La polarité cellulaire chez la levure Saccharomyces cerevisiae : etude de la régulation de la protéine RhoGAP Rgd1 à domaine F-BAR, Cell polarity in the yeast Saccharomyces cerevisiae : study of the regulatory protein RhoGAP Rgd1 with a F-BAR domain

De
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Sous la direction de François Doignon
Thèse soutenue le 15 décembre 2009: Bordeaux 2
Chez l’ensemble des organismes, la capacité des cellules à se polariser est une propriété nécessaire à la croissance, à la division, à la mobilité, à la différenciation ou encore au trafic intracellulaire. Les GTPases de la famille Rho jouent des rôles prépondérants dans la régulation de ces mécanismes. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, nous étudions la manière dont le régulateur RhoGAP Rgd1p des protéines Rho3 et Rho4 est lui-même régulé au cours de la croissance polarisée. Nous avons montré que la protéine Rgd1 est localisée au fond du bourgeon lors de la croissance isotropique du bourgeon puis sous forme d’un anneau au cou du bourgeon lors de la cytocinèse. Nous avons également montré que le trafic intracellulaire, notamment l’exocytose et les phosphoinosotides tels que le PdtIns(4)P et le PdtIns(4,5)P2 ont un rôle majeur dans la régulation spatio-temporelle de la protéine Rgd1. Ces mécanismes permettraient d’acheminer la protéine RhoGAP au niveau des sites de croissances afin d’agir sur les protéines Rho3 et Rho4.
-RhoGAP
-Polarité cellulaire
-GTPases de la famille Rho
-Rgd1P
-Domaine F-BAR
-Saccharomyces cerevisiae
In all organisms, the ability of cells to polarize is a property necessary for growth, cell division, mobility, cell differentiation or intracellular trafficking. GTPases of the Rho family play central roles in the regulation of these mechanisms. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, we study how the regulator RhoGAP Rgd1p of Rho3 and Rho4 proteins may be itself regulated during polarized growth. We showed that the protein Rgd1 is located at the bud tip during isotropic growth of the bud and form a ring at the bud neck during cytokinesis. We also showed that the intracellular traffic, especially the exocytosis and phosphoinosotides as the PdtIns(4)P and PdtIns(4,5)P2 have a major role in the spatio-temporal regulation of the Rgd1 protein. These mechanisms would deliver the RhoGAP protein at growth sites to act on Rho3 and Rho4 proteins.
Source: http://www.theses.fr/2009BOR21648/document
Publié le : vendredi 28 octobre 2011
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Université Victor Segalen Bordeaux 2
Année 2009 Thèse n°1648
THESE
Pour le
DOCTORAT DE L’UNIVERSITE BORDEAUX 2
Mention : Sciences Biologiques et Médicales
Option : Biologie-Santé
Présentée et soutenue publiquement le :
15 Décembre 2009
Par
Fabien LEFEBVRE
Né le 4 Juillet 1983
La polarité cellulaire chez la levure
Saccharomyces cerevisiae :
Etude de la régulation de la protéine
RhoGAP Rgd1 à domaine F-BAR.
Membres du Jury :
M M. Aigle, Professeur Université Lyon 1 Président
Mme B. Winsor, Directrice de recherche CNRS, Strasbourg Rapporteur
Mme M.H. Cuif, Maître de conférences, Université Paris-Sud 11 Rapporteur
Mme V. Moreau, Chargée de recherche, Université Bordeaux 2 Examinateur
M M. Crouzet, Professeur, Université Bordeaux 2 Examinateur
M F. Doignon, Professeur, Université Bordeaux 2 Directeur de thèseABREVATIONS
ADN acide désoxyribonucléique
APS persulfate d’ammonium
ATP adénosine 5' triphosphate
EDTA acide éthylène diamine tétraacétique
FITC fluorescéine isothiocyanate
GDP guanosine 5' diphosphate
GFP green fluorescent protein
GMP guanosine 5' monophosphate
GTP guanosine 5' triphosphate
LiAC acétate de lithium
PCR polymerase chain reaction
PEG polyéthylène glycol
PMFS phenyl methyl sulfoxyde fluoride
rpm rotation par minute
SDS sodium dodécyl sulfate
SPB sindle pole body
Tris tris hydroxymethylaminomethane
UV ultra violet TABLE DES MATIERES



INTRODUCTION............................................................................................... 1
A. Généralités sur la polarité cellulaire...................................................... 1
1. Le cytosquelette d’actine.................................................................. 2
2. Le cytosquelette de microtubules ..................................................... 3
3. Le trafic intracellulaire ..................................................................... 3
4. Les septines....................................................................................... 3
B. Les GTPases de la super-famille Ras.................................................... 4
1. Les régulateurs des petites protéines G ............................................ 5
2. Les protéines Rho chez l’Homme .................................................... 5
3. Les protéines Rho chez la levure...................................................... 6
4. La croissance polarisée chez Saccharomyces cerevisiae et
l’implication des protéines Rho ................................................................ 7
5. Les régulateurs des protéines Rho3p et Rho4p ................................ 9
C. Objectifs .............................................................................................. 10
MATERIELS ET METHODES.......................................................................... 12
A. Matériel biologique ............................................................................. 12
1. Souches de levure ........................................................................... 12
2. Souches bactériennes...................................................................... 12
3. Vecteurs de clonage et d'expression............................................... 12
B. Méthodes microbiologiques ................................................................ 14
1. Milieu pour bactéries ...................................................................... 14
2. Milieux pour levures....................................................................... 14
3. Conditions de culture et de conservation........................................ 15
4. Suivi de la croissance cellulaire...................................................... 16
5. Mesure de la viabilité cellulaire...................................................... 16
6. Tests en gouttes............................................................................... 16
7. Obtention des zygotes..................................................................... 17
8. Obtention des haploïdes.................................................................. 17
9. Condition de culture de levures permettant la mise en place d’un
stress acide............................................................................................... 17
10. Synchronisation cellulaire au facteur alpha.................................... 18
C. Manipulation des acides nucléiques.................................................... 18
1. Extraction d'ADN ........................................................................... 18
2. Hydrolyse et ligation de l'ADN ...................................................... 18
3. Amplification d'ADN par PCR (Polymerase Chain Reaction) ...... 19
4. Mutagenèse dirigée......................................................................... 19
5. Séquençage d'ADN......................................................................... 19
6. Séparation des acides nucléiques par électrophorèse sur gel
d'agarose et purification d'ADN.............................................................. 20
7. Transformation des bactéries E. coli .............................................. 21
8. Transformation des levures S. cerevisiae ....................................... 21
D. Préparation et analyse des protéines ................................................... 22
1. Extraction des protéines totales de levure ...................................... 22
2. Quantification des extraits protéiques ............................................ 22
3. Electrophorèse des protéines en gel d'acrylamide.......................... 23
4. Immunodétection des protéines sur membrane .............................. 23
E. Recherche d'interactions physiques entre protéines par le système
double hybride............................................................................................. 24
1. Principe du double hybride............................................................. 24
2. Réalisation des tests double hybride............................................... 24
F. Méthode de biologie cellulaire............................................................ 25
1. Observation des cellules en microscopie à fluorescence................ 25
2. Marquage de l'actine-F par la phalloïdine-Alexa ....................... 26 568
3. Marquage nucléaire au DAPI ......................................................... 26
4. Immunocytochimie......................................................................... 27
G. Fractionnement subcellulaire .............................................................. 28
1. Extraction des protéines totales à partir de sphéroplastes .............. 28
2. Centrifugations différentielles ........................................................ 28
3. Centrifugation sur gradient de saccharose...................................... 29
4. Tests d’activités enzymatiques ....................................................... 30
a) Mesure de l’activité ATPasique.................................................. 30
b) Mesure de l’activité GDPasique du cis-Golgi............................. 30
c) Mesure de l’activité cytochrome c réductase du réticulum
endoplasmique..................................................................................... 31
d) Calcul des activités spécifiques................................................... 31
H. Mesure de activité RhoGAP................................................................ 32
1. Activité GAP en condition standard............................................... 32
2. Préparation des phospholipides pour les activités RhoGAP .......... 33
I. Test d’interaction protéine-lipide par« fat-Western-blot » ................. 34
J. Mesure de l’abondance, de la synthèse et de la dégradation .............. 34
1. Mesure de l’abondance de Rgd1p. ................................................. 34
2. Mesure de la vitesse de synthèse de Rgd1p.................................... 35
a) Lyse des cellules.......................................................................... 35
b) Immunoprécipitation ................................................................... 36
3. Mesure de la stabilité de la protéine Rgd1p ................................... 36
RESULTATS ...................................................................................................... 37
Chapitre I. Relation entre Rgd1p et les cytosquelettes.............................. 37
A. Relation entre le domaine RhoGAP de Rgd1p et le cytosquelette
d’actine ........................................................................................................ 38
1. Contexte.......................................................................................... 38
2. Résultats.......................................................................................... 39

a) Le cytosquelette d’actine est-il affecté dans un mutant rgd1! en
conditions standards de culture ? ........................................................ 39
b) Le pH acide affecte-t-il la polarité du cytosquelette d’actine dans
un mutant rgd1! ?............................................................................... 39
c) Visualisation du cytosquelette d’actine avec ABP1-3xGFP....... 40
d) Marquage du cytosquelette d’actine à la phalloïdine.................. 41
3. Conclusion ...................................................................................... 42
B. Existe-t-il une interaction entre Rgd1p et les microtubules ?............. 43
1. Existe-t-il une interaction entre Rgd1p et les microtubules in vitro ?
44
2. Existe-t-il une interaction entre Rgd1p et les microtubules in vivo ?
44
a) Recherche de létalités synthétiques avec le gène RGD1 ............ 45
b) Effet du benomyl sur la croissance du mutant rgd1!................. 46
c) Etude du phénotype de binucléation chez le mutant rgd1! ....... 46
d) Localisation cellulaire de la protéine Rgd1................................. 47
3. Conclusion ...................................................................................... 48
C. La phosphorylation de Rgd1p pourrait-elle conditionner une
interaction avec les microtubules ? ............................................................. 49
1. Généralités ...................................................................................... 49
2. Quelle est la localisation de Rgd1 dans un mutant ipl1 ?............... 50
3. La serine S143 a-t-elle un rôle dans la localisation de Rgd1 ? ...... 51
4. Caractérisation de la localisation particulière de Rgd1-3GFP
observée dans un mutant ipl1-321........................................................... 52
5. Quelle est la localisation de Rgd1-3GFP dans un mutant fyv8! ?. 53
6. Conclusion ...................................................................................... 53
D. Conclusions générales et perspectives ................................................ 54
Chapitre II. Etude de la régulation de Rgd1p, protéine RhoGAP à domaine
F-BAR .................................................................................................. 56
A. Généralités........................................................................................... 56
1. Mise en évidence du domaine F-BAR............................................ 56
2. Protéines RhoGAP à domaine F-BAR et pathologies humaines. .. 57
3. Les protéines à domaine F-BAR chez la levure. ............................ 58
B. Régulation de Rgd1p par les phospholipides...................................... 58
1. Effets des phospholipides sur les protéines à activité GAP. .......... 58
2. Problématique................................................................................. 59
3. Les phospholipides ont-ils un rôle dans la régulation de l’activité
RhoGAP et dans la localisation de Rgd1p ? ........................................... 60
4. Les phosphoinositides autres que le PtdIns(4)P et le PtdIns(4,5)P2
ont-ils un rôle dans la régulation de la localisation de Rgd1p ? ............. 69
C. Le trafic intracellulaire intervient-il dans la localisation apicale de
Rgd1p ?........................................................................................................ 70

1. La localisation de Rgd1p est-elle perturbée dans des mutants
affectés pour le trafic intracellulaire ?..................................................... 71
2. Dans quel compartiment biologique Rgd1p est-elle localisée ? .... 73
a) Fractionnement cellulaire par centrifugations différentielles ..... 74
b) Fractionnement cellulaire par centrifugation sur gradient de
saccharose............................................................................................ 75
3. Conclusion ...................................................................................... 77
D. Localisation de Rgd1p au niveau du cou du bourgeon ....................... 80
1. Généralités sur la cytocinèse chez S. cerevisiae............................. 80
2. Rgd1p interagit avec de nombreux acteurs de la cytocinèse.......... 81
3. La localisation de Rgd1p au cou du bourgeon dépend-t-elle du
cycle cellulaire ?...................................................................................... 82
a) A quelle phase du cycle cellulaire Rgd1p est-elle localisée au cou
du bourgeon ? ...................................................................................... 82
b) A quelle étape de la phase mitotique Rgd1p est-elle localisée au
cou ? .................................................................................................... 83
4. Comment Rgd1p est-elle recrutée au niveau du cou ? ................... 84
a) Interaction avec les septines........................................................ 85
b) Comment Rgd1p et Hof1p interagissent-elles ? ......................... 85
5. Conclusion ...................................................................................... 86
E. Etude de l’abondance de la protéine Rgd1p au cours du cycle
cellulaire. ..................................................................................................... 87
1. Abondance de la protéine Rgd1...................................................... 88
2. Synthèse de Rgd1p au cours du cycle ............................................ 88
3. Stabilité de la protéine Rgd1 .......................................................... 89
4. Conclusion et perspectives ............................................................. 89
CONCLUSION ................................................................................................... 91
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ............................................................ 97


INTRODUCTIONNeurones Cellules immunitaires
Paul De Koninck Atlas, Ronald M.
Principles of MicrobiologyGreenspine.ca.
Levure Saccharomyces cerevisiae Cellules endothéliales
Wheal EA. Southern Illinois University
Max Plank Institut School of medecine web site
Figure 1 : Exemples de cellules polarisées.
INTRODUCTION

A. Généralités sur la polarité cellulaire

Au cours de l’évolution, des organismes présentant une immense diversité sont
apparus et ont colonisé les milieux les plus variés et les plus hostiles. Au delà de cette
biodiversité, il existe une unité du vivant. De nombreux mécanismes homologues sont
retrouvés dans des organismes phylogénétiquement et morphologiquement éloignés (Drubin
& Nelson, 1996). Chez les eucaryotes, c’est par exemple le cas du contrôle du cycle cellulaire
par la famille des protéines CDK (Cyclin Dependent Kinase) (Kaldis, 1999) et de la
ségrégation des chromosomes lors de la division cellulaire, contrôlée entre autres par les
protéines du kinétochore (Kitagawa & Hieter, 2001).
Un autre phénomène conservé au cours de l’évolution est la capacité des cellules à se
polariser (Figure 1). La polarité cellulaire comprend un ensemble de mécanismes permettant
l’acquisition d’une morphologie particulière, la migration cellulaire ou encore un trafic
intracellulaire polarisé (Ridley, 2001). Ainsi, chez les métazoaires, tous les mécanismes de la
polarité cellulaire seront mis en œuvre, notamment lors du développement de l’organisme au
cours duquel des cellules totipotentes embryonnaires non différenciées conduiront à la
formation d’un individu composé de nombreux types cellulaires distincts, avec des
caractéristiques morphologiques et fonctionnelles très différentes. Nous pouvons notamment
citer l’exemple des cellules endothéliales qui possèdent des morphologies et fonctions
différentes entre leurs faces apicale et basale (Barnhart & Baechler, 1978). La différenciation
et la migration neuronale mettent également en jeu les mécanismes de polarité cellulaire qui
conduiront à l’acquisition de la morphologie des neurones ainsi qu’à la sécrétion polarisée des
neurotransmetteurs le long de l’axone jusqu’à la synapse (Cameron et al., 1993).

La polarité cellulaire est issue de la combinaison de différents mécanismes
globalement conservés au cours de l’évolution, comprenant les acteurs de la dynamique des
cytosquelettes d’actine et de microtubules, du transport de vésicules et de leur ciblage vers des
zones particulières de la cellule (Watanabe & Higashida, 2004).



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