Klärung der molekularen Mechanismen der apoptotischen Wirkung des Myrtucommulons aus Myrtus communis [Elektronische Ressource] = Elucidation of molecular mechanisms of apoptosis induction by myrtucommulone from Myrtus communis / vorgelegt von Dagmar Blaesius

De
Klärung der molekularen Mechanismen der apoptotischen Wirkung des Myrtucommulons aus Myrtus communis Elucidation of molecular mechanisms of apoptosis induction by myrtucommulone from Myrtus communis Dissertation der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Eberhard Karls Universität Tübingen zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften 2009 vorgelegt von Dagmar Blaesius Klärung der molekularen Mechanismen der apoptotischen Wirkung des Myrtucommulons aus Myrtus communis Elucidation of molecular mechanisms of apoptosis induction by myrtucommulone from Myrtus communis Dissertation der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Eberhard Karls Universität Tübingen zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften 2009 vorgelegt von Dagmar Blaesius Tag der mündlichen Prüfung: 30. Oktober 2009 Dekan: Prof. Dr. L. Wesemann 1. Berichterstatter: Prof. Dr. O. Werz 2. Berichterstatter: Prof. Dr. S. Wesselborg Danksagung Danksagung Die vorliegende Arbeit wurde unter der Leitung von Prof. Dr. O. Werz am Pharmazeutischen Institut der Eberhard Karls Universität Tübingen angefertigt.
Publié le : jeudi 1 janvier 2009
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Klärung der molekularen Mechanismen der
apoptotischen Wirkung des Myrtucommulons aus
Myrtus communis



Elucidation of molecular mechanisms of apoptosis
induction by myrtucommulone from Myrtus
communis



Dissertation

der Fakultät für Chemie und Pharmazie
der Eberhard Karls Universität Tübingen



zur Erlangung des Grades eines Doktors
der Naturwissenschaften







2009





vorgelegt von
Dagmar Blaesius























































Klärung der molekularen Mechanismen der
apoptotischen Wirkung des Myrtucommulons
aus Myrtus communis



Elucidation of molecular mechanisms of
apoptosis induction by myrtucommulone from
Myrtus communis



Dissertation

der Fakultät für Chemie und Pharmazie
der Eberhard Karls Universität Tübingen



zur Erlangung des Grades eines Doktors
der Naturwissenschaften







2009





vorgelegt von
Dagmar Blaesius





































Tag der mündlichen Prüfung: 30. Oktober 2009




Dekan: Prof. Dr. L. Wesemann
1. Berichterstatter: Prof. Dr. O. Werz
2. Berichterstatter: Prof. Dr. S. Wesselborg Danksagung
Danksagung



Die vorliegende Arbeit wurde unter der Leitung von Prof. Dr. O. Werz am
Pharmazeutischen Institut der Eberhard Karls Universität Tübingen angefertigt.


Für die intensive Betreuung, Motivation und die Bereitstellung jeglicher
benötigten Mittel möchte ich mich ganz herzlich bei Herrn Prof. Werz bedanken.
Vielen Dank an Herrn Prof. Wesselborg für die vielen Anregungen, das
Bereitstellen von diversen Zelllinien sowie für die Übernahme der Zweitkorrektur.
Sehr hilfreich, unterstützend und motivierend war die tolle Arbeitsatmosphäre im
gesamten AK Werz. Lieben Dank euch allen! Es hat sehr viel Spaß gemacht.
Vielen Dank auch den Leuten, die meine Ratgeber oder Methoden-Trainer
gespielt haben, vor allem: Dr. Carlo Pergola, Dr. Stefan Welte, Dr. Mareike
Wittenbrink und Alexander LeBlanc.
Danke an Herrn Prof. J. Jauch aus Saarbrücken und Herrn Prof. G. Appendino aus
Italien für die unermüdliche Bereitstellung von Myrtucommulon.
Einen herzlichen Dank auch an die gute Seele des AK Werz, Frau Hannelore
Braun, die immer Zeit für jeden hatte und es ein gutes Stück einfacher gemacht
hat, sich im Formulardschungel der Uni zurechtzufinden.
Einen weiteren Dank an Carlos Lamsfus Calle, der in seiner Zeit als Erasmus-
Student im AK Werz sehr viel an Ergebnissen beigetragen hat.
Vielen Dank auch Herrn Prof. Dr. Klaus Schulze-Osthoff, Herrn Dr. Martin
Michaelis, Herrn Dr. John Blenis, Herrn Dr. Ziegler-Heitbrock, Herrn PD Dr.
Claus Belka und dem Team vom Blutspendezentrum Tübingen für die
Bereitstellung von diversen Jurkat Zelllinien und von Blutpräparaten.
Für die Bereitstellung der finanziellen Mittel einen großen Dank an die DFG.



































Contents

Contents
Contents

DANKSAGUNG......................................................................................... 7
CONTENTS............................................................................................. 11
ABBREVIATIONS ................................................................................... 16
INTRODUCTION ..................................................................................... 20
1 MYRTUS COMMUNIS AND MYRTUCOMMULONE ....................... 20
2 CANCER .......................................................................................... 26
2.1 Leukaemia ................................................................................................. 26
2.2 Cancer and inflammation .......................................................................... 28
2.3 Metabolism of cancer cells........................................................................ 29
3 APOPTOSIS..................................................................................... 33
3.1 Pathways of apoptosis induction ............................................................... 34
3.2 Caspases .................................................................................................... 34
3.3 Bcl-2 proteins ............................................................................................ 35
3.4 Mitochondria and the permeability transition pore ................................... 38
4 CELL CYCLE ................................................................................... 40
5 CELLS.............................................................................................. 42
5.1 HL60.......................................................................................................... 42
5.2 MM6.......................................................................................................... 42
5.3 Jurkat T-lymphocytes ................................................................................ 43
5.4 Neutrophilic granulocytes ......................................................................... 43
5.5 Mononuclear cells (PBMC)....................................................................... 44
6 G PROTEIN COUPLED RECEPTOR PATHWAYS ......................... 45
6.1 Downstream targets of the FPR................................................................. 45 Contents
7 THE MAPK PATHWAYS ..................................................................47
7.1 Activation of the Ras/Raf pathway by fMLP............................................ 49
8 AIM OF THE STUDY.........................................................................51
MATERIALS AND METHODS.................................................................54
9 MATERIALS .....................................................................................54
10 CELLS...........................................................................................56
11 METHODS.....................................................................................57
11.1 Cytotoxicity assay (trypan blue) ............................................................... 57
11.2 Cytotoxicity assay (MTT assay) ............................................................... 57
11.3 Determination of DNA-fragmentation and cell cycle measurements ....... 58
11.4 Measurement of cytochrome c release from mitochondria....................... 59
11.5 Determination of the mitochondrial membrane potential Ψ................... 59
11.6 Annexin V / propidium iodide assay......................................................... 60
11.7 SDS-PAGE and Western Blot................................................................... 62
11.8 PTPase assay ............................................................................................. 62
11.9 Ras-assay................................................................................................... 63
11.10 Statistical analysis ..................................................................................... 63
RESULTS.................................................................................................66
12 MYRTUCOMMULONE INDUCES APOPTOSIS IN VARIOUS
CANCER CELL LINES..................................................................66
12.1 MC induces cell death in different cancer cell lines ................................. 66
12.2 Induction of caspase-cleavage by MC in HL60 cells and MM6 cells ...... 68
12.3 DNA fragmentation induced by MC in HL60 cells and MM6 cells......... 73
12.4 MC leads to cytochrome c release in HL60 cells and MM6 cells............. 74
12.5 MC causes loss of the mitochondrial membrane potential Ψ ............... 76 m

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