Modélisation pathologique des maladies monogéniques par l'utilisation des cellules souches embryonnaires humaines : preuve de concept appliquée à la dystrophie myotonique de type 1, Pathological modeling of monogenic diseases using human embryonic stem cells : proof of concept applied to myotonic dystrophy type 1

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Sous la direction de Geneviève Piétu
Thèse soutenue le 13 octobre 2010: Evry-Val d'Essonne
Parmi leurs applications prometteuses, les lignées de cellules souches embryonnaires humaines (hES) présentent un potentiel inestimable pour améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement de maladies monogéniques. Cette application de modélisation pathologique est devenue possible grâce à l’utilisation de lignées hES porteuses de la mutation causale d’une maladie monogénique, obtenues au cours d’un diagnostique pré-implantatoire. L’équipe dans laquelle j’ai effectué mes travaux de thèse a démontré que des lignées hES et leurs progénies, porteuses de la mutation causale de la dystrophie myotonique de type 1 (DM1), exprimaient des défauts moléculaires caractéristiques de la pathologie, permettant ainsi leur analyse de façon plus pertinente par rapport à des cultures primaires dérivées de biopsies de patients et validant l’utilisation de ce modèle cellulaire. Dans ce contexte, dans la première partie de mon travail de thèse, mon objectif a été de mettre au point des conditions de culture permettant la différenciation des cellules hES normales et mutantes vers le lignage neural afin d’obtenir des populations homogènes de progéniteurs neuraux et de cellules souches neurales, puis de les caractériser sur le plan phénotypique et fonctionnel. Par une étude transcriptomique, j’ai ensuite comparé le profil d’expression de ces progéniteurs neuraux à une autre population homogène de précurseurs mésenchymateux. J’ai ainsi identifié des gènes et des voies de signalisation spécifiques à chacune de ces populations. (Article 1). Dans la seconde partie de mes travaux, ma contribution au projet de modélisation pathologique de DM1 a été d’utiliser ces progéniteurs neuraux et les cellules souches neurales mutés pour explorer les mécanismes physiopathologiques responsables des symptômes neurologiques observés dans cette pathologie. J’ai ainsi identifié une anomalie dans une voie de signalisation cellulaire perturbée, la voie la voie mTORC1, basée sur l’observation selon laquelle les cellules NSC porteuses de la mutation DM1 proliféraient plus lentement que les cellules contrôles (Article II). J’ai également étudié l’expression la protéine Tau, connue pour son implication dans la maladie d’Alzheimer, et mis en évidence des modifications suggérant une altération du transport axonal dans les neurones issus des lignées hES mutantes. Ces résultats, associés à ceux réalisés dans l’équipe, permettent d’apporter la preuve de concept de l’intérêt d’un tel modèle cellulaire pour la modélisation pathologique des maladies monogéniques.
-Modélisation pathologique
Among their promising applications, human embryonic stem cells lines (hES) have huge potential to improve the understanding of molecular and cellular mechanisms involved in the development of monogenic diseases. This application of modeling pathologic became possible using hES cell lines carrying the causal mutation of a monogenic disease, obtained during pre-implantation diagnosis. The team where I did my thesis work demonstrated that hES cell lines and their progeny, carrying the causal mutation in myotonic dystrophy type 1 (DM1), expressing the molecular defects characteristic of the pathology, allowing more relevant analysis than primary cultures derived from biopsies of patients and validates the use of this cell model. In this context, in the first part of my thesis, my goal was to develop culture conditions for hES cell differentiation into normal and mutant neural lineage in order to obtain homogeneous populations of neural progenitors and neural stem cells and to characterize their phenotypic and fonctional preperties. Next, using a transcriptomic method, I compared the expression profile of neural progenitors to another homogeneous population of mesenchymal precursors. Thus, I identified genes and signaling pathways specific to each of these populations. (Article 1). In the second part of my work, my contribution to the pathological modeling of DM1 was to use these mutant neural progenitor cells and neural stem cells to explore the pathophysiological mechanisms involved in neurological symptoms observed in this pathology. Thus, I have identified a cell signaling pathway defects in mTORC1 pathway based on the observation that NSC cells carrying DM1 mutation proliferated more slowly than control cells (Article II).At last, I also studied the expression of Tau protein, a protein involved in Alzheimer’s disease and I have highlighted changes suggesting impairement of axonal transport in neurons derived from hES cell lines mutant. These results, together with those performed in the team, can provide proof of concept for the benefit of such a cell model for modeling disease monogenic diseases.
-Pathological modeling
Source: http://www.theses.fr/2010EVRY0042/document
Publié le : lundi 31 octobre 2011
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UNIVERSITE D’EVRY VAL D’ESSONNE
Ecole doctorale « Des génomes aux organismes »

THESE
Présentée pour l’obtention du titre de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE D’EVRY VAL D’ESSONNE
Mention « Biologie Cellulaire et Moléculaire »
par
Jérôme Alexandre DENIS

Modélisation pathologique des maladies monogéniques par l’utilisation
des cellules souches embryonnaires humaines
Preuve de concept appliquée à la Dystrophie Myotonique de type 1



Soutenue le 13 Octobre 2010 au Génopole d’Evry, devant le jury composé de :

Pr Philippe Manivet, Président du jury.
Dr Geneviève Gourdon, Rapporteur.
Dr Marie-Claude Potier, Raur.
Dr Nicolas Sergeant, Examinateur.
Dr John De Vos, Examinateur.
Dr Geneviève Pietu, Directeur de thèse.


























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Liste des abréviations
AAV : adeno-associated virus
ADN=DNA : Acide désoxyribonucléique
AFM : Association française contre les myopathies
Ago: Argonaute
AMP: Assistance médicale à la procréation
AMPc: Cyclic adenosine mono- phosphate
APP : amyloid precursor protein
ARNm=mRNA: Acide ribonucléique messager
ATM: artificial trans-splicing molecules
ATP: Adénosin triphosphate
bFGF: Fibroblast growth factor basique
BMP4: Bone morphogenetic protein 4
BMPs: Bonenetic proteins
BrdU: Bromodeoxyuridine
CELF : CUGBP, ETR-like family
CLCN-1 : canal chlore
CMH: complexe majeur d’histocompatibilité
Co-Smads: Common mediator Smads
c-TNT : cardiac Troponin
CYP : Cytochrom P540
DMEM: Dubecco’s modification of Eagle’s medium
DM1 : Dystrophie Myotonique de type I
DM2 : Dystrophie myotonique de type II
DMPK : Dystrophia myotonica protein kinase
DPI : Diagnostic pré-implantatoire
EB: Embryoïd body
EGF: Epidermal growth factor
EGFR: Recepteur à l’EGF
3





























4
ES: Embryonic stem cells
FACS: Fluorescent-activated cell sorting
FDA: Food and Drug Administration
FGFs: Fibroblast growth factors
FISH : Fluorescent In Situ Hybridization
FIV : Fécondation In Vitro
FMN1 : Survival Motor Neuron-1
GFAP : Glial fibrillary acidic protein
GFP : Green Fluorescent Protein
GMP: Good manufacturing practice
hES: Human embryonic stem cells
LRHSA : Human skeletal actine long repeat
HTS: High-throughput screening
Id: Inhibitor of differentiation
IGF2: Insulin-like growth factor 2
IGFBP3: Insulin-like growth factor binding protein 3
INSR : Insulin Receptor
iPS: Induced pluripotent stem cells cellules
JAK : Janus actived kinase
KLF4 : Krüppel-like factor 4
KO: Knock out
KSR: Knock-out serum replacement
LIF : Leukemia inhibitor factor
MAPT : Microtubule associated protein Tau
MCI: Masse cellulaire interne
MDR: Multidrug resistance
MEFs: Mouse Embryo Fibroblasts
mES: mouse embryonic stem cells
MSC: Mesenchymal stem cells
5





























6
NCSC: Neural crest stem cells
NCAM: Neural cell adhesion molecule
NEPs: Cellules neuro-epithéliales
NO: Monoxyde d’Azote
NPC: Neuroepithelial progenitors
NSC : Neural stem cells
OCT-3/4: Octamer-3/4
PAX: Paired box
PcG: Polycomb group
PCR: Polymerase Chain reaction
PGD : Pre-implantation Genetic Diagnosis
POU: (Pit-oct-unc-domain)- transcription factor
POU5F1: POU class 5 homeobox 1
qPCR: PCR quantitative
RISC: RNA induced silencing complex
RPE: Retinal pigmentary epithelium
R-Smads: Receptor regulated Smads
SDIA: Stromal cell-Derived Inducing Activity
Shh: sonic hedgehog
siARNs: Petits ARNs interférent.
Smads: Mothers against decapentaplegic homolog
SNC: système nerveux central
Sox2: SRY-related HMG-box gene 2
SRF: serum response factor
SRY: Sex determining factor
SSEA: Stage Specific Embryonic Antigen
SVF: Sérum de veau foetal
TERT: Telomerase reverse transcriptase
TGFβ: Transforming growth factor β
7





























8
TRA-1-60/1-81: Teratocarcinoma recognition rejection antigens 1-60/ 1-81
TrxG: Trithorax group
UE: Union Européenne
UTR: UnTranslated Region
UV: Ultraviolets
Wnt: Wingless integration site






















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