Morphological and functional characterisation of a new murine serum free in vitro model of the blood-brain barrier [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Christian Weidenfeller

De
BiochemieMORPHOLOGICALANDFUNCTIONALCHARACTERISATIONOFANEWMURINESERUMFREEIN VITRO MODELOFTHEBLOODBRAINBARRIERInauguralDissertationzurErlangungdesDoktorgradesderNaturwissenschaftenimFachbereichChemieundPharmaziederMathematischNaturwissenschaftlichenFakultätderWestfälischenWilhelmsUniversitätMünstervorgelegtvonCHRISTIANWEIDENFELLERausOberhausen2003Dekan: Prof.Dr.J.LekerErsterGutachter: Prof.Dr.H.J.GallaZweiterGutachter: Prof.Dr.K.H.KlempnauerTagdermündlichenPrüfung: 18.11.2003TagderPromotion: 18.11.2003 Meinen Eltern Vielen Dank! Bedankenmöchteichmich:bei Prof. Dr. H.J. Galla für die interessante Themenstellung, die freundlicheUnterstützungunddiestetigeDiskussionsbereitschaft,beiPriv.Doz.Dr.ThomasRauenfürdieUnterstützungbeiderMauskulturunddieAnregungenfürdiemolekularbiologischenArbeiten,beiDr.JoachimWegenerfürdieunglaublicheHilfsbereitschaftinallenLebenslagen(obphysikalischodernicht...
Publié le : mercredi 1 janvier 2003
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Biochemie





MORPHOLOGICALANDFUNCTIONALCHARACTERISATIONOFA
NEWMURINESERUMFREEIN VITRO MODELOFTHE
BLOODBRAINBARRIER



InauguralDissertation
zurErlangungdesDoktorgrades
derNaturwissenschaftenimFachbereichChemieundPharmazie
derMathematischNaturwissenschaftlichenFakultät
derWestfälischenWilhelmsUniversitätMünster





vorgelegtvon
CHRISTIANWEIDENFELLER
ausOberhausen



2003




















Dekan: Prof.Dr.J.Leker
ErsterGutachter: Prof.Dr.H.J.Galla
ZweiterGutachter: Prof.Dr.K.H.Klempnauer


TagdermündlichenPrüfung: 18.11.2003
TagderPromotion: 18.11.2003































Meinen Eltern Vielen Dank!

Bedankenmöchteichmich:
bei Prof. Dr. H.J. Galla für die interessante Themenstellung, die freundliche
UnterstützungunddiestetigeDiskussionsbereitschaft,
beiPriv.Doz.Dr.ThomasRauenfürdieUnterstützungbeiderMauskulturunddie
AnregungenfürdiemolekularbiologischenArbeiten,
beiDr.JoachimWegenerfürdieunglaublicheHilfsbereitschaftinallenLebenslagen
(obphysikalischodernicht...),
bei Markus für die tolle Zusammenarbeit und den Beitrag im Rahmen seiner
Diplomarbeit,
bei Alla, Bernd, Joe, Susanne, Tina und Thomas für das Durchsehen des
Manuskripts,
für die Unterstützung bei den Messungen: Sabine (Zellkultur & Permeabilitäten),
Sebastian(AFM)undBjörn(QCM),
bei allen gegenwärtigen und vergangenen Laborkollegen: Alla, Anja, Beate,
Christoph, Dagmar, Evelyn, Frank, Jens, Joe, Mairin, Markus, Muffin, Ruth,
Susanne, Patrick, Tanja, Thanh, und Ulf, sowie dem ganzen AK Galla (BHS und
Lipidis) für eine nette Zusammenarbeit während der 3 Jahre. (Hier sei besonders
Anja und Markus für ihre TeilzeitMitbewohnerschaft der WG Zwipp und Jens für
langeDiskussionenüberKlonierungenundMoorhühnergedankt),
beiT.,SchachiundLübbefürdieunterstützendeBereitstellungvonFachwissenund
AblenkungenimLaboralltagunddarüberhinaus,
beiAnne,Antje,Freddy,Hedda,Lydia,Sandra,Silke,Steffi,WolfgangundWalterfür
dieUnterstützunginallenInstitutsLebenslagen,
beimganzenInstitutfürdiekollegialeAtmosphäre,
bei meinen Freunden innerhalb und ausserhalb Münsters, besonders bei Ansgar,
Claudia, Frauke, Gesine, Hennes, Jan, Kristina, Matthias, Markus, Melanie Muffin,
RuthundVolker,
beimeinenElternundGeschwisternfürdieimmerwährendeUnterstützung
undganzbesondersbeiAlla(geb.Zozulya)fürihreZ usammenarbeitimInstitutund
Zuhause!!!Ятебекохаю!Дякую!!! Tablefontents i
1 Summary............................................................................................................ 1

2 Introduction ....................................................................................................... 3
2.1 Barriersofthecentralnervoussystem................ ......................................... 3
2.1.1 Historicalbackground............................................................................ 4
2.1.2 Barriersystemsinthemammalianbrain ........... .................................... 5
2.2 Organizationofthebloodbrainbarrier......................................................... 6
2.2.1 Cellcellcontactsbetweenbraincapillaryendothe lialcells ................... 8
2.2.2 Selectivetransportfunctionsofcapillaryendotheli alcells..................... 9
2.2.3 Metabolicelementsofthebloodbrainbarrier .. ................................... 11
2.3 In vitromodelsofthebloodbrainbarrier.................. .................................. 11
2.3.1 Primaryculturesofbraincapillaryendothelialcel ls............................. 13
2.3.2 Celllinesas in vitromodelsofthebloodbrainbarrier.................. ....... 14
2.4 Regulationofbloodbrainbarrierproperties:Hormones............................. 16
2.5 Objectivesoftheproject.......................... ................................................... 20

3 Experimental.................................................................................................... 21
3.1 Cellbiology................................................................................................. 21
3.1.1 Primarycultureofmurinebraincapillaryendothe lialcells(MBCEC) .. 21
3.1.2 TransfectionofcellswithsmallinterferingRNA .. ................................ 26
3.1.3 Immunocytochemistry ......................................................................... 27
3.1.4 Atomicforcemicroscopy .......................... ........................................... 29
3.1.5 Transmissionelectronmicroscopy...................................................... 30
3.1.6 Measurementofelectricalpropertiesofprimarycul turedmurine
braincapillaryendothelialcells..................... ....................................... 31
3.1.7 QuartzCrystalMicrobalance...................... ......................................... 33
3.1.8 Permeabilitystudies ........................... ................................................. 36
3.2 Molecularbiology ....................................................................................... 37
3.2.1 Quantificationofnucleicacids.................. ........................................... 37
3.2.2 Agarosegelelectrophoresis................................................................ 38
3.2.3 IsolationofDNAfromagarosegels..................................................... 39
3.2.4 IsolationofplasmidDNA..................................................................... 39
3.2.5 IsolationofRNA .................................................................................. 40
3.2.6 cDNAsynthesis................................................................................... 40ii
3.2.7 Polymerasechainreactionmethods ................................................... 41
3.2.8 Nucleicacidblottingandhybridisation .......... ...................................... 44
3.2.9 Cloningandligation............................................................................. 47
3.3 Microbiology ............................................................................................... 49
3.3.1 PreparationofcompetentE. colicells ................................................. 49
3.3.2 TransformationofE.colicells .............................................................. 50
3.3.3 Culturesof E. colicells........................................................................ 50
3.3.4 StorageofE. coli cells......................................................................... 50
3.4 Proteinbiochemistry................................................................................... 50
3.4.1 Isolationofproteinsfromculturedcells ........ ....................................... 51
3.4.2 Determinationofproteinconcentration ............................................... 51
3.4.3 SDSpolyacrylamidegelelectrophoresis............................................. 51
3.4.4 CoomassieBluestaining..................................................................... 53
3.4.5 Proteinblottingandimmunodetection ................................................. 53

4 Results ............................................................................................................. 55
4.1 Establishmentoftheprimarycultureofmousebrain capillary
endothelialcells.......................................................................................... 55
4.2 Characterisationofmurinebraincapillaryendothe lialcells........................ 56
4.2.1 MorphologicalcharacterisationofMBCEC.......................................... 56
4.3 IdentificationofbloodbrainbarrierrelatedproteinsonRNAlevel ............. 62
4.4 FunctionaleffectsofhydrocortisoneonMBCEC........ ................................ 64
4.4.1 ElectricalpropertiesofMBCEC.................. ......................................... 64
4.4.2 SucrosepermeabilityofMBCEC................... ...................................... 69
4.4.3 InfluenceofhydrocortisoneandserumonmorphologyofMBCECand
localisationoftightjunctionproteins.................................................... 70
4.4.4 Influenceofhydrocortisoneoncellcellcontactsand cellsurface....... 75
4.4.5 Transmissionelectronmicroscopy...................................................... 78
4.4.6 Influenceofhydrocortisoneonexpressionofbloodbrainbarrierrelated
proteinsonRNAlevel ................................ ......................................... 81
4.4.7 Influenceofhydrocortisoneonproteinexpressionoftightjunction
proteins ............................................................................................... 83
4.5 Genesilencingatprimaryculturesofbraincapillary endothelialcells........ 84
4.5.1 ImmunofluorescencestainingofsiRNAtransfectedcells ................... 84Tablefontents iii
4.5.2 WesternblotwithsiRNAtransfectedcells........................................... 85

5 Discussion ....................................................................................................... 87
5.1 In vitro modelofmurinebraincapillaryendothelialcells ..... ....................... 87
5.2 Influenceofhydrocortisoneonelectricalpropertieso fMBCEC ................. 88
5.3 Influenceofhydrocortisoneandserumonmorphologya ndmechanical
propertiesofMBCEC ................................. ................................................ 92
5.4 InfluenceofhydrocortisoneonRNAandproteinexpression .................... 97
5.5 ApplicationofRNAinterferencemethodonprimary culturesof
microvascularendothelialcells................................................................... 99

6 Conclusion......................................................................................................101

7 Materialsanddevices ....................................................................................103
7.1 Materials....................................................................................................103
7.2 Devices .....................................................................................................105

8 References ......................................................................................................107

AppendixA:Abbreviations.......................................................................................124
AppendixB:WWWlinks..........................................................................................126
AppendixC:Genotypesof Escherichia coli K12strains ..........................................127
AppendixD:Sequences ..........................................................................................128
Primersequences:PCR ........................................................................................128
Primersequences:QRTPCR ...............................................................................128
siRNAsequences..................................................................................................129
AppendixE:Clonecharts ........................................................................................130
AppendixF:Listoftableandfigurecaptions...........................................................132
Tablecaptions .......................................................................................................132
Figurecaptions......................................................................................................132

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