Modification de la synthèse des furocoumarines chez Ruta graveolens L. par une approche de génie métabolique, Functional exploration of the biosynthesis pathway of phenylpropanoids of Ruta graveolens by metabolic engineering

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Sous la direction de Frédéric Bourgaud, Alain Hehn
Thèse soutenue le 12 novembre 2008: INPL
La rue officinale (Ruta graveolens L) est une plante connue comme étant particulièrement riche en métabolites secondaires et produisant notamment des molécules d’intérêt pharmaceutique comme les furocoumarines. Nous avons tenté par une approche de génie métabolique d’augmenter la teneur en furocoumarines produites dans les plantes. La mise en place de telles approches nous a également permis de mieux comprendre les mécanismes de régulation de la voie de biosynthèse des phénylpropanoïdes. Pour atteindre ces objectifs nous avons transformé la rue avec différents gènes placés sous le contrôle d’un promoteur constitutif fort, le promoteur 35S du CaMV. Pour chaque série de transformants nous avons étudié la teneur en furocoumarines et analysé les variations de composés phénylpropanoïdes (rutine, umbelliférone, ferulate, scopolétine). Parallèlement à cette analyse métabolique, une corrélation a été réalisée avec le niveau d’expression des transgènes et de certains endogènes par l’utilisation d’approche de PCR quantitative. Les séries de plantes transgéniques surexprimant les gènes codants pour la Coumaroyl ester 3’-Hydroxylase de rue (CYP98A22) et d’A. thaliana (CYP98A3) présentent toutes les deux une augmentation significative d’une facteur 3 de la teneur en furocoumarines. Par contre si les premières sont caractérisées par une diminution de la production en rutine et en umbelliférone, les secondes présentent une augmentation importante de la teneur en Scopolétine et en umbelliférone. Ces résultats suggèrent la coexistence de deux C3’H chez R. graveolens ayant des fonctions différentes, l’une d’entre elles étant impliquée directement ou non dans la synthèse de scopolétine. Si la transformation génétique de rues avec des gènes de la famille CYP98A induit des modifications du métabolisme secondaire, la surexpression d’un gène spécifique à la voie de biosynthèse des furocoumarines (gène cyp71AJ1, codant pour la psoralène synthase d’A. majus) permet d’augmenter uniquement la teneur en furocoumarines (X4). L’ensemble de ces travaux a permis de montrer l’intérêt d’une approche de génie métabolique pour générer des plantes présentant un intérêt potentiel pour la production de molécules d’intérêts pharmaceutiques
-Furocoumarines
-Psoralène Synthase (PS)
-Coumaroyl 3’-Hydroxylase (C3’H)
-Cinnamate 4-Hydroxylase (C4H)
-Génie métabolique
-Transformation génétique
-Ruta graveolens
-Phénylpropanoïdes
-Psoralène
Garden Rue (Ruta graveolens L.) is a plant known as being particularly rich in secondary metabolites and in particular producing molecules of pharmaceutical interest like furocoumarines. By the use of a metabolic engineering approach, we tried to increase the content of furocoumarines produced in these plants but also to better understand the regulation mechanisms of the phenylpropanoïd biosynthesis pathway. To achieve these goals we transformed Ruta plants with various genes placed under the control of a strong constitutive promoter, CaMV 35S promoter. The plants we obtained were analyzed for their ability to overproduce furocoumarines but also other phenylpropanoïds like ferulate, umbelliferone, scopoletine or rutin. Using Real Time PCR experiments, a correlation was carried out with the level of expression of each transgene and several endogenous genes. Plants overexpressing either the Ruta or the Arabidopsis Coumaroyl ester 3 '-Hydroxylase (CYP98A22 and CYP98A3 respectively) display both a significant increase (3 time level) of the furocoumarin. However if the S-98A22 plants are characterized by a reduction in the production of rutin and umbelliferone, S-98A3 transgenic plants display a significant increase scopoletine and umbelliferone content. These results suggest the coexistence of two C3'H having different functions in Ruta. One of them might be involved more specifically in the synthesis of scopoletine. If the transformation of Ruta with genes belonging to the CYP98A family generates an enlarged of the secondary metabolism, we also showed that the overexpression of a gene belonging to the furocoumarins biosynthesis pathway (CYP71AJ1, the psoralen synthase) allowed a specific stimulation. Indeed a 4 time increase of the content of furocouramins was noticed in these transgenic plant lines. This work made it possible to make evidence of the interest of a metabolic engineering approach to generate plants of interest for the production of pharmaceutical molecules
-Furocoumarins
-Psoralen Synthase (PS)
-Coumaroyl 3’-Hydroxylase (C3’H)
-Cinnamate 4-Hydroxylase (C4H)
-Psoralen
-Phenylpropanoïds
-Ruta graveolens
-Genetic transformation
-Metabolic engineering
Source: http://www.theses.fr/2008INPL070N/document
Publié le : mercredi 26 octobre 2011
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UMR 1121, INPL-INRA, RP2E
LABORATOIRE AGRONOMIE ET ENVIRONNEMENT

THESE



MODIFICATION DE LA SYNTHESE DES

FUROCOUMARINES CHEZ Ruta graveolens L. PAR

UNE APPROCHE DE GENIE METABOLIQUE




Présentée pour l’obtention du titre de


Docteur de l’INPL
En Sciences Agronomiques

Par

Sébastien DOERPER


Soutenue le 12 novembre 2008, devant le jury composé de :

M. F. Bourgaud Professeur, ENSAIA-INPL, Nancy Examinateur
M. A. Hehn Maître de conférence, ENSAIA-INPL Nancy Examinateur
Mme D. Werck-Reichhart Directeur de recherche, ULP-IBMP, Strasbourg Rapporteur
M. B. Saint-Pierre Professeur, UFR, Tours Rapporteur
M. E. Gontier Professeur, UPJV, Amiens Invité
Mme D. Laurain-Mattar Professeur, Faculté de Pharmacie, Nancy Invitée
Remerciements
Remerciements

Les travaux présentés dans ce mémoire ont été réalisés au sein de l'UMR 1121,
Laboratoire Agronomie et Environnement Nancy Université - INRA Nancy-Colmar.

Je tiens tout d'abord à remercier Monsieur Sylvain Plantureux, Professeur à l’ENSAIA
et Directeur de l'UMR 1121, de m’avoir acceuilli dans son laboratoire de recherche.

Je remercie les chercheurs qui ont accepté de participer au jury de cette thèse :
Madame Danièle Werk-Reichhart, Directeur de recherche CNRS à l'Institut de Biologie
Moléculaire des Plantes de Strasbourg et Monsieur Benoît Saint-Pierre, Professeur à
l'Université Francois Rabelais de Tours, qui seront les rapporteurs de cette thèse. Je remercie
également Madame Dominique Laurrain-Mattar, Professeur à la Faculté de Pharmacie de
Nancy, qui a accepté de participer à cette soutenance en tant qu’invitée. J’attends leurs
critiques et leurs jugements sur ce travail de recherche.

Je tiens plus particulièrement à remercier Monsieur Frédéric Bourgaud, Professeur à
l’ENSAIA et Directeur de thèse. Je le remercie de la confiance qu'il m'a témoignée en me
prenant comme thésard. Merci d'avoir réuni les conditions nécessaires au bon déroulement de
mes travaux.

Je tiens à exprimer toute ma gratitude au Docteur Alain Hehn, maître de conférence à
l'ENSAIA et co-directeur de thèse. Je le remercie de la confiance qu’il m’a accordée tout au
long de ma thèse. Merci pour la disponibilité, l’écoute, l’aide et le soutien moral dont il a fait
preuve à mon égard. Je ne le remercierai jamais assez pour toute l’énergie et le temps qu’il a
consacré à corriger ce manuscrit.

3 Remerciements
Je remercie Monsieur Eric Gontier, Professeur à l’Université de Picardie Jules Verne
d’Amiens pour son soutien moral lorsqu’il était encore sur Nancy. Je le remercie de s’être
autant impliqué et de la grande disponibilité dont il a fait preuve.

Je remercie toutes les personnes (Stéphanie, Stéphane, Serge et les autres dont j’ai
oublié le prénom) qui ont participé de près ou de loin à mes travaux. Merci à Monsieur
Bertrand Aigle de m’avoir permis d’utiliser la PCR en temps réel située à la Faculté des
Sciences de Vandoeuvre-les-Nancy. Merci à Stéphane Hacquard pour l’aide qu’il me donne à
chaque fois que je vais faire une PCR quanti à Champenoux. Je tiens également à adresser
mes remerciements à Madame Catherine Lapierre (INRA Paris-Grignon) pour avoir réalisé
les analyses de lignines de rue.

Je voudrais simplement exprimer mes remerciements à toutes les personnes travaillant
au laboratoire pour avoir su entretenir une ambiance remarquable. Merci à Thamara, Mina,
Martine, Bernard, Christophe, Sophie et toute l’équipe que je ne cite pas en entier (par peur
d’en oublier un). Je n’oublie pas les thésards qui se sont succédés ces 4 années passées (Minh,
Romain, Sébastien, Boris, Dao, Robert, Camille, Mickael, Lama, Flore, Etienne et le petit
nouveau Guilhem. Merci à Sissi et Etienne, collègues de bureau, qui mettent une ambiance
extraordinaire (surtout Sissi qui fait le singe en face de moi). Je manquerais à tous mes
devoirs si je ne parlais pas de Christelle, Amandine, μseb et Serge avec qui on a passé une
année exceptionnelle à rire, rire et rire.

Je fais une spéciale dédicace à Emmanuelle Personneni, qui suite à notre aventure, a
donné naissance à notre enfant Pipo. J’espère qu’elle nous reviendra un jour de Caen (les gens
sont plutôt spéciaux par là bas). Merci à Flore Biteau d’avoir été mon alliée et confidente
pendant les périodes sombres et difficiles (surtout la fin de thèse).

Je remercie mes fidèles amis, Christelle, Séverine, Christine, Pàl, Jean-Luc, Nao,
Vincent, Murielle, Michel, qui ont toujours été présents dans les moments importants de ma
vie. Pourvu que ça dure !

4 Remerciements
Je remercie également mes « vieux amis » de fac qui sont là depuis mes débuts à
Nancy. Merci à Pascaline, Laetitia, Marie, Céline et leur conjoint respectifs qui me suivent
depuis le DEUG. Merci à Julie, Caroline et Elyette mes amies biochimistes.

Je tiens également à saluer mes collègues du Centre Antipoison de Nancy et de
Toxicovigilance qui m’ont accueuilli au sein de leur service. Merci au Docteur Luc Ferrari.

Je voudrais aussi saluer mes jeunes amis « bébés Apothicaires » (Charlotte la poliotte,
Coralie, les Malvaceae, Maître Duval) qui m’ont accepté au sein de la prestigieuse famille des
Pharmaciens.

Je garde le meilleur pour la fin. Merci à toute ma famille (parents, beaux parents, frère,
oncles, tantes, cousins, cousines, …..et mon filleul) de me donner tout leur amour et leur
confiance, ce en quoi, rien de tout cela n’aurait été possible. Malgré les joies, les tristesses et
toutes les difficultés de la vie quotidienne, la famille reste le sanctuaire où l’on peut se
ressourcer. Je remercie aussi ma belle famille qui m’a accueilli en son sein. Je suis
éternellement reconnaissant envers mes beaux parents d’avoir su trouver les arguments pour
me motiver à reprendre des études en Pharmacie.

Et enfin, je souhaite dédicacer ce travail de thèse à deux personnalités exceptionnelles
qui ont pris chacune une place importante mais différente dans ma vie. En premier lieu, je
remercie ma défunte grand-mère d’avoir contribué à mon éducation et d’avoir fait de moi ce
que je suis. En second lieu, la personne qui mérite le plus de figurer dans ce manuscrit n’est
autre que Thomas. Au fil des années il a su m’épauler, me soutenir, me guider dans mes choix
tant personnels que professionnels. Ne lui parlez surtout plus de Ruta graveolens, de
furocoumarines ou de plantes génétiquement transformées, il en a assez entendu et lu pour
une paire d’années.
5
Table des matières
Table des matières
Table des matières ____________________________________________________ 1
Table des figures et tableaux ____________________________________________ 7
Abbréviations _______________________________________________________ 11
Nom vernaculaire des espèces citées _____________________________________ 13
Chapitre I : Synthèse bibliographique ____________________________________ 15
1 Les Furocoumarines ________________________________________________ 15
1.1 Les furocoumarines : généralités ____________________________________________ 15
1.1.1 Structures générales et propriétés physicochimiques ______________________ 15
1.1.2 Distribution dans le règne végétal______________________________________ 16
1.1.3 Rôles écologiques des furocoumarines __________________________________ 17
1.1.4 Propriétés biologiques des furocoumarines ______________________________ 18
1.1.4.1 Réactivités avec les acides nucléiques _________________________________ 18
1.1.4.2 Réactivité avec les lipides ___________________________________________ 20
1.1.4.3 Réactivité avec les protéines _________________________________________ 21
1.1.4.4 Inhibition enzymatique _____________________________________________ 21
1.1.4.5 Photooxydation ___________________________________________________ 22
1.1.5 Les furocoumarines linéaires en thérapeutique __________________________ 22
1.2 Les furocoumarines linéaires: voie de biosynthèse et localisation au sein de la plante ___ 23
1.2.1 Voie des phénylpropanoïdes __________________________________________ 23
1.2.2 Biosynthèse des furocoumarines linéaires _______________________________ 26
1.2.3 Régulations de la voie de biosynthèse ___________________________________ 29
1.2.3.1 Elicitations de la biosynthèse ________________________________________ 30
1.2.3.2 Régulations au niveau transcriptionnel ________________________________ 30
1.2.3.3 Régulations post-transcriptionnelles et rétrocontrôles enzymatiques _______ 31
2 Ruta graveolens L. __________________________________________________ 32
2.1 Description botanique ____________________________________________________ 32
2.2 Localisation et stockage des furocoumarines ___________________________________ 34
2.3 Intérêt du modèle Ruta graveolens pour la production de furocoumarines ____________ 35
2.3.1 Production en champ ________________________________________________ 36
2.3.2 Cultures in vitro ____________________________________________________ 37
3 Les cytochromes P450 _______________________________________________ 39
3.1 Cytochromes P450 : généralités_____________________________________________ 39
3.1.1 Définition _________________________________________________________ 39
3.1.2 Classification ______________________________________________________ 40
Tables des matières
3.1.3 Nomenclature ______________________________________________________ 41
3.1.4 Structure __________________________________________________________ 42
3.1.5 Relation structure activité ____________________________________________ 43
3.1.5.1 Cycle catalytique et pouvoir réducteur des P450 monooxygénases de type II _ 43
3.1.5.2 Inactivation autocatalytique _________________________________________ 44
3.2 Fonctions des P450 végétaux _______________________________________________ 46
3.2.1 Rôles des P450 dans les voies de biosynthèse _____________________________ 46
3.2.2 P450 et métabolisation de xénobiotiques ________________________________ 46
3.3 Cytochromes P450 clés dans la voie de biosynthèse des phénylpropanoïdes _________ 48
3.3.1 La cinnamate 4-hydroxylase __________________________________________ 49
3.3.2 La coumaroyl ester 3’-hydroxylase ____________________________________ 50
3.3.3 La psoralène synthase _______________________________________________ 51
4 La transformation génétique chez les végétaux supérieurs ________________ 52
4.1 Les différentes techniques de transformations __________________________________ 52
4.1.1 Les méthodes de transferts directs _____________________________________ 52
4.1.1.1 Par biolistique / agrolistique ________________________________________ 52
4.1.1.2 Par micro-injection ________________________________________________ 53
4.1.1.3 Par électroporation ________________________________________________ 53
4.1.1.4 Par lipofection ____________________________________________________ 53
4.1.2 Les méthodes de transferts indirects ___________________________________ 54
4.2 Mécanisme naturel de transformation par Agrobacterium tumefaciens ______________ 55
4.2.1 Support moléculaire de la virulence ____________________________________ 55
4.2.2 Chimiotactisme et induction de la virulence _____________________________ 57
4.2.3 Transfert et intégration de l’information génétique _______________________ 58
4.2.4 Mise en place du commensalisme ______________________________________ 60
4.3 Utilisation d’Agrobacterium tumefaciens pour la transformation génétique _________ 60
4.3.1 Le système de co-intégration __________________________________________ 61
4.3.2 Le système binaire __________________________________________________ 61
4.3.3 Les gènes de sélection ________________________________________________ 62
4.3.4 Choix d'un protocole de transformation génétique ________________________ 63
5 Objectifs de recherche : exploration fonctionnelle de la voie de biosynthèse des
phénylpropanoïdes ____________________________________________________________ 65
Chapitre II : Matériel et méthodes _______________________________________ 67
1 Matériel __________________________________________________________ 67
1.1 Matériel végétal : Ruta graveolens L. ________________________________________ 67
1.2 Souches bactériennes _____________________________________________________ 67
1.3 Matériel plasmidique _____________________________________________________ 68
1.3.1 Plasmides de départ _________________________________________________ 69
2 Tables des matières
1.3.2 Plasmides recombinants _____________________________________________ 71
2 Milieux de culture __________________________________________________ 73
2.1 Milieux pour cultures végétales _____________________________________________ 73
2.2 Milieux pour cultures bactériennes __________________________________________ 73
2.3 Antibiotiques utilisés _____________________________________________________ 74
3 Méthodes de biologie moléculaire _____________________________________ 75
3.1 Extractions d’ADN génomique de feuilles de Ruta graveolens ____________________ 75
3.2 Amplification d’un fragment d’ADN par PCR _________________________________ 76
3.3 Extraction d'ARN de feuilles de Ruta graveolens L _____________________________ 77
3.4 Synthèse d'ADNc ________________________________________________________ 78
3.5 Extraction d’ADN plasmidique _____________________________________________ 78
3.6 Electrophorèse d’ADN sur gel d’agarose _____________________________________ 79
3.7 Extraction d’ADN d'un gel d’agarose ________________________________________ 79
3.8 Digestion par enzymes de restriction _________________________________________ 79
3.9 Purification et précipitation d'un ADN digéré __________________________________ 80
3.10 Ligations ____________________________________________________________ 80
®
3.11 Construction d'un vecteur de destination Gateway ___________________________ 81
®3.12 Recombinaison par la technologie Gateway ________________________________ 83
3.13 Préparation de bactéries électrocompétentes _________________________________ 83
3.14 Transformation génétique de bactéries par électroporation _____________________ 84
3.15 Transformation génétique de bactéries par choc thermique _____________________ 84
3.16 Séquençage __________________________________________________________ 85
4 Méthode de transformation génétique de R. graveolens ___________________ 85
4.1 Conjugaison triparentale __________________________________________________ 86
4.2 Préparation de l’inoculum d’agrobactéries ____________________________________ 87
4.3 Germination de graines de Ruta graveolens L __________________________________ 87
4.4 Transformation génétique d’hypocotyles de Ruta graveolens ______________________ 88
5 Méthodes biochimiques ______________________________________________ 89
5.1 Extraction éthanolique de phénylpropanoïdes __________________________________ 89
5.2 Extraction des lignines de Ruta graveolens ____________________________________ 89
5.2.1 Principe de la thioacidolyse ___________________________________________ 89
5.2.2 Extraction des lignines _______________________________________________ 91
6 Méthodes analytiques _______________________________________________ 91
6.1 Dosage de composés phénylpropanoïdes par HPLC _____________________________ 91
6.2 Dosage des lignines ______________________________________________________ 92
6.3 Quantification du nombre de transcrits par real time PCR ________________________ 93
7 Traitement statistique des données ____________________________________ 94
3

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