC-IUB, 1969)
A Ala Alanine M Met Methionine
C Cys Cysteine N Asn Asparagine
D Asp Aspartate P Pro Proline
EGlu Glutamate Q Gln Glutamine
F Phe Phenylalanin R Arg Arginine
G Gly Glycine S Ser Serine
H His Histidine T Thr Threonine
I Ile Isoleucine V Val Valine
K LysLysine W Trp Tryptophan
L Leu Leucine Y Thy Thyrosine




Nucleotides
A Adenosine
C Cytosine
G Guanosin
T Thymidine
N A, C, G or T





Index I

Index

1 1 Zusammenfassung/Summary

3 2 Introduction

2.1 Regulation of gene expression in response to changing 3
conditions

2.2 The PTS: compounds and functions 4

2.3 CCR in B. subtilis and other gram-positive bacteria with low 5
GC content

2.4 The structure of the CcpA-HPr-Ser46-P-cre complex 6

2.5 The allosteric switch mechanism 8

2.6 HPr-Ser-P and Crh-Ser46-P act differently in CcpA 9
dependent CCR

2.7 CcpA dependent CCR: a global mechanism of gene regulation 10

2.8 Differential regulation of various promoters and possible 11
regulatory mechanisms

2.9 Scope of the thesis 13

14 3 Materials and methods

3.1 Materials 14

3.1.1 Chemicals 14
3.1.2 Instruments 15
3.1.3 Commercially available systems („kits“) 16
3.1.4 Auxiliary materials 16
3.1.5 Proteins and enzymes 16
3.1.6 Oligonucleotides 17
3.1.7 Plasmids 19
3.1.8 Bacterial strains 20

3.2 Media and buffers 21

3.2.1 Media 21
3.2.2 Buffers 22

3.3 Methods 24

3.3.1 General methods 24
3.3.2 Cloning 24 Index II

3.3.2.1 General polymerase chain reaction (PCR) 24
3.3.2.2 Colony PCR 24
3.3.2.3 DNA assembling 24
3.3.2.4 T7 Endonuclease I treatment 25
3.3.2.5 Restriction 25
3.3.2.6 Vector dephosphorylation 25
3.3.2.7 Ligation 25
3.3.2.8 Transformation of E. coli 25
3.3.3 In vivo characterization in B. subtilis 25
3.3.3.1 Preparation of naturally competent B. subtilis strains 25
3.3.3.2 Transformation of B. subtilis 25
3.3.3.3 Western blotting 26
3.3.3.4 Detection of α-amylase activity 26
3.3.3.5 Determination of ß-galactosidase activities 26
3.3.4 Growth of bacteria and protein overexpression 27
3.3.4.1 Growth of bacteria and protein overexpression 27
3.3.4.2 Cell disruption 27
3.3.4.3 Overexpression- and heat stability tests 27
3.3.5 Protein biochemistry 27
3.3.5.1 Preparation of kinase extract 27
3.3.5.2 Purification of HPr and Crh 27
3.3.5.3 Purification of CcpA(His) 28 6
3.3.5.4n of RbsR(His) 28 6
3.3.5.5 Storage and dialysis of proteins 28
3.3.5.6 Hybridization of DNA: 28
3.3.5.7 Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) 28
3.3.5.8 Surface plasmon resonance spectroscopy (SPR) 29

30 4 Results

4.1 Improving cloning of ccpA mutants in E. coli 30

4.1.1 Cloning of pWH143 and pWH144 30
4.1.2 Characterization of pWH143 and pWH144 in E. coli 31
4.1.3 WB. subtilis 32

4.2 Bridging of N-terminal core domains in CcpA accounts for 34
differential regulation

4.2.1 Site-directed mutagenesis of ccpA 34
4.2.2 Quantification of CCR of different promoters 34

4.3 Establishing a novel screening system for differential 38
regulating CcpA mutants
Index III

4.4 The HPrH15-CcpAD297 contact specifies the stimulatory 41
effect of glycolytic intermediates

4.4.1 Selection and mutagenesis of suitable residues 41
4.4.2 Overproduction and purification of HPr/Crh mutants 42
4.4.3 Analysis of CcpA binding 43
4.4.4 Mutation of CcpA residue 297 does not affect the affinity to 44
HPr-Ser46-P or Crh-Ser46-P
4.4.5 Analysis of FBP and Glc-6-P stimulation of CcpA-coeffector 45
interaction
4.4.6 Analysis of xylA cre binding 48
4.4.7 In vivo contribution of glycolytic intermediates to CCR in B. 51
subtilis

4.5 RbsR represents a novel interaction partner for HPr-Ser46-P 55

4.5.1 Overexpression and purification of RbsR 55
4.5.2 Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) 58
4.5.3 Regulation of the ribose transport operon in vivo 58

63 5 Discussion

5.1 A screening system for random mutagenesis of ccpA 63

5.2 Bridging of N-terminal core domains in CcpA accounts for 65
differential regulation

5.3 The HPrH15-CcpAD297 contact specifies the stimulatory 67
effect of glycolytic intermediates

5.4 RbsR represents a novel interaction partner for HPr-Ser46-P 70

73 6 References

83 7 Appendix

7.1 Quest for specific effectors for CcpA-Crh-Ser46-P interaction 83

7.2 Importance of residue R325 in CcpA for coeffector binding 83

7.3 Sequence of the synthetic ptsH1 gene 84



Zusammenfassung/Summary 1

1 Zusammenfassung


Als globaler Transkriptionsregulator steuert das Katabolit-Kontroll Protein A
(CcpA) in Gram-positiven Bakterien mit niedrigem GC-Gehalt die Expression von ca. 300
Genen, die vorwiegend in den Kohlenstoff Katabolismus involviert sind. Für die Funktion
von CcpA ist neben der Bindung von niedermolekularen Molekülen die Interaktion mit
den homologen Phosphoproteinen HPr-Ser46-P und Crh-Ser46-P essentiell. Damit
verbundene allosterische Veränderungen im Protein erlauben die Bindung an so genannte
catabolite response elements (cre), die CcpA letztlich zu differentieller Genregulation
befähigt. Die Untersuchung der beteiligten Signaltransduktionswege ist Gegenstand
dieser Arbeit.

Der in dieser Arbeit klonierte E. coli/B. subtilis „Shuttle“-Vektor ermöglicht
erstmals die Generierung großer ccpA Mutantenpools in E. coli, die für eine ungerichtete
Mutagenese notwendig sind. Daher wurde ein neues Screeningsystem etabliert, mit dem
direkt nach differentiell regulierenden ccpA Mutanten gesucht werden kann. Es beruht auf
einem B. subtilis Stamm, der zwei voneinander unabhängige Reportergen-Fusionen trägt,
deren Expression auf entsprechenden Selektionsplatten eindeutig erkennbar ist. Das
Screeningsystem erwies sich als funktional, wurde jedoch aufgrund der schlechten
Transformierbarkeit einer ccpA Deletionsmutante im Rahmen dieser Arbeit noch nicht
angewandt.
R17 in HPr vermittelt über Coulomb Wechselwirkungen mit den CcpA Resten D85,
D70`und D100` die Verbrückung der N-terminalen Untereinheiten im CcpA Dimer. Die
richtige Ausrichtung der CcpA Untereinheiten ist Voraussetzung für das Einnehmen der
DNA bindenden Konformation. Demzufolge ist die CcpA Dreifachmutante D70R-D85R-
D100R nicht mehr in der Lage, die Promotoren von xynP, gnt, ackA und alsS zu
regulieren. Die jeweiligen Einzel- und Doppelmutanten bewirken hingegen differentielle
Regulation - ein Hinweis darauf, dass dieser Signaltransduktionsweg abhängig vom
untersuchten Promoter unterschiedlich zur Kohlenstoff-Katabolitenregulation (KKR) in
Bacillus subtilis beiträgt.
In SPR-Interaktionsanalysen wurden die Aminosäurereste HPrH15 und CcpAD297
als Determinaten für die spezifische Stimulation der Bindung von CcpA an HPr-Ser46-P
durch die glykolytischen Intermediate Fruktose-1,6-bisphosphat (FBP) und Glukose-6-
Phosphat (Glc-6-P) identifiziert. Die Mutation dieser Reste zu Glutamin bzw. Alanin hat
weder Auswirkungen auf die Protein-Protein Interaktion noch auf die Komplexbildung mit
xylAcre, die Affinität wird jedoch nicht mehr durch FBP und Glc-6-P verstärkt. Das
Einführen von Histidin an Position 15 in Crh vermittelt Sensitivität gegenüber FBP und
Glc-6-P. Neben dem Phosphotransfer im PTS diskriminiert Position 15 in HPr und Crh
demnach auch für den stimulatorischen Effekt glykolytischer Metabolite. Die
Aminosäurereste D11 und T20 in HPr, die im Crh ebenfalls nicht konserviert vorliegen,
sind an diesem Mechanismus nicht beteiligt. Unter den gewählten Bedingungen ist ein
Beitrag glykolytischer Intermediate auf die KKR in vivo nicht feststellbar. Die CcpA
Mutante D297A reguliert die Promotoren xynP, gnt, ackA und alsS ähnlich dem Wildtyp,
während die Einführung einer negativen Ladung in CcpAD297R zu differentieller
Regulation führt.
Die von der Arbeitsgruppe Sticht vorhergesagte Interaktion zwischen RbsR, einem
zu CcpA homologen Transkriptionsregulator, und HPr-Ser46-P wurde in vitro bestätigt. In
Gelmobilitätsassays vermittelte HPr-Ser46-P spezifisch die Bindung von RbsR an seine
Operatorsequenz. Diese überlappt mit einer cre Sequenz, an die CcpA bindet, was einen
Kompetitionsmechanismus zwischen CcpA und RbsR nahe legt. Die Bedeutung der RbsR–
HPr-Ser46-P Interaktion in vivo ist dagegen noch unklar. Während die CcpA vermittelte
KKR des rbs operons eindeutig nachgewiesen wurde, scheint RbsR wider Erwarten nicht
als Repressor des Operons zu fungieren. Der deutliche Wuchsdefekt einer ptsH1/ ∆crh
Doppelmutante in Anwesenheit von Ribose gegenüber einer ccpA Deletionsmutante
impliziert jedoch eine Beteiligung der Phosphoproteine an einer von CcpA unabhängigen
Regulation des Ribose Transports und –Metabolismus. Zusammenfassung/Summary 2

1 Summary


Catabolite control protein A (CcpA) represents a global transcriptional regulator in gram
positive bacteria with low GC-content. In response to the available nutrient supply CcpA
governs the expression of about 300 genes predominantly involved in carbon catabolism.
Besides the binding of low-molecular-weight effectors, the interaction with the
homologous phosphoproteins HPr-Ser46-P and Crh-Ser46-P is crucial for CcpA function.
Associated allosteric relocations in the protein trigger binding of CcpA to so called
catabolite response elements (cre) that finally result in differential gene regulation. The
elucidation of the involved signal transduction pathways is part of this thesis.


The E. coli/B. subtilis shuttle vector cloned in this study allows the generation of
large ccpA mutant pools in E. coli that is crucial for random mutagenesis. Thus a novel
screening system was established which is directly targeted towards the identification of
differentially regulating ccpA mutants. This system relies on a B. subtilis strain carrying
two independent reporter gene fusions whose expression is unequivocally detectable on
appropriate selection plates. The screening system proved to be functional, but it was not
yet applied in this study due to the low transformation efficiency of the B. subtilis ccpA
deletion strain.

HPr residue R17 bridges the N-terminal subdomains of CcpA by exerting Coulomb
interactions with CcpA residues D85, D70` and D100`. The proper adjustment of CcpA
subdomains is a prerequisite for the adoption of the DNA binding competent
conformation. Accordingly, the CcpA triple mutant D70R-D85R-D100R fails to regulate
the promoters of xynP, gnt, ackA and alsS. The respective single and double mutants,
however, provoke differential regulation, indicating that this signal transduction pathway
contributes differently to CCR of these promoters in Bacillus subtilis.

HPrH15 and CcpAD297 were identified as determinants for specific stimulation of CcpA
binding to HPr-Ser46-P by the glycolytic intermediates fructose 1,6-bisphosphate (FBP)
and glucose 6-phosphate (Glc-6-P). Mutation of these residues to glutamine or alanine,
respectively, does not affect protein-protein interaction or complex formation with
xylAcre in SPR interaction analyses. The affinity, however, is no longer increased by FBP
und Glc-6-P. The introduction of histidine at residue 15 in Crh renders the protein
sensible for FBP or Glc-6-P stimulation. Thus position 15 in HPr and Crh discriminates for
both phosphotransfer in the PTS and the stimulatory effect of glycolytic metabolites. HPr
residues D11 and T20, which are also not conserved between HPr and Crh, are not
involved in this mechanism. A contribution of glycolytic intermediates on CCR in vivo is
not detectable under the conditions tested here. CcpA mutant D297A regulates the
promoter of xynP, gnt, ackA and alsS similar to the wild type, the introduction of a
negative charge in CcpAD297, however, provokes differential regulation.

Bioinformatic investigations in the group of Prof. Sticht revealed an interaction of HPr-
Ser46-P with the CcpA homolog transcription regulator RbsR. This interaction was
confirmed experimentally. In gel mobility shift assays, HPr-Ser46-P mediated specific
binding of RbsR to its operator sequence. The latter overlaps with a cre sequence for
CcpA binding suggesting a competition of CcpA and RbsR for the coeffector HPr-Ser46-P
and the mutual DNA binding site. However, the importance of this interaction in vivo
remains unsettled. Though CcpA mediated CCR of the ribose transport operon was
verified, RbsR seems not to act as repressor of the operon. Notwithstanding, the severe
growth defect of a ptsH1/ ∆crh double mutant in the presence of ribose compared to a
ccpA deletion mutant implies that the phosphoproteins are involved in CcpA independent
regulation of ribose transport and metabolism.

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