Modulation of dendritic cell biology by oncolytic adenoviruses and by melanoma cells lysed by oncolytic adenoviruses [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Stephan Reinhard Schierer

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Modulation Of Dendritic Cell Biology By Oncolytic Adenoviruses And By Melanoma Cells Lysed By Oncolytic Adenoviruses Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades vorgelegt von Stephan Reinhard Schierer aus Erlangen Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 09.05.2008 Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch Erstberichterstatter: PD Dr. Robert Slany Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Eckhart Kämpgen Für meine Eltern Table of contents A. Summary _______________________________________________________________ 1 A. Zusammenfassung _______________________________________________________ 2 B. Indroduction ____________________________________________________________ 3 B.1. The Immune System ________________________________________________________ 3 B.1.1. Innate immunity ________________________________________________________________ 3 B.1.2. Adaptive immunity ______________________________________________________________ 4 B.1.2.1.
Publié le : mardi 1 janvier 2008
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Modulation Of Dendritic Cell Biology By Oncolytic Adenoviruses And By Melanoma
Cells Lysed By Oncolytic Adenoviruses











Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades













vorgelegt von
Stephan Reinhard Schierer
aus Erlangen
Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Universität
Erlangen-Nürnberg























Tag der mündlichen Prüfung: 09.05.2008

Vorsitzender der
Promotionskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch
Erstberichterstatter: PD Dr. Robert Slany
Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Eckhart Kämpgen

























Für meine Eltern

Table of contents


A. Summary _______________________________________________________________ 1
A. Zusammenfassung _______________________________________________________ 2
B. Indroduction ____________________________________________________________ 3
B.1. The Immune System ________________________________________________________ 3
B.1.1. Innate immunity ________________________________________________________________ 3
B.1.2. Adaptive immunity ______________________________________________________________ 4
B.1.2.1. B cells ____________________________________________________________________ 5
B.1.2.2. T-cells 6
B.2. Dendritic cells _____________________________________________________________ 8
B.2.1. Dendritic cell subsets 9
B.2.2. Dendritic Cell Life Cycle 10
B.2.3. DC and anti-tumor immunotherapy ________________________________________________ 12
B.3. Oncolytic adenoviruses _____________________________________________________ 15
B.3.1 Adenoviruses __________________________________________________________________ 15
B.3.2. Oncolytic adenoviruses__________________________________________________________ 16
B.4. Investigation of anti-tumor immune responses induced by adenoviral oncolysis ______ 19
B.5. Objectives________________________________________________________________ 20
C. Materials and methods___________________________________________________ 21
C.1. Materials 21
C.1.1. Eukaryotic cell lines ____________________________________________________________ 21
C.1.2. Medium and solutions for cell culture ______________________________________________ 21
C.1.3. Nucleic acids__________________________________________________________________ 22
C.1.3.1. Oligonucleotids used for Real-Time PCR________________________________________ 22
C.1.3.2. Oligonucleotids used for PCR_________________________________________________ 22
C.1.4. Antibodies____________________________________________________________________ 22
C.1.5. Chemicals and enzymes _________________________________________________________ 23
C.1.6. Buffers and solution ____________________________________________________________ 24
C.1.6.1. General buffers and solutions 24
C.1.6.2. Electrophoresis of nucleid acids _______________________________________________ 24
C.1.6.3. Electrophoresis of proteins ___________________________________________________ 24
C.2. Methods _________________________________________________________________ 25
C.2.1. Methods for detection of protein 25
C.2.1.1. Generating cell lysate _______________________________________________________ 25
C.2.1.2. Determination of protein concentration with Bio-Rad ______________________________ 25
C.2.1.3. Denaturing Discontinuous Polyacrylamide Gel Electrophoresis according to Laemmli ____ 26
C.2.1.4. Western blotting of proteins __________________________________________________ 26
C.2.1.5. Detection of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) _______________________________ 26
C.2.2. Cell culture and generation of DCs and T cells _______________________________________ 27
C.2.3. Recombinant adenoviruses 28
C.2.4. Luciferase assay _______________________________________________________________ 29
C.2.5. FACS analysis of GFP expression, cell surface staining and Tetramer staining. ______________ 30
C.2.6. Cytotoxicity assays _____________________________________________________________ 30
C.2.7. Quantification of virus genomes by real-time PCR ____________________________________ 31
C.2.8. Cytotoxic T cell induction assay. 32
C.2.9. IL-12 production by DCs. ________________________________________________________ 32
C.2.10. Cytometric Bead Array (CBA) ___________________________________________________ 33
C.2.11. Analysis of cell death of melanoma cells ___________________________________________ 33
C.2.12. Labeling of melanoma cells _____________________________________________________ 34
C.2.13. Phagocytosis assay ____________________________________________________________ 35
C.2.14. Migration assay_______________________________________________________________ 35
D. Results ________________________________________________________________ 36
D.1. Influence of oncolytic adenoviruses on DC biology ______________________________ 36
D.1.1. Recombinant adenoviruses _______________________________________________________ 36
D.1.2. Adenoviral transduction of immature and mature DCs _________________________________ 37
D.1.3. Replication and cytotoxicity of oncolytic adenoviruses in iDC and mDC cultures.____________ 39
D.1.4. Expression of MHC molecules, costimulatory molecules and secretion of cytokines by DCs after
infection with oncolytic adenoviruses. ___________________________________________________ 43
D.1.5. Modulation of MC-induced expression of MHCs, costimulatory molecules and cytokines by DCs
after oncolytic adenovirus infection _____________________________________________________ 47
D.1.6. T cell stimulation by DCs after infection with oncolytic adenoviruses _____________________ 48
D.1.7. Modulation of IL-12 production by DCs after oncolytic adenovirus infection. _______________ 50
D.2. Analysis of oncolytic adenovirus infected melanoma cells and their influence on DC
biology ______________________________________________________________________ 52
D.2.1. Characterization of oncolytic adenovirus induced melanoma cell death ____________________ 52
D.2.2. Analysis of cytokine production by oncolysate _______________________________________ 57
D.2.3. Establishment of a phagocytosis assay for DCs and oncolysate___________________________ 58
D.2.4. Uptake of oncolysate by DCs 59
D.2.5. Phenotype of DCs which phagocytosed oncolysate ____________________________________ 61
D.2.6. Migration capacity of DCs after phagocytosis of oncolysate _____________________________ 62
D.2.7. Phenotype of DCs after uptake of oncolysate expressing CD40L _________________________ 64
F. Discussion _____________________________________________________________ 68
F.1 Modulation of DC biology by oncolytic adenoviruses 68
F.2 Mode of cell death in melanoma cells infected by oncolytic adenoviruses ____________ 72
F.3 Modulation of DC biology by melanoma cells lysed by oncolytic adenoviruses ________ 74
F.4. Outlook __________________________________________________________________ 79
F5. Conclusions _______________________________________________________________ 83
G. Abbreviations __________________________________________________________ 85
H. References _____________________________________________________________ 88
I. Personal publications____________________________________________________ 102
I.1. Original scientific publications ______________________________________________ 102
I.2. Poster presentations _______________________________________________________ 102
I.3. Participation in the trainee program of graduate college 592 _____________________ 102
J. Curriculum Vitae ______________________________________________________ 103
K. Acknowledgements/Danksagung _________________________________________ 104

Summary/Zusammenfassung 1

A. Summary

Virotherapy with oncolytic adenoviruses (ads) is a novel approach for cancer therapy
defined as tumor cell killing by specific replication and spread of viruses. From clinical
and pre-clinical studies, it is becoming increasingly clear that the killing of non-infected
cancer cells in parallel to viral cell lysis will be crucial for oncolytic ads to be effective in
the clinical setting. An attractive approach towards this goal is the induction of systemic
anti-tumor immunity by adenoviral oncolysis. Previous studies were hampered mostly
because of species specificity of ad replication and thus lack of meaningful animal
models. In order to establish the basis for the development of adenoviral oncolytic
vaccination the effects of oncolytic ads and of viral melanoma cell lysate (oncolysate) on
the biology of human dendritic cells (DCs) were examined in this study. DCs are the most
potent antigen presenting cells, key regulators of immune induction and have been
intensively exploited for various vaccination protocols.
The first objective of this study was to investigate how optimized, melanoma-targeted
oncolytic ads directly affect the viability and maturation of human monocyte-derived DC
and the potency of such DCs to activate T cells. Both immature DCs (iDCs) and mature
DCs (mDCs) were transducible with luciferase encoding ads at high titers. After infection
of iDC and mDC with oncolytic ads at high titer, no or only minor toxicity was observed.
Oncolytic ads showed no or a strongly attenuated DNA replication in human DCs, thus
confirming their replication specificity. As determined by staining of cell surface
maturation markers of DCs infected with oncolytic ads, no or only a partial DC maturation
was observed, depending on the donor. However, no inhibition of DC maturation induced
by a cytokine cocktail was noted and an increase in the IL-12 secretion of LPS resp.
LPS/IFNγ matured DCs was found after infection with oncolytic ads. Finally, DCs that
were infected with oncolytic ads, cytokine matured and then loaded with peptide were still
+able to prime and stimulate specifically CD8 T-cells with similar or even superior
efficacy compared to uninfected DCs, again depending on the donor.
In the second part of the work the mode of cell death in adenovirus infected melanoma
cells was determined and DC maturation and migration ability after phagocytosis of
oncolysate was analyzed. The examination of characteristic apoptotic markers in
adenovirus infected melanoma cells revealed an apoptosis independent cell death. The
resulting oncolysate, as a new tumor antigen source, was phagocytosed efficiently when
cocultivated with DCs, but those DCs showed no or only partially increased maturation
marker expression, yet completely matured when stimuli like inflammatory cytokines
were simultaneously added. Co-expression of immunostimulatory genes during oncolysis,
which was investigated by transduction of melanoma cells with Ads encoding human
CD40 ligand (CD40L) during oncolysis, resulted in full maturation of DCs. Matured DCs
that phagocytosed oncolysate showed an overall slightly impaired migratory capacity but a
markedly higher specific migration towards the chemoattractant CCL19.
In summary, oncolytic ads and melanoma cells lysed by oncolytic ads did not harm
functionality and maturability of monocyte-derived DCs and frequently induce partial but
never complete DC activation. Nevertheless this could be achieved by ad expression of the
immunostimulatory protein CD40L. Therefore, oncolytic ads might represent a promising
tool for an oncolysis-induced anti-tumor immune response. These fundamental findings
established the basis to investigate adenoviral oncolytic vaccination in more detail aiming
at the induction of potent anti-tumor immune response and, finally, efficient adenoviral
oncolysis combined with oncolytic anti-tumor vaccination in patients.

Summary/Zusammenfassung 2

A. Zusammenfassung
Virotherapie mit onkolytischen Adenoviren (Ads), sprich die Tumorzerstörung durch
tumorspezifische Replikation und Streuung der Viren, stellt eine neuartige Möglichkeit
zur Behandlung von Krebs dar. Daten aus klinischen und prä-klinischen Studien zeigen
immer deutlicher, dass die Zerstörung von uninfizierten Krebszellen parallel zur viralen
Zelllyse entscheidend für die Effizienz von onkolytischen Ads ist. Einen überaus viel
versprechenden Ansatz dieses Ziel zu erreichen bietet die Induktion einer systemischen
Antitumor-Immunantwort durch adenovirale Onkolyse. Frühere Forschungsarbeiten waren
aufgrund der spezies-spezifischen Replikation von Ads und fehlender aussagekräftiger
Tiermodelle in weiten Teilen nicht repräsentativ. Um die Grundlage für die Entwicklung
einer adenoviralen onkolytischen Vakzinierung zu schaffen, wurden in dieser Arbeit die
Effekte von onkolytischen Ads und von Melanomzellen nach viraler Lyse (Onkolysat) auf
die Biologie humaner Dendritischer Zellen (DZ) untersucht. DZ sind die effektivsten
antigenpräsendierenden Zellen und Schlüsselregulatoren bei der Induktion einer
Immunantwort und wurden bereits intensiv in zahlreichen Vakzinierungsprotokollen
genutzt.
Die erste Zielsetzung dieser Arbeit war die Untersuchung des direkten Einflusses
optimierter melanom-spezifischer onkolytischer Ads auf die Viabilität und die Reifung
von humanen Monozyten-generierten DZ and des Potentials dieser DZ T-Zellen zu
aktivieren. Sowohl unreife als auch reife DZ waren mit hochtitrigen Luziferase
codierenden Ads transduzierbar. Nach Infektion von unreifen und reifen DZ mit
hochtitrigen onkolytischen Ads, ließ sich keine oder nur geringe Toxizität erkennen.
Onkolytische Ads zeigten keine oder sehr stark eingeschränkte DNA Replikation in
humanen DZ, was ihre Replikationsspezifität bestätigte. Oberflächenfärbungen von
Reifungsmarkern von DZ, die mit onkolytischen Ads infiziert waren zeigten
spenderabhängig keine oder nur eine partielle Reifung. Durch die Infektion mit
onkolytischen Ads waren DZ in ihrer Reifbarkeit mit einem Zytokin Cocktail nicht
beeinträchtigt und infizierte DZ, die mit LPS bzw. LPS/IFNγ gereift waren, zeigten eine
gesteigerte IL-12 Sekretion. Schließlich waren DZ nach Infektion mit onkolytischen Ads,
Reifung mit Zytokinen und Beladung mit Peptid immer noch in der Lage mit ähnlicher
+oder gesteigerter Effektivität wiederum spenderabhängig, spezifisch CD8 T-Zellen zu
prägen und zu stimulieren.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Art des Zelltods in adenovirus-infizierten
Melanomzellen bestimmt und die Reifung und Migrationsfähigkeit von DZ nach
Phagozytose von Onkolysat analysiert. Die Untersuchung charakteristischer apoptotischer
Merkmale bei infizierten Melanomzellen zeigte einen apoptose-unabhängigen Zelltod.
Das entstehende Onkolysat, als eine neuartige Quelle für Tumor Antigene wurde während
der Kokultur mit DZ effizient aufgenommen. Diese DZ zeigten jedoch keine oder nur
teilweise gesteigerte Expression der Reifungsmarker, allerdings reiften diese DZ bei
simultaner Zugabe von inflamatorischen Zytokine komplett aus. Die Koexpression
immunostimulatorischer Gene während der Onkolyse, welche durch die Transduktion von
Melanomzellen mit humanen CD40 Ligand (CD40L) codierenden Ads während der
Onkolyse untersucht wurde resultierte in kompletter Reifung der DZ. Gereifte DZ die
Onkolysat aufgenommen hatten zeigten eine insgesamt leicht beeinträchtigte
Migrationskapazität, aber wiesen eine deutlich höhere spezifische Migration zum
Chemokin CCL19 auf.
Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass onkolytische Ads und durch onkolytische
Ads lysierte Melanomzellen weder die Funktionalität noch die Reifbarkeit von
Monozyten-generierten DZ beeinträchtigen und regelmäßig eine teilweise, allerdings
niemals vollständige DZ Reifung induzieren. Dies konnte jedoch durch die Expression des
immunstummulatorische Gens, CD40L mittels Ads erreicht werden. Somit stellen
onkolytische Ads ein vielversprechendes Werkzeug zur onkolytisch-induzierten
Antitumor-Immunantwort dar. Die Befunde der vorliegende Arbeit legen die Grundlage
für eine weitergehende Analyse der adenoviralen onkolytischen Vakzinierung, die auf eine
wirksame Antitumor-Immunaktivierung ausgerichtet ist und die die effiziente adenovirale
Onkolyse mit onkolytischer Antitumor-Vakzinierung im Patienten verbindet.
Introduction 3
B. Introduction

B.1. The Immune System

The immune system is a highly complex system consisting of a large number and variety
of cells and molecules. All cells of the immune system derive from the same progenitors,
the haematopoietic stem cells in the bone marrow. Following differentiation and
maturation processes distinct resulting immune cells circulate and patrol in the blood and
lymphatic vessels of the body, reaching and guarding all peripheral tissues. Their major
task serves the protection of the organism. Especially illness caused by microorganism or
pathogens like bacteria, viruses, pathogenic fungi or parasites but also changes of the
organism itself, e.g., degenerated cells, which divide uncontrollably constitute a menace.
Immune cells can react immediately to a specific target or first adapt to the target disease
and establish an immunological memory. The corresponding immune reactions are
referred to as innate or adaptive immune response, respectively.

B.1.1. Innate immunity

Innate immunity provides a first line of defense against common microorganisms. It
consists of components which get activated fast and own constant germline encoded
(innate) specificity during an individual lifetime. The first barrier to infection are the
epithelias of the body, which provide a physical barrier, as epidermis or mucosa with
mucus and cilia and/or a chemical one, as hydrochloric acid (pH=1-2) and lysozyme.
Pathogens penetrating this first barrier are facing a stronghold of cells and molecules
confining and destroying them. Cells of the innate immunity are mast cells, natural killer
cells (NKC) and the phagocytic cells including macrophages, neutrophils and dendritic
cells. All of them function by identifying and eliminating pathogens, whereby phagocytic
cells mainly engulf particles or pathogens and help to remove infected and dead cells,
mast cells recruit other innate cells and help during wound healing by release of histamine
and heparin and NKC attack and destroy infected and tumor cells that have low levels of
cell surface marker MHC class I. Most importantly phagocytic macrophages and dendritic
cells patrol on body boundaries and recognize pathogen-associated molecular patterns
(PAMP), i.e. structural motifs that are conserved on pathogenic microorganisms, like

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