Molecular modeling studies on signal transduction proteins [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Florian Haberl

De
Molecular Modeling Studies on SignalTransduction ProteinsDer Naturwissenschaftlichen Fakultat derFriedrich-Alexander-Universitat Erlangen-Nurnberg zurErlangung des Doktorgradesvorgelegt vonFlorian HaberlAmberg, Deutschland2008Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultat der Universitat Erlangen-Nurn berg.Tag der mundlic hen Prufung: 05.09.2008Vorsitzender derPromotionskommission: Professor Dr. Eberhard Bansc hErstberichterstatter: Professor Dr. Timothy ClarkZweitberichterstatter: Dr. Wolfgang HillenDie Schwierigkeiten wachsen, je naher man dem Ziel kommt.Johann Wolfgang von Goethe, (1749 - 1832),deutscher Dichter der Klassik, Naturwissenschaftler und Staatsmannaus \Die Wahlverwandtschaften", 1802.Fur meine Familie und EvaAcknowledgmentsDie vorliegende Arbeit wurde auf Anregung und unter Leitung von Herrn ProfessorDr. Tim Clark am Computer Chemie Centrum der Universitat Erlangen-Nurn bergangefertigt.Fur die allzeit gewahrte Unterstutzung und Forderung meiner Arbeit sowie das mir entgegengebrachte Vertrauen, danke ich Herrn Professor Dr. Tim Clark ganz herzlich.Besten Dank geht an Professor Dr. Wolfgang Hillen fur die Erstellung des Zweit-gutachtens. Mein Dank gilt auch Professorin Dr. Carola Kryschi fur die Ubernahmedes Prufungsv orsitz und Professor Dr. Reinhard Troschutz fur die Moglichkeit zurNebenfachprufung im Fach Pharmazeutische Chemie.Bei Dr.
Publié le : mardi 1 janvier 2008
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Molecular Modeling Studies on Signal
Transduction Proteins
Der Naturwissenschaftlichen Fakultat der
Friedrich-Alexander-Universitat Erlangen-Nurnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades
vorgelegt von
Florian Haberl
Amberg, Deutschland
2008Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultat der Universitat
Erlangen-Nurn berg.
Tag der mundlic hen Prufung: 05.09.2008
Vorsitzender der
Promotionskommission: Professor Dr. Eberhard Bansc h
Erstberichterstatter: Professor Dr. Timothy Clark
Zweitberichterstatter: Dr. Wolfgang HillenDie Schwierigkeiten wachsen, je naher man dem Ziel kommt.
Johann Wolfgang von Goethe, (1749 - 1832),
deutscher Dichter der Klassik, Naturwissenschaftler und Staatsmann
aus \Die Wahlverwandtschaften", 1802.Fur meine Familie und EvaAcknowledgments
Die vorliegende Arbeit wurde auf Anregung und unter Leitung von Herrn Professor
Dr. Tim Clark am Computer Chemie Centrum der Universitat Erlangen-Nurn berg
angefertigt.
Fur die allzeit gewahrte Unterstutzung und Forderung meiner Arbeit sowie das mir
entgegengebrachte Vertrauen, danke ich Herrn Professor Dr. Tim Clark ganz herzlich.
Besten Dank geht an Professor Dr. Wolfgang Hillen fur die Erstellung des Zweit-
gutachtens. Mein Dank gilt auch Professorin Dr. Carola Kryschi fur die Ubernahme
des Prufungsv orsitz und Professor Dr. Reinhard Troschutz fur die Moglichkeit zur
Nebenfachprufung im Fach Pharmazeutische Chemie.
Bei Dr. Harald Lanig fur die Betreuung in allen Fragen rund um Molekuldynamik
und Molecular Modeling; bei Dr. Nico van Eikema Hommes fur die Losung etlicher
Hard- und Softwarefragen.
Meinen Mitdoktoranden und (ehemaligen) Mitgliedern im AK Clark: Dr. Olaf Oth-
ersen, Dr. Frank Beierlein, Dr. Matthias Hennemann, Dr. Tatyana Shubina, Dr. Ken
Byler, Kerstin Hohfeld, Hakan Kayi, Jr-Hung Lin, Christof Jager, Markus Berger, Volker
Kuntermann, Christian Kramer, Rene Wolfel, Mateusz Wielopolski, Daniela Richter, Isa
Bundesmann, Nadine Scharrer, Sebastian Schenker; aus der Bioinformatik Professor Dr.
Heinrich Sticht und Dr. Heike Meiselbach.
Besonderer Dank geht an Professor Dr. Geo Kneale fur die biologische Testung der
Dockingergebnisse und die Kooperation mit seinem Arbeitskreis, Dr. Olaf Othersen fur
die Losung aller meiner Perl Probleme und Volker Kuntermann fur die Beantwortung
Aall meiner LT X Probleme.E
Dr. Thomas Engel fur meinen ersten Kontakt mit Chem(o)informatik und Computa-
tional Chemistry. Dr. Markus Gastreich und der Firma BioSolveIT fur die FlexX
Testversion und den Support. Prof. Dr. Thomas Exner fur die Kooperation und
Diskussionen rund um den Bereich Molecular Modeling.
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??Der ganzen HPC Gruppe am RRZE fur die Rechenzeit und Beantwortung aller Fra-
gen, den SFB 473 und 583 und dem Kompetenz Network for Technical, Scienti c High
Performance Computing in Bavaria (KONWHIR) fur die Finanzierung.
Danke auch an meine Studienfreunde: Ulrike Gotz, Christian Fehske, Tobias Neumann,
Oliver Rieder & Anja Person, Thomas Wagner, Florian Fruth, Dominic Kram, Dr. Sandra
El , Dr. Jens Landwehr, Stefan Schuster & Elke Lorenzen, Dr. Andreas Paul & Simone
Reissmann, Martin Didunyk, Christian Burkard, Holger Wenzel, Horst Laschinsky, Thomas
Glanzmann.
Ganz besonderer Dank gilt meiner Freundin Eva, die mich in den vergangenen Tagen/
Wochen nicht oft ruhig und ausgeglichen erlebt hat.
Gro ter Dank geb uhrt meinen Eltern und meiner Schwester Lisa fur Ihre Liebe und
Unterstutzung und den Glauben an mich, auch in schweren Zeiten; es liegt mir am Herzen,
dass ihr immer stolz auf mich sein konnt.
iiZusammenfassung
In der heutigen Zeit besteht ein gro er Bedarf f ur neue und e ektive Antibiotika, die keine
Kreuzresistenz mit bereits eingesetzten Antibiotika aufweisen. Arzneimittelresistenzen, ge-
nerische Arzneimittel und steigende Zulassungshurden senken den Pro t der (forschenden)
pharmazeutischen Industrie, die folglich mehr an der Therapie von chronischen Erkrankun-
gen als an Kurzzeitbehandlungen, wie z.B. mit Antibiotika interessiert ist (Maximierung
des Shareholder-value). E ektive Antibiotika schr ank en ihre eigene Nutzung durch sehr
schnelle Therapieerfolge ein (Autoobsoleszenz). Eine gewohnliche Therapie mit Antibiotika
dauert 3 bis 14 Tage, wohingegen bei chronischen Erkrankungen, wie z.B. Bluthochdruck,
die Behandlung lebenslang erfolgen mu .
Die vorliegende Arbeit ist auf Molekular-Modeling Methoden fokussiert; zwei es-
sentielle Signal-Transduktionssysteme wurden beschrieben und untersucht, die auch
Zielstrukturen/anti-Targets fur Antibiotika sind bzw. sein konnen; das bekannte Tetra-
zyklin-Repressor (TetR) System und das Restriktions-Modi kationssystem (R-M) C.Ahdl
aus Aeromona hydrophila.
TetR
Molekul-Dynamik-Simulationen wurden eingesetzt, um den Induktionsmechanismus von
TetR mit dem Transkriptions-induzierenden-Peptid (Tip) zu untersuchen. Die gleichzeitige
Anderung in \Essential Dynamics\ Analysen, Veranderungen im Wassersto br uc ken-
bindungsmuster, der Veranderung der Sekundarstruktur von Tip und auch die Veran-
derung des DNS-Kopf-Kopf Abstands spricht fur eine Induktion. Die bis jetzt von uns
untersuchten TetR-Varianten weisen alle diese Veranderung des DNS-Kopf-Kopf Abstandes
auf. Dies ist charakteristisch fur eine Induktion, also eine Ablosung von der DNS.
Uberraschenderweise verlauft das Induktionsereignis sehr schnell und tritt innerhalb von
10 ns Simulationszeit ein. Wir vermuten, dass dies das erste Mal ist, dass ein Induktionsvor-
iiigang mit Hilfe von MD Simulationen beobachtet worden ist. Obwohl die geometrischen
Veranderungen bei der Induktion von TetR durch Tetrazyklin (Tc) oder Tip ahnlich sind,
verlauft der Induktionsmechanismus fur die peptidische Induktion (magnesiumfrei) anders
im Vergleich zur Induktion mit kleinen Molekulen, die normalerweise als Komplex mit
2+Mg induzieren.
Die bisher durchgefuhrten Dockingstudien mit TetR als Zielstruktur ergaben in den
anschlie enden biologischen Testungen nur inaktive Ergebnisse. Einer der Gr unde fur
diese unbefriedigende Ergebnisse ist die unzureichende Beschreibung des korrekten Binde-
2+verhaltnisses der gedockten Liganden und dem Kofaktor Mg in TetR. Dazu wurde
eine Beta Version von FlexX, die Verbesserungen im Platzieren der Liganden und der
Metallkoordinaten aufweist, eingesetzt.
Eine Untergruppe der ZINC Datenbank wurde mit dem TetR System 2trt gedockt (Tc
ist in der Rontgenstruktur mit 2trt vorhanden). Der Redock von Tc und 2trt ergab
eine bessere Reproduktion der Bindungsverhaltnisse im Vergleich zu den alten Docking-
methoden. Aus dem anschlie endem Docking erstellten wir aus den besten gedockten
Liganden ein Konsensuspharmakophor Modell. Dieses weist gro e Ahnlichkeiten mit dem
bereits bekannten Modell, das aus MD Simulationen gewonnen wurde, auf. Die besten 50
Verbindungen sollen in naher Zukunft biologisch durch die Arbeitgruppe Hillen getestet
werden.
C.Ahdl
Das Restriktions-Modi kationssystem (R-M) wird von Bakterien eingesetzt, um sich selbst
vor fremder DNS, wie z.B. Bacteriophagen-DNS zu schutzen. Das untersuchte R-M-System
gehort zur Klasse II, welche die am einfachsten aufgebauten Systeme darstellen.
Es besteht aus einem Enzympaar, beide Enzyme erkennen die gleiche identische DNS-
Sequenz, aber haben gegensatzlic he enzymatische Funktionen. Die Methyltransferase
(MTase) erkennt eine spezi sche Sequenz der Wirt-DNS und methyliert daraufhin eine
spezielle Base dieser Sequenz. Die Endonuklease (ENase) erkennt die gleiche DNS Se-
ivquenz und baut diese bei fehlender Methylierung ab. Dank dieses Mechanismuses ist
die Wirt-DNS vor ihrer eigenen ENase geschutzt, wohingegen wirtsfremde DNS, z.B.
Bakteriophagen-DNS, abgebaut wird.
Jedoch mu die Expression der ENase solange verz ogert werden, bis die Wirt-DNS
methyliert ist. Dieser Vorgang wird durch ein R-M Kontrollprotein gesteuert. Kneale et al.
losten die erste Rontgenkristallstruktur eines R-M Kontrollprotein (C.Ahdl aus Aeromona
hydrophila) auf. Dieses Protein ist ein Homodimer, das wie ein Transkriptionsregulator
arbeitet.
Die Regulierung konnte durch die Blockade der Dimerisierungsstelle (Asn52-Val56) des
freien Proteins verhindert werden, so dass die ENase die Moglichkeit hatte auch die Wirt-
DNA abzubauen, wodurch das Bakterium stirbt. Dies konnte ein neuer Angri spunkt f ur
Antibiotika sein.
Ausgehend von der Kristallstruktur von C.Ahdl (PDB Eintrag: 1Y7Y) wurden MD-
Simulationen angesetzt, um Stabilitat und Dynamik, sowohl des Dimers als auch des
Monomers in Wasser, zu beobachten. Die Simulationen blieben uber die gesamte Simula-
tionsdauer stabil. Die in der Rontgenstruktur bekannten H-Bruc ken an der Dimerisierungs-
stelle waren uber die gesamte Simulationszzeit vorhanden, daruber hinaus wurden noch
zwei weitere H-Brucken identi ziert.
Mit Hilfe dieser Simulationen und deren Analyse wurde die Stabilitat des Monomers in
Losung aufgezeigt, weshalb es auch innerhalb von Zellen existieren kann. Somit konnte
ein Ligand prinzipiell binden und die Dimerregion (Asn52-Val56) blockieren, wodurch eine
Regulierung nicht mehr moglich ist.
Um einen derartigen Liganden zu nden, der die Dimerisierung blockiert, wurde ein
virtuelles Hochdurchsatzscreening (vHTS) angesetzt. Der lead-like Datensatz der ZINC
Datenbank wurde gedockt und ein erstes Konsensuspharmakophor Modell erstellt, welches
fur zukunftige Screenings als Basis dient. Zur Zeit werden die besten 50 Verbindungen in
biologischen Testungen durch Kneale untersucht.
vAbstract
Currently, there is a huge demand for new and e ective antibiotics without cross-resistance
to currently used antibiotics. Drug resistance, generic products and increasing regulatory
barriers lower the pro t for the pharmaceutical industry, which is much more interested
in the therapy of chronic diseases than in short term treatments like antibacterial ones
(maximize the shareholder-value). E cient antibiotics cut down their own need by fast
success over the disease (auto-obsolence), a standard antibiotic treatment is only 3 to 14
days, whereas for chronic diseases like high blood pressure, the timespan for the treatment
is lifelong.
The thesis is focused on Molecular Modeling methods to characterize two essential
signal transduction systems which are also valid targets/anti-targets for antibiotics; the
well known Tetracycline Repressor (TetR) system and the Restriction-Modi cation (R-M)
system.
TetR
Molecular-dynamics (MD) simulations were used to investigate the mechanism of induction
of TetR with the Transcription inducing peptide (Tip). Data from essential dynamics,
changes in hydrogen bond occupancy and the secondary structure of Tip coincide with
an increase in the distance between the DNA-binding heads of TetR. We show that this
distance increase is characteristic for induction (i.e. dissociation from the DNA) in all
TetR variants studied so far.
The induction event is surprisingly fast and occurs within 10 ns. To our best knowledge,
we believe that this is the rst time that induction events have been observed in molecular-
dynamics simulations. Although the geometrical e ects of inducing TetR with tetracyclines
and Tip are similar, the induction mechanism for the peptide (magnesium free case) is
completely di erent to that of small-molecules, which usually induces as complexes with
2+Mg .
vi

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