Nonlinear microrheology of living cells [Elektronische Ressource] = Nichtlineare Mikrorheologie an lebenden Zellen / vorgelegt von Philip Kollmannsberger

Nonlinear microrheology of living cellsNichtlineare Mikrorheologie an lebenden ZellenDer Naturwissenschaftlichen Fakultätder Friedrich Alexander Universität Erlangen NürnbergzurErlangung des Doktorgradesvorgelegt vonPhilip Kollmannsbergeraus ErlangenAls Dissertation genehmigt von der NaturwissenschaftlichenFakultät der Universität Erlangen NürnbergTag der mündlichen Prüfung: 18. Dezember 2009Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Eberhard BänschErstberichterstatter: Prof. Dr. Ben FabryZweitberichterstatter: Prof. Dr. Rudolf MerkelContentsZusammenfassung 7Abstract 91 Introduction 111.1 Preface. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121.1.1 Cell mechanics in biology and physics . . . . . . . . . . . . . . . . 121.1.2 Mechanical structure of cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121.1.3 Microrheology of living cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151.2 Review of cell mechanics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171.2.1 Historical development. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171.2.2 Magnetic particle microrheology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171.2.3 Other methods of cell rheology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171.2.4 Summary of current results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181.3 Open questions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201.3.1 Nonlinear microrheology . . . . . . . . . . . .
Publié le : jeudi 1 janvier 2009
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Nonlinear microrheology of living cells
Nichtlineare Mikrorheologie an lebenden Zellen
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich Alexander Universität Erlangen Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades
vorgelegt von
Philip Kollmannsberger
aus ErlangenAls Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen
Fakultät der Universität Erlangen Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 18. Dezember 2009
Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch
Erstberichterstatter: Prof. Dr. Ben Fabry
Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Rudolf MerkelContents
Zusammenfassung 7
Abstract 9
1 Introduction 11
1.1 Preface. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.1.1 Cell mechanics in biology and physics . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.1.2 Mechanical structure of cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.1.3 Microrheology of living cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.2 Review of cell mechanics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.2.1 Historical development. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.2.2 Magnetic particle microrheology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.2.3 Other methods of cell rheology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.2.4 Summary of current results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
1.3 Open questions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.3.1 Nonlinear microrheology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.3.2 Stress stiffening or shear softening? . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.3.3 Theoretical description . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2 Materials and Methods 23
2.1 Hardware . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.1.1 Magnetic Tweezers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.1.2 Peripheral components . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.1.3 Imaging and data acquisition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
2.1.4 Probe particles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.2 Calibration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.2.1 Needle sharpening . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.2.2 Hysteresis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.2.3 Force calibration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
2.3 Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.3.1 ccd.lib class library . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.3.2 Measurement software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
2.3.3 Data analysis in MATLAB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
2.4 Procedures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.4.1 Bead coating . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.4.2 Cell culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.4.3 Measurement protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
33 Experimental Results 45
3.1 Linear creep response . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
3.1.1 Power law creep . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
3.1.2 Interpretation of parameters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
3.1.3 Statistical analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
3.1.4 Scaling the creep response . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
3.1.5 Linearity and superposition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
3.1.6 Force dependence of parameters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
3.2 Nonlinear differential creep . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
3.2.1 Differential step protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
3.2.2 Stress stiffening and fluidization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
3.2.3 Prestress determines stress stiffening . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
3.2.4 Power law exponent and fluidization . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
3.2.5 Quantification of adhesion strength . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
3.2.6 Force ramp in the nonlinear regime . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
3.3 Creep recovery and plasticity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
3.3.1 Quantification of creep recoil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
3.3.2 Incomplete recovery . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
3.3.3 Increase of power law exponent . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
3.3.4 Prestress determines recovery and speed up . . . . . . . . . . . . . 67
3.3.5 Repeated force steps and preconditioning . . . . . . . . . . . . . . 69
3.4 Biological applications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
3.4.1 Vinculin as mechanoregulator . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
3.4.2 FLNa determines active but not passive stiffening . . . . . . . . . . 71
3.4.3 Cancer cell metastasis and cell rheology . . . . . . . . . . . . . . . 74
4 Theoretical Model 77
4.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
4.1.1 Overview . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
4.1.2 Soft Glassy Rheology (SGR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
4.1.3 The Wormlike Chain (WLC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
4.1.4 Force induced unbinding of biological bonds . . . . . . . . . . . . . 84
4.1.5 The Sliding Filament (SF) model . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
4.1.6 Outline for a combined generalized model . . . . . . . . . . . . . . 87
4.2 Geometry and stress strain relationship . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
4.2.1 Sliding filament geometry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
4.2.2 Nonlinear elasticity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
4.2.3 Stress strain curve: numerical results . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
4.3 Time dependent behavior . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
4.3.1 Stress relaxation due to spontaneous unbinding . . . . . . . . . . . 94
4.3.2 Force dependent lifetimes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
4.3.3 Numerical results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 975
5 Discussion 103
5.1 Limitations and improvements of the experimental setup . . . . . . . . . . 104
5.1.1 Force magnitude . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
5.1.2 Imaging of intracellular structures . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
5.1.3 Improvements of the software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
5.2 Discussion of the experimental results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
5.2.1 Power law rheology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
5.2.2 Variation of parameters between cells . . . . . . . . . . . . . . . . 110
5.2.3 Role of prestress . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
5.2.4 Active or passive stress stiffening? . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
5.2.5 Quantitative analysis of adhesion strength . . . . . . . . . . . . . . 112
5.2.6 Non recovery, plasticity, and force reversal . . . . . . . . . . . . . . 112
5.3 Discussion of the theoretical model . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
5.3.1 Comparison to the Soft Glassy Rheology (SGR) model . . . . . . . 113
5.3.2 Relation to the „Glassy Wormlike Chain“ (GWLC) . . . . . . . . . . 114
5.3.3 Limitations of the numerical results . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
5.3.4 Uniaxial force generation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
5.3.5 Applicability to other systems . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
Appendix 117
Bibliography 118
Danksagung 129
Ver¨offentlichungen 131
Lebenslauf 1337
Zusammenfassung
MikromechanischeStudienanlebendenZellenhabengezeigt,dassderenzeitabhängige
Kriechantwort und Spannungsrelaxation bei kleinen Kräften einem Potenzgesetz folgt,
ähnlich wie bei weicher glasartiger Materie, und dass die lineare Steifigkeit des Zell
skelettsproportionalzudessenVorspannungist. DienichtlinearenmechanischenEigen
schaften des Zellskeletts infolge höherer Kräfte, wie sie unter physiologischen Beding
ungen auftreten, sind bislang jedoch wenig erforscht.
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde eine speziell für hohe Kräfte optimierte
magnetische Pinzette entwickelt. Bei dieser Methode wird Kraft über ein Magnetfeld
auf mikrometergroße Magnetbeads ausgeübt, die an die Zellmembran gebunden sind.
Durch eine verbesserte Kraftkalibration kann der Abstand zwischen Magnetperlen und
Magnet gegenüber bisherigen Aufbauten verkürzt und mit Hilfe von Echtzeit Bildver
arbeitung und Nachführung des Magneten konstant gehalten werden. Auf diese Weise
können konstante Kräfte von über 100 nN ausgeübt werden – der bisher höchste er
reichte Kraftwert für eine magnetische Pinzette dieser Art. Parallel dazu wurde für den
Aufbau ein benutzerfreundliches Softwarepaket entwickelt, das die Durchführung und
graphische Auswertung verschiedener rheologischer Experimente ermöglicht.
Mit diesem Aufbau wurde im zweiten Teil der Arbeit die zeit und kraftabhängigen
nichtlinearen Materialeigenschaften verschiedener Zelltypen untersucht. Die Kriechant
βwortfolgtinallenFälleneinemPotenzgesetzJ(t) =J (t/t ) ,wieimlinearenFallauch,0 0
jedoch zeigt sich mit steigender Kraft sowohl Spannungsversteifung (J wird kleiner)0
als auch Scherverflüssigung (β wird größer). Die Kraftabhängigkeit dieser beiden Pa
rameter offenbart einen einfachen Zusammenhang: die differentielle Steifigkeit ist pro
portionalzurSummeausinnererundäußerermechanischerSpannungdesZellskeletts.
FolglichkontrollierenZellenüberdieaktivvonMotorproteinenerzeugteinnereVorspan
nung ihres Zellskeletts nicht nur ihre linearen, sondern auch ihre nichtlinearen mecha
nischenEigenschaften. DarüberhinauswurdedieMagnetpinzetteauchdazuverwendet,
eine Reihe zellbiologischer Fragestellungen zu bearbeiten.
Die experimentellen Beobachtungen der Zellmechanik lassen sich in wenige mathe
matische Beziehungen fassen, jedoch existiert bislang keine allgemeingültige Theorie
dazu. Vorhandene Modelle erfassen entweder nur einzelne Aspekte wie Kriechantwort,
KraftabhängigkeitoderaktiveSpannung,odersindzuabstraktumaufZellenanwendbar
zu sein. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde daher versucht, die wesentlichen Elemente
vorhandener Theorien zu einem minimalen allgemeingültigen Modell der Zellmechanik
zu vereinheitlichen. Die elastischen, viskosen und plastischen Eigenschaften von Zellen
und anderen biologischen Materialien werden darin allein durch die Dynamik mikro
skopischerProtein Protein Wechselwirkungenerklärt. NumerischeBerechnungenzeigen,
dass das Modell die experimentellen Beobachtungen qualitativ gut reproduziert.9
Abstract
Micromechanical studies on living cells revealed that their time dependent creep re
sponse and stress relaxation at small forces follow a power law, similar to that of soft
glassy materials, and that the linear stiffness of the cytoskeleton is proportional to its
prestress. The nonlinear mechanical properties of cells in response to large forces as
they arise under physiological conditions, however, are not well understood.
In the first part of this work, a magnetic tweezers setup optimized for large forces
was developed. With this method, force is applied via a magnetic field to micron sized
magnetic beads bound to the cell membrane of a living cell. Due to an improved force
calibration, the distance between beads and magnet can be smaller than in previous
implementationsandiskeptconstantusingrealtimeimageprocessingtotrackbeadand
magnet positions. This way, forces of more than 100 nN can be applied, which has not
beenachievedpreviouslywithasetupofthistype. Additionally,auser friendlysoftware
package was developed for performing and analyzing rheological experiments.
In the second part of this work, the time and force dependent nonlinear material
properties of various cell types were examined using this setup. The creep response al
βwaysfollowedapowerlaw,J(t) =J (t/t ) ,asinthelinearcase. Withincreasingforce,0 0
stress stiffening (decrease of J ) and shear fluidization (increase of β) were observed.0
The force dependence of these two parameters reveals a simple relationship: the differ
ential stiffness is proportional to the sum of internal and external mechanical stress of
the cytoskeleton. Consequently, cells control not only their linear, but also their non
linear mechanical properties via their active motor protein generated internal prestress.
Furthermore,themagnetictweezerssetupwasusedtostudyanumberofcellbiological
problems.
The experimental observations of cell mechanics can be summarized in a few math
ematical relationships, but to date no comprehensive model exists that explains these
relationshipstheoretically. Prevailingmodelscaptureonlyisolatedaspectssuchascreep
response, force dependence or active prestress, or are too abstract to be applicable to
cells. Inthethirdpartofthiswork,therefore,anattemptwasmadetounifytherelevant
elements of existing theories in a comprehensive model of cell mechanics. It explains
theelastic,viscousandplasticpropertiesofcellsandotherbiologicalmaterialssolelyby
the dynamics of microscopic protein protein interactions. Numerical simulations show
that the model qualitatively reproduces the experimental observations.

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