Les plasmides pSci de Spiroplasma citri GII3 : caractérisation fonctionnelle et rôle dans la transmission par l'insecte vecteur, Plasmids pSci from Spiroplasma citri GII3 : functional characterization and role in insect transmission

De
Publié par

Sous la direction de Joël Renaudin
Thèse soutenue le 11 décembre 2009: Bordeaux 2
Les plasmides pSci de Spiroplasma citri GII3 possèdent une structure mosaïque avec de nombreuses régions conservées. Des dérivés du plasmide pSci2 ont été produits par délétions successives et leur capacité de réplication a été évaluée. Le plus petit réplicon obtenu ne contient plus qu’une CDS (pE) et ses régions flanquantes. L’inactivation dans un vecteur navette du gène pE est suffisante pour abolir la réplication de ce plasmide dans S. citri. Des dérivés des pSci ont été introduits efficacement dans S. kunkelii et S. phoeniceum, deux spiroplasmes phytopathogènes pour lesquels aucun outil génétique n’était disponible jusqu’à présent. La stabilité des dérivés des pSci a également été évaluée par leur capacité à persister en l’absence de pression de sélection. L’instabilité ségrégationnelle des plasmides dans lesquels soj a été délété ou inactivé indique que la protéine de partition Soj/ParA est essentielle au maintien des plasmides pSci. L’incompatibilité sélective entre un plasmide pSci et ses dérivés a été exploitée pour produire une collection de souches possédant des profils plasmidiques différents. L’analyse des phénotypes d’acquisition et de transmission de plusieurs de ces mutants suggère que la CDS traG portée par le pSci6 est essentielle à la transmission de S. citri GII3. En revanche, les plasmides pSci1-5, codant les protéines adhésine-like ScARPs, ne sont indispensables ni à l’acquisition ni à la transmission. Dans le cadre de ce travail, plusieurs outils génétiques ont été adaptés aux mollicutes. Le promoteur Pxyl/tetO2 a été utilisé pour contrôler l’expression du gène de la spiraline chez S. citri et M. agalactiae. Enfin, un système de linéarisation de plasmide in vivo basé sur l’expression de l’endonucléase I-SceI a été utilisé pour l’élimination de plasmides pSci chez S. citri.
-Mollicute phytopathogène
-Spiroplasma citri
-Plasmides
-Réplication
-Partition
-Incompatibilité
-Transmission par insecte
-Expression inductible
Plasmids pSci from Spiroplasma citri GII3 display a mosaic gene organization with highly conserved regions. Through successive deletions, various pSci2 derivatives were constructed and assessed for their ability to replicate. The smallest functional replicon consists of one single CDS (pE) and its flanking, intergenic regions. Furthermore, shuttle (S. citri/E. coli) plasmids, in which the pE gene was disrupted, failed to replicate in S. citri, suggesting that PE is the replication protein. S. citri plasmids were efficiently introduced into S. kunkelii and S. phoeniceum, two plant pathogenic spiroplasmas, the transformation of which had never been described before. Studying stability of various pSci-derived plasmids in the absence of selection pressure strongly suggests the occurrence of an active partition system involving the soj-like gene. Selective incompatibility between a given pSci plasmid and its derivatives was used to remove plasmids from the wild-type strain. As a result, a collection of S. citri GII3 mutants differing in their plasmid contents was produced. Experimental transmission of these mutants through injection to or ingestion by the leafhopper vector will provide new insights into the role of plasmid encoded determinants in the biology of S. citri. First data indicated that pSci6 traG is required for insect transmission of S. citri GII3. In contrast, pSci1-5, encoding adhesin-like proteins, are not essential for both transmission and acquisition. In the frame of this work, new genetic tools have been adapted for use in mollicutes. The tetracycline inducible promoter, Pxyl/tetO2, was used to control spiraline gene in S. citri and M. agalactiae. Also, an in vivo linearization system based on the expression of the I-SceI-endonuclease was used to remove pSci plasmids from S. citri.
-Plant pathogenic mollicute
-Spiroplasma citri
-Plasmids
-Replication
-Partition
-Incompatibility
-Insect transmission
-Inducible expression
Source: http://www.theses.fr/2009BOR21673/document
Publié le : jeudi 27 octobre 2011
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Université Victor Segalen Bordeaux 2


Année 2009

Thèse n°1673

THÈSE

pour le

DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 2

Mention : Sciences, Technologie, Santé
Option : Microbiologie


Présentée et soutenue publiquement

Le 11 décembre 2009

Par Marc Breton

Né le 14 novembre 1979 à Périgueux (Dordogne)


Les plasmides pSci de Spiroplasma citri GII3 : caractérisation
fonctionnelle et rôle dans la transmission par l’insecte vecteur




Membres du Jury

M. BLANCHARD A., Professeur à l’Université de Bordeaux 2 ........... Président
M. BLANCO C., Professeur à l’Université de Rennes 1 ........................ Rapporteur
Mme CITTI C., Directrice de Recherche à l’INRA de Toulouse ........... Raur
Mme QUENTIN-NOURY C., Professeur à l’Université de Bordeaux 2 Examinateur
M. MANCEAU C., Directeur de Recherche à l’INRA d’Angers ........... Examinateur
M. RENAUDIN J., Directeur de Recherche à l’INRA de Bordeaux ...... Directeur de thèse


























A ma femme, à mes enfants
















Ce travail a été réalisé au sein de l’équipe Mollicutes de l’Unité Mixte de Recherche
Génomique, Développement et Pouvoir Pathogène (Institut National de la Recherche
Agronomique et Université Victor Ségalen Bordeaux 2) dirigée par le Professeur Alain
Blanchard.

Je remercie tout d’abord Joël Renaudin de m’avoir accueilli dans son laboratoire et
d’avoir assuré la direction de ma thèse. Je tiens à lui témoigner toute ma reconnaissance
pour la qualité de son encadrement mais également la disponibilité et la compréhension dont
il a toujours fait preuve à mon égard.

Je remercie le Professeur Alain Blanchard de me faire l’honneur de présider ce Jury.

J’exprime toute ma gratitude au Pr Carlos Blanco et au Dr Christine Citti pour avoir
accepté d’examiner et de juger cette thèse.

Je remercie également le Pr Claudine Quentin-Noury et le Dr Charles Manceau de
participer à ce jury.

Je tiens à remercier vivement tous les membres de l’équipe mollicutes qui m’ont
accompagné au cours de cette thèse et tout particulièrement Sybille Duret, Jean-Luc Danet et
Pascal Sirand-Pugnet qui ont largement contribué à ce travail.

Mes remerciements vont également à mon épouse qui accomplit l’exploit de supporter
un thésard à ses côtés pendant ces années.














TABLES DES MATIERES

I. INTRODUCTION ............................................................................................................ 11
A) Mollicutes ..................... 11
1. Taxonomie .................... 11
2. Phylogénie ................................................................................................ 14
3. Les mollicutes phytopathogènes .................................................. 16
a) Les spiroplasmes phytopathogènes .......... 17
(1) Spiroplasma citri ................................................................................................ 17
(a) Maladie du stubborn des agrumes et découverte de S. citri ........................... 17
(b) Cycle biologique ............................. 17
(c) Caractéristiques de S. citri .............................................................................. 21
(d) Déterminants génétiques de la transmission de S. citri .. 22
(i) La spiraline .................................................................................................. 22
(ii) La protéine Sc76 ......................... 22
(iii) Les protéines codées par les plasmides pSci1-6 ........ 23
(2) Les autres spiroplasmes phytopathogènes : S. kunkelii et S. phoeniceum .......... 23
b) Les phytoplasmes ..................................................................................................... 23
B) Eléments génétiques mobiles ....................... 25
1. Généralités .................................................................................................................... 25
2. Eléments mobiles et transposables dans la classe des Mollicutes ................................ 26
a) Séquences d’insertions ............................. 26
(1) Généralités sur les séquences d’insertion ........................................................... 26
(2) Caractéristiques des séquences d’insertion de mollicutes .................................. 27
(3) Séquences d’insertion dans les génomes séquencés de mollicutes .................... 31
b) ICE ........................................................................................... 34
(1) Généralités sur les ICE ....................................................... 34
(2) Caractéristiques des ICE de mollicutes .............................. 35
(3) ICE présents dans les génomes séquencés de mollicutes ................................... 36
c) SVM et PMU ............................................................................ 37
(1) Caractéristiques des SVM/PMU ......... 37
(2) PMU présents dans les génomes de phytoplasmes ............................................. 38
(a) ‘Ca. P. asteris’ AY-WB .................................................. 38
(b) Phytoplasme de l’Onion Yellows (OY) .......................................................... 39
(c) ’Candidatus phytoplasma mali’ ...................................... 39
(d) us phytoplasma australiense’ 39
d) Bactériophages et prophages .................................................................................... 39
(1) Généralités sur les bactériophages ...... 39
(2) Caractéristiques des virus de mollicutes ............................. 40
(3) Principaux virus de mollicutes séquencés .......................................................... 41

(a) Mycoplasma pulmonis virus P1 (Podoviridae) ............................................... 41
(b) Mycoplasma arthritidis MAV1 ...................................... 41
(c) SpV1 (Inoviridae) ........................................................... 42
(d) SVTS2 (Inoviridae) ........................................................ 43
(e) SpV4 (Microviridae) ....................... 44
e) Plasmides .................................................................................. 45
(1) Généralités sur les plasmides .............................................. 45
(a) Définition ........................................................................ 45
(b) Réplication ...... 46
(i) Théta ............................................ 46
(ii) Cercle roulant ............................................................................................. 47
(c) Contrôle du nombre de copie .......... 47
(d) Stabilisation .................................... 48
(i) Résolution des multimères .......................................... 48
(ii) Systèmes de partition actifs ........ 49
(iii) Toxine-antitoxine ...................................................... 52
(e) Incompatibilité ................................................................ 52
(i) Incompatibilité liée à la réplication ............................. 53
(ii) Incli à la partition ................................ 53
(f) Conjugaison et mobilisation ............................................ 54
(2) Caractéristiques des plasmides de mollicutes ..................... 56
(3) Plasmides séquencés chez les mollicutes ........................................................... 56
(a) Plasmides de mycoplasmes ............................................. 56
(b) Plasmides de phytoplasmes ............................................ 57
(c) Plasmides de spiroplasmes .............. 59
(i) Caractéristiques générales ........... 59
(ii) Plasmides de Spiroplasma citri GII3.......................................................... 59
(iii) Plasmides pSci et cycle infectieux ............................ 62
C) Objectifs des recherches et présentation da la thèse .................... 63
II. RESULTATS .................................................................................................................. 64
A) Réplication et stabilité des plasmides pSci .................................................................. 64
1. Réplication du pSci2 .................................... 64
a) Identification de la région de réplication du pSci2 .................................................. 64
b) La CDS pE code une protéine de réplication ........................... 66
c) Les protéines PE des plasmides pSci ....................................... 68
2. Stabilité et système de partition du pSci2 .................................... 69
a) Stabilité in vitro ........................................ 69
b) Stabilité in vivo ........................................ 71
c) Rôle de soj dans la stabilité ségrégationnelle des pSci ............................................ 76
3. Phylogénie des plasmides pSci .................................................... 79
4. Distribution et spectre d’hôte des pSci ......... 81
a) Distribution des pSci dans le genre Spiroplasma ..................................................... 81

b) Utilisation de dérivés des pSci comme vecteurs d’expression ................................ 84
5. Incompatibilité des plasmides pSci .............................................. 85
B) Plasmides pSci et cycle infectieux ............................................... 89
1. Rôle du pSci6 dans la transmission .............. 89
a) Caractère essentiel du pSci6 ..................................................... 89
b) Caratérisation des déterminants du pSci6 ................................................................ 91
(1) Approche « gènes candidats » ............ 91
(2)oche par délétions successives ... 92
(i) Etudes de transmission dans la souche 44 ................................................... 92
(ii) Etudes de transmission dans la souche GII3 .............. 94
2. Phénotype d’acquisition des souches 44/6, Alcanar 254 et G/6 .................................. 95
C) Outils génétiques .......................................................................... 97
1. Expression conditionnelle par le système TetR/tetO ................................................... 97
a) Induction par la tétracycline de l’expression de la spiraline chez S. citri GII3-9a3 99
b) Intégration stable du plasmide pXTST dans le chromosome de S. citri GII3-9a3. 100
c) Expression inductible du gène de la spiraline chez la cicadelle vectrice Circulifer
haematoceps ............................................................................................................... 101
d) Expressie du gène de la spiraline in planta ........ 102
e) Expression inductible du gène dealine chez Mycoplasma agalactiae ........ 103
2. Linéarisation in vivo par l’enzyme I-SceI .................................................................. 105
a) Élimination d’un plasmide pSci par l’expression de la méganucléase I-SceI dans la
souche 44 .................................................................................................................... 105
b) Construction d’une souche dépourvue de pSci6 107
III. DISCUSSION ET PERSPECTIVES .................. 109
A) Les plasmides pSci constituent une nouvelle famille de plasmides ........................... 109
B) Stabilité et partition des plasmides pSci ..................................................................... 111
C) Incompatibilité ........................................... 114
D) Rôles des plasmides pSci dans le cycle infectieux de S. citri .... 116
E) Nouveaux outils pour l’étude des spiroplasmes ......................................................... 120
IV. CONCLUSION .............................................................................. 124
V. MATERIELS ET METHODES ........................ 125
A) Matériel microbiologique ........................................................................................... 125
1. Escherichia coli : souches et conditions de culture.................... 125
2. Spiroplasmes : souches et conditions de culture ........................ 125
3. Mycoplasmes s et conditions de culture ....................................................... 126
4. Plasmides à disposition au début de ce travail ........................... 128
a) Le plasmide pBS+ .................................................................. 128
b) Lede pBOG ................................ 128
c) Les plasmides pSR2 et pSRT1 et pSRT2 ............................... 129
d) Le plasmide pMT85 129
e) Plasmides dérivés des pSci ..................................................................................... 129
5. Plasmides construits au cours de ce travail ................................ 130

a) Les plasmides pBOGS, pSTR, pXTS, pXTST et pXTSTO ................................... 130
(voir Fig. 38) .............................................................................. 130
b) Le plasmide pMT85-XTST (voir Fig. 38) ............................................................. 130
c) Lede pBI ..... 130
d) Le plasmide pSRT-I ............................................................... 131
e) Les plasmides pSci6PT-I et pSci1NT-I .................................. 131
f) Les plasmides pSci6 P32 et pSci6354 ................................ 131
g) Les plasmides pSci6B, pSci6N, pSci6BN, pSci6BA et pSci6BAX (voir Fig. 37 et
Tableau XV) ............................................................................................................... 131
h) Le plasmide 21NTΔSoj .......................... 132
i) Les plasmides pFL3, pFL4, pFL5, pFL6 et pFL7 .................. 132
j) Les plasmides pBSFL6 et pSDE1 ........... 133
k) Les vecteurs d’expression de la protéine p32 : pBSP32R et pNAB32H ............... 133
l) Les plasmides pMBRE, pMBRΔE1, pMBRΔE2 et pSci1NTΔS ........................... 133
6. Transformation des bactéries et sélection des transformants ..................................... 134
a) Transformation d’Escherichia coli ........................................ 134
(1) Préparation des cellules électro-compétentes et électroporation ...................... 134
(2) Transformation de Spiroplasma citri par électroporation ................................ 134
(3) Transformation de Mycoplasma agalactiae par électroporation 135
7. Préparation et manipulation de l’ADN ....................................... 136
a) Extraction de l’ADN génomique de Spiroplasma citri .......................................... 136
b) Extraction d’ADN plasmidique ............. 136
c) Dosage de l’ADN ................................................................... 136
d) Modification enzymatique de l’ADN .... 137
(1) Hydrolyse par des endonucléases de restriction ............................................... 137
(2) Le fragment de Klenow .................................................... 137
e) Analyse des fragments de restriction par électrophorèse sur gel d’agarose ........... 137
f) Purification d’ADN à partir d’un gel d’agarose ..................................................... 138
g) Amplification des fragments d’ADN par PCR ...................... 138
(1) Choix des amorces ............................................................ 138
(2) ADN polymérases ............................................................. 139
h) Purification des produits PCR ................................................ 139
i) Clonage de fragments d’ADN dans les vecteurs de recombinaison ....................... 139
(1) Préparation des vecteurs ................................................... 139
(2) Préparation des fragments d’ADN à cloner ...................... 140
(3) Insertion des fragments d’ADN dans les vecteurs ............ 140
j) Hybridation ADN / ADN sur support solide .......................................................... 142
(1) Transfert des fragments d’ADN sur membranes de nylon ............................... 142
(2) Synthèse de sondes marquées à la digoxygénine ............................................. 142
(3) Conditions d’hybridation et révélation ............................................................. 142
8. Préparation et analyse des protéines ........... 144
a) Western Blot ........................................................................................................... 144
(1) Préparation des protéines .................. 144
(2) Séparation deines par électrophorèse en gel d’acrylamide .................... 144

(3) Electrotransfert des protéines sur membrane de nitrocellulose ........................ 145
b) Dot blot .................................................................................................................. 146
(1) Préparation des échantillons pour dot Blot ....................... 146
(2) Transfert par aspiration sous vide ..................................................................... 146
c) Détection immunologique des protéines sur membrane ........ 147
d) Immunofluorescence .............................................................. 147
9. Analyse informatique des données ............................................................................. 148
a) Analyse des séquences d’acides nucléiques ........................... 148
(1) Analyse des chromatogrammes ........ 148
(2) Recherche de motifs ......................................................................................... 148
b) Analyse des séquences protéiques ......................................................................... 148
(1) Recherche de domaines .................... 148
(2) Alignements multiples et analyses phylogénétiques ........ 149
B) Transmission expérimentale de Spiroplasma citri à la pervenche de Madagascar
Catharanthus roseus .......................................................................................................... 149
1. Les plantes d’élevage et de transmission ... 149
2. L’insecte vecteur, Circulifer haematoceps . 149
3. Micro-injection intra-abdominale des cicadelles pour la transmission ...................... 150
4. Transmission à la pervenche de Madagascar ............................................................. 150
a) Période de transmission chez la pervenche ............................ 150
b) Détermination du titre en spiroplasmes dans les insectes ...................................... 150
c) Symptomatologie et quantification des spiroplasmes dans la plante ..................... 151
(1) Suivi et notation des symptômes ...................................... 151
(2) Mise en culture et détermination du titre des spiroplasmes à partir de nervures de
plantes ..................................................................................................................... 151
VI. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES............. 152


LISTE DES PUBLICATIONS ET COMMUNICATIONS

Articles de périodique
Breton, M.; Duret; S.; Danet, JL.; Renaudin, J. Plasmid curing/replacement through
incompatibility revealed sequences essential for transmission of Spiroplasma citri by its
leafhopper vector Circulifer haematoceps. Applied and Environmental Microbiology. 2010
(sous presse).
Breton, M.; Sagné E.; Duret S.; Béven L.; Citti C.; Renaudin J. First report of a tetracycline-
inducible gene expression system for mollicutes. Microbiology SGM. 2010 (sous presse).
Breton, M.; Duret, S.; Arricau-Bouvery, N.; Beven, L.; Renaudin, J. Characterizing the
replication and stability regions of Spiroplasma citri plasmids identifies a novel replication
protein and expands the genetic toolbox for plant-pathogenic spiroplasmas. Microbiology
SGM. 2008, 154 (10): 3232-3244.
Breton, M.; Duret, S.; Berho, N.; Renaudin, J. Spiroplasma-host relationships: plasmids and
insect-transmission of Spiroplasma citri. Journal of Plant Pathology. 2008, 90 (2
Supplement) : 51.
Coustou, V.; Biran, M.; Breton, M.; Guegan, F.; Rivière, L.; Plazolles, N.; Nolan, D.; Barrett,
MP.; Franconi, JM.; Bringaud, F.; Glucose-induced remodeling of intermediary and energy
metabolism in procyclic Trypanosoma brucei. Journal of Biological Chemistry. 2008,
283(24): 16342-54.
Communications à un congrès
Breton, M.; Duret Nurbel, S.; Renaudin, J. Caractérisation fonctionnelle des plasmides pSci
de Spiroplasma citri - Rôle dans la transmission du spiroplasme par son insecte vecteur.
[Poster ]. 8. Rencontres plantes-bactéries, 14 au 18 janvier 2008, Aussois (France).
Breton, M.; Duret Nurbel, S.; Renaudin, J. Replication and stability analyses of Spiroplasma
citri plasmids identify a novel replication protein and provide an incompatibility based
strategy enabling the identification of plasmid encoded determinants involved in transmission
by the leafhopper vector. [Communication orale récompensée par le prix Robert Whitcomb].
ème17 congrès de l’IOM, 6 au 11 juillet 2008, Tianjin (Chine).
Breton, M.; Duret Nurbel, S.; Renaudin, J. Dissection moléculaire d’une famille de réplicons
chez Spiroplasma citri : de la séquence au phénotype. [Poster]. Journée Scientifique de
l'Ecole Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé, 16 avril 2008, Arcachon (France)
Breton, M.; Duret Nurbel, S.; Renaudin, J. Origine de réplication et incompatibilité des
èmeplasmides pSci de Spiroplasma citri : description et applications. [Communication orale]. 7
Rencontre francophone de mycoplasmologie, 17 et 18 juillet 2007, Lyon (France).

Distinction
Prix Robert Whitcomb de la meilleure communication orale dans le domaine des mollicutes
èmede plantes et d’insectes. 17 congrès de l’IOM, 6 au 11 juillet 2008, Tianjin (Chine).

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