Interactions and subcellular distribution of human SUN2 [Elektronische Ressource] / Eva Mawina Vaylann

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Aus dem Zentrum für Biochemie (Medizinische Fakultät) der Universität zu Köln Institut für Biochemie I Geschäftsführende Direktorin: Frau Universitätsprofessor Dr. rer. nat. A. A. Noegel Interactions and subcellular distribution of human SUN2 Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde eines Doctor rerum medicinalium der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Eva Mawina Vaylann Promoviert am: 05.10.2011 Dekanin/Dekan: Universitätsprofessor Dr. med.Th. Krieg 1. Berichterstatterin: Frau Universitätsprofessor Dr. rer. nat. A. A. Noegel 2. Berichterstatterin: Frau Universitätsprofessor Dr. rer. nat. B. Wirth Erklärung Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Dissertationsschrift ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskriptes habe ich keine Unterstützungsleistungen bzw. Unterstützungsleistungen von folgenden Personen erhalten: Frau Universitätsprofessor Dr. rer. nat. A. A. Noegel. Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt.
Publié le : samedi 1 janvier 2011
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Aus dem Zentrum für Biochemie (Medizinische Fakultät) der Universität zu Köln
Institut für Biochemie I
Geschäftsführende Direktorin: Frau Universitätsprofessor Dr. rer. nat. A. A. Noegel









Interactions and subcellular distribution
of human SUN2





Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde eines
Doctor rerum medicinalium
der Hohen Medizinischen Fakultät
der Universität zu Köln



vorgelegt von
Eva Mawina Vaylann







Promoviert am: 05.10.2011





Dekanin/Dekan:
Universitätsprofessor Dr. med.Th. Krieg

1. Berichterstatterin: Frau Universitätsprofessor Dr. rer. nat. A. A. Noegel
2. Berichterstatterin: Frau Universitätsprofessor Dr. rer. nat. B. Wirth

Erklärung
Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Dissertationsschrift ohne unzulässige Hilfe
Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe;
die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche
kenntlich gemacht. Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der
Herstellung des Manuskriptes habe ich keine Unterstützungsleistungen bzw.
Unterstützungsleistungen von folgenden Personen erhalten:
Frau Universitätsprofessor Dr. rer. nat. A. A. Noegel.

Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht
beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe einer Promotionsberaterin/eines
Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar
noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit
dem Inhalt der vorgelegten Dissertationsschrift stehen. Die Dissertationsschrift wurde
von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer
anderen Prüfungsbehörde vorgelegt, und ist abgesehen von den angegebenen
Teilpublikationen noch nicht veröffentlicht worden.


Cologne/Köln: 24.02.2011 Signature/Unterschrift: Eva Vaylann













Dedicated to Munhu Mutema





Nyarara uzive ndini Mwari!
Rwiyo 46:10
(Shona)



Danksagung

Ich möchte mich vor allem bei Frau Prof. Dr. A. A. Noegel für die Gelegenheit, an ihrem
renommierten Institut meine Dissertation anfertigen zu dürfen sowie für ihre Bereitschaft
meine Arbeit zu korrigieren, bedanken.

Größter Dank gilt meinen lieben Laborkollegen Tanja, Rashmi, Vivek, Karthic S., Xin
Napoleon und Ilknur, die dazu beigetragen haben, dass ich immer gerne an die Zeit im
Labor und die gemeinsam gemeisterten Höhen und Tiefen zurückdenken werde.
Insbesondere danke ich Sonja, Rosi, Berthold, Maria, Rolf und Martina für ihre
Unterstützung im Laboralltag. Ein herzlicher Dank geht auch an Budi und Gudrun für die
stetige und freundliche Hilfe bei organisatorischen und EDV-Angelegenheiten.

Ganz herzlich möchte ich mich auch bei allen meinen lieben aktuellen und ehemaligen
Kollegen bedanken: Kalle, Margit, Raphael, Sascha, Anja, Claudia, Sajid, Bhagyashri,
Karthic T., Liu, Sandra, Juliane, Christoph, Jan, Sze Man, Lin, Khalid, Mary, Georgia,
Verena und Surayya.
Allen anderen Mitgliedern des Instituts möchte ich für ihre Kollegialität und die wirklich
tolle Atmosphäre danken.

Ein besonderer Dank geht an meinen Mann Jens und an meine Freunde und Familie.













Table of contents
Abbreviations
1 Introduction ................................................................................................................. 1
1.1 The LINC complexes ....................................................................................... 1
1.1.1 Nesprins - ONM components of LINC complexes ...................................... 2
1.1.2 SUN proteins, emerin and lamins- INM components of LINC complexes ... 3
1.2 Cellular functions of LINC complexes ........................................................... 5
1.3 LINC complexes and human diseases .......................................................... 6
1.4 Aim of this study ........................................................................................... 10
2 Materials and methods ............................................................................................. 11
2.1 Materials ........................................................................................................ 11
2.2 Methods ......................................................................................................... 14
2.2.1 Molecular biological methods ................................................................... 14
2.2.1.1 Cloning strategies .................................................................................. 14
2.3 Protein chemical and immunological methods .......................................... 19
2.3.1 Protein extraction from E.coli and human cells ......................................... 19
2.3.2 Gel electrophoresis and immunoblotting .................................................. 20
2.3.4 Western blot stripping ............................................................................... 21
2.3.5 Cell fractionation ....................................................................................... 21
2.3.6 Preparation of GST fusion proteins .......................................................... 21
2.3.6 GST pull-down assay ............................................................................... 22
2.3.7 In vitro binding assay ................................................................................ 22
2.3.8 Immunofluorescence microscopy ............................................................. 22
2.4 Cell culture .................................................................................................... 24
2.4.1 Human cell lines and media ..................................................................... 24
2.4.2 Cultivation of mammalian cell lines ........................................................... 24
2.4.3 Freezing and thawing of mammalian cells ................................................ 25
2.5 Cell biological assays ................................................................................... 25
2.5. 1 Transient transfection by electroporation of mammalian cells ................. 25
2.5.2 Senescence-associated β-galactosidase assays ..................................... 26
2.5.3 Focal adhesion assay ............................................................................... 26
2.5.4 Cell synchronization ................................................................................. 27
2.6 Generation of a monoclonal antibody ......................................................... 27
2.6.1 Immunization of Balb/c mice ..................................................................... 27
2.6.2 Generation of hybridoma cells .................................................................. 27
2.6.3 Selection of monoclonal antibodies .......................................................... 28
2.6.4 Purification of IgG from hybridoma supernatant ....................................... 29
3 Results....................................................................................................................... 30
3.1 Human SUN2 protein .................................................................................... 30
3.2 Generation of a mouse monoclonal antibody against the N- terminal
region of human SUN2 ....................................................................................... 31
3.2.1 Determination of an epitope in the N-terminal sequence of human SUN2
suitable for antibody production ......................................................................... 31
3.2.2 Expression and detection of the SUN2NT protein .................................... 32
3.2.3 Identification of positive hybridoma clone K80-207-11 by immunoblot and
immunofluorescence analysis ........................................................................... 33
3.2.4 Transfection of POP10 cells with pJG129SUN2 full length, tagged with
V5 6xHis ............................................................................................................ 35 *
3.3 Distribution of endogenous SUN2 protein during the cell cycle .............. 38
3.4 Putative interaction partners of SUN2Nt ..................................................... 40
3.5 Direct interaction of SUN2Nt protein with LMNC polypeptides ................ 47
3.6 Characterization of fibroblasts from Duchenne muscular dystrophy
(DMD), Emery-Dreifuss muscular dystrophy/ Charcot-MarieTooth syndrome
(EDMD/CMT) and Stiff skin syndrome (SSS) patients ...................................... 50
3.6.1 Case report of Duchenne muscular dystrophy (DMD), and Emery-Dreifuss
muscular dystrophy/Charcot-Marie-Tooth syndrome (EDMD/CMT) and Stiff skin
syndrome (SSS) patients ................................................................................... 50
3.6.2 Patient fibroblasts show nuclear defects .................................................. 52
3.6.3 Proliferative ability of patient fibroblasts is restricted ................................ 54
3.6.4 Increased senescence is induced in patient fibroblasts ............................ 55
3.6.5 SUN2 gene expression is down-regulated in senescent patient cells ...... 56
3.6.6 Cell adhesion is altered in patient fibroblasts ........................................... 58
3.6.7 Distribution of nuclear envelope proteins in control fibroblasts and patient
fibroblasts .......................................................................................................... 61
3.6.8 Nucleus-centrosome distance is increased in EDMD/CMT, DMD and Stiff
skin syndrome fibroblasts .................................................................................. 68
3.6.9 Precipitation profile in EDMD/CMT fibroblast cells differ from control
fibroblast cells .................................................................................................... 70

4 Discussion ................................................................................................................ 73
4.1 Generation of a monoclonal antibody ......................................................... 73
4.2 Subcellular localization of endogenous SUN2 during the cell cycle ........ 73
4.3 Protein networks formed by SUN2 .............................................................. 74
4.4 Direct interactions of LMNA/C with the N-terminus of SUN2 in vitro ....... 78
4.5 Characterization of fibroblast from Stiff skin syndrome (SSS), Duchenne
muscular dystrophy (DMD) and Emery-Dreifuss muscular dystrophy /
Charcot-Marie-Tooth syndrome (EDMD/CMT) patients ................................... 80
4.5.1 Stiff skin syndrome (SSS) patients ........................................................... 80
4.5.2 Duchenne muscular dystrophy (DMD) and Emery-Dreifuss muscular
dystrophy / Charcot-Marie-Tooth syndrome (EDMD/CMT) ................................ 82
Summary ...................................................................................................................... 92
Zusammenfassung (deutsch) ..................................................................................... 88
References ................................................................................................................... 90
Preliminary Puplications ........................................................................................... 103
Curriculum vitae/Lebenslauf .................................................................................... 104






Abbreviations


% Percent
aa Amino acid(s)
Amp Ampicilline
APS Ammonium persulfate
Aqua dest. Aqua destillata, destilled water
ATP Adenosine triphosphat
bp Base pair(s)
BSA Bovine serum albumine
C Celsius or nucleotide Cytosine
ca. Circa, approximately
CIP Calf intestine alcaline phosphatase
Cm Centimetre
CoREST Corepressor for RE1 silencing transcription factor
DMEM Dulbecco´s Modified Eagle Medium
DMSO Dimethylsulfoxide
DNA Deoxyribonucleic acid Desoxyribonucleotidetriphosphat
DTT Dithiothreitol
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylen-Diamine-Tetra-acetate
ER endoplasmatic reticulum
EtBr Ethidiumbromide
EtOH Ethanol
FCS Fetal calf serum
g Gramm
g Relative centrifugation force
GAPDH Glycerinaldehydephosphate dehydrogenase
GbM glioblastoma multiforme
GST glutathione S-transferase
hr Hour(s)
HEPES N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N´-2-ethansulfonsäure
INM Inner nuclear membrane
KASH Klarsicht/Anc-1/Syne homology
kb kilo base
kDa kilo Dalton
λ Wave length
M Molar
mAb Monoclonal antibody
MDa Mega Dalton
min Minute
g Microgramm
ml Milliliter
m Micrometer
l Microliter
mM Millimolar
mRNA Messenger Ribonucleic acid
NCoR nuclear receptor co-repressor
NE Nuclear envelope
ng Nanogramm
nm Nanometer
NURD Nucleosome remodeling and histone deactylation
ONM Outer nuclear membrane
ORF Open reading frame
pAb Polyclonal antibody
PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis
PBS Phosphat buffered saline
PCR Polymerase chain reaction
PNS Perinuclear space
RNA Ribonucleic acid
rpm Rounds per minute
RT Room temperature
SDS Sodium dodecyl sulfate
sec Second
SMRT Silencing Mediator of Retinoid acid and Thyroid
hormone receptor
SUN Sad1/UNC-84 homology
TAE Tris-Acetate-EDTA
TE Tris-EDTA
Taq Thermus aquaticus
TEMED N,N,N´,N´-Tetramethyl-ethylendiamin
Tris Trishydroxyaminomethan
U Unit
UV Ultraviolet light
V Volt
v/v Volume per volume
w/v Weight per volume
X-Gal 5-Bromo-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranoside





Introduction
1 Introduction
1.1 The LINC complexes
The nucleus is separated from the cytoplasm by a double membrane, the outer
nuclear membrane (ONM) and the inner nuclear membrane (INM). The lumen
between both membranes is the perinuclear space (PNS). Linker of the
nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complexes physically connect the nuclear
interior with the cytoskeleton. They consist of an INM transmembrane protein and an
ONM transmembrane protein which physically interact with each other in the PNS.
The INM LINC component interacts on the nucleoplasmic side with either the lamina,
a meshwork of intermediate filaments, or with an INM-associated protein. The ONM
LINC component on the other hand contacts on the cytoplasmatic side components
of the cytoskeleton. In mammals, the LINC complexes include nesprins NESPRIN1/2
(Nuclear envelope Spectrin repeat), SUN (Sad1p, UNC-84) domain proteins, emerin,
F-actin, microtubules, intermediate filaments, plectin, laminA/C (LMNA/C) and
chromatin (Fig. 1), (Crisp et al., 2006; Tzur and Gruenbaum, 2006).

α/β intergrins
plasmamembrane
talin
actin- filaments/myosin
vinculin intermediate filaments MTOC
α-actinin
microtubules
NESPRIN 1/2
?
sarcoplasmatic
ONM reticulum
NESPRIN1α Z Z
emerin
INM SUN2
LMNA/C
?
chromatin
actin/myosin A-band I-band titin
nucleus

Fig. 1: The LINC complex facilitates the coupling of the nuclear lamina to cytoplasmic cytoskeletal
systems comprised of SUN proteins in the INM that binds to the nuclear lamina via interactions with
laminA/C and potentially smaller nesprin isoforms and emerin. The KASH domain of the larger
isoforms of NESPRIN1/2 at the ONM associates with the SUN-domain of the SUN proteins within the
perinuclear space to tether the NE to either cytoplasmic actin, IFs or microtubule network and links the
MTOC. In the muscle sarcomere, nesprins are present in the sarcoplasmic reticulum, Z-line and A/I
junction and potentially link these structures and the actin cytoskeleton (Zhang et al, 2007). Question
marks indicate suggested but not proven interactions.

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