Novel natural products from endophytic fungi of Egyptian medicinal plants: chemical and biological characterization [Elektronische Ressource] = Neue Naturstoffe aus endophytischen Pilzen ägyptischer Arzneipflanzen: chemische und biologische Charakterisierung / vorgelegt von Amal E. H. A. Hassan

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Novel Natural Products from Endophytic Fungi of Egyptian Medicinal Plants - Chemical and Biological Characterization Neue Naturstoffe aus endophytischen Pilzen ägyptischer Arzneipflanzen - chemische und biologische Charakterisierung Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf vorgelegt von Amal E. H. A. Hassan aus Alexandria, Ägypten Düsseldorf, 2007 Aus dem Institut für Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie der Heinrich-Heine Universität Düsseldorf Gedruckt mit der Genehmigung der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Gedruckt mit der Unterstützung des Deutschen Akademischen Austauschdienstes (DAAD) Referent: Prof. Dr. Peter Proksch Koreferent: Dr. Rainer Ebel, Juniorprofessor Tag der mündlichen Prüfung: 25.06.2007 Erklärung Hiermit erkläre ich ehrenwörtlich, dass ich die vorliegende Dissertation mit dem Titel „Neue Naturstoffe aus endophytischen Pilzen ägyptischer Arzneipflanzen - chemische und biologische Charakterisierung“ selbst angefertigt habe. Außer den angegebenen Quellen und Hilfsmitteln wurden keine weiteren verwendet. Diese Dissertation wurde weder in gleicher noch in abgewandelter Form in einem anderen Prüfungsverfahren vorgelegt.
Publié le : lundi 1 janvier 2007
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Novel Natural Products from Endophytic Fungi
of Egyptian Medicinal Plants - Chemical and
Biological Characterization


Neue Naturstoffe aus endophytischen Pilzen
ägyptischer Arzneipflanzen - chemische und
biologische Charakterisierung


Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades
der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf


vorgelegt von
Amal E. H. A. Hassan
aus Alexandria, Ägypten


Düsseldorf, 2007
Aus dem Institut für Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie
der Heinrich-Heine Universität Düsseldorf




















Gedruckt mit der Genehmigung der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf

Gedruckt mit der Unterstützung des
Deutschen Akademischen Austauschdienstes (DAAD)

Referent: Prof. Dr. Peter Proksch
Koreferent: Dr. Rainer Ebel, Juniorprofessor

Tag der mündlichen Prüfung: 25.06.2007








Erklärung

Hiermit erkläre ich ehrenwörtlich, dass ich die vorliegende Dissertation mit dem Titel
„Neue Naturstoffe aus endophytischen Pilzen ägyptischer Arzneipflanzen - chemische und
biologische Charakterisierung“ selbst angefertigt habe. Außer den angegebenen Quellen und
Hilfsmitteln wurden keine weiteren verwendet. Diese Dissertation wurde weder in gleicher
noch in abgewandelter Form in einem anderen Prüfungsverfahren vorgelegt. Weiterhin
erkläre ich, dass ich früher weder akademische Grade erworben habe, noch dies versucht
habe.



Düsseldorf, den 10.05.2007

Amal Hassan



Acknowledgement
Acknowledgement

It is a pleasure to find the chance to show my gratitude and all my regards to J. Prof.
Dr. Rainer Ebel for his instructive supervision, his kind help and his continuous support and
encouragement throughout the completion of this work.
I would like to express my cordial thanks and gratitude to Prof. Dr. rer. nat. Peter
Proksch for giving me the opportunity to pursue my doctoral research at the institute, as well
as for his valuable suggestions, his fruitful discussions, his unforgettable support and for the
excellent work facilities at the Institut für Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie,
Heinrich-Heine-Universität, Düsseldorf.
My special thanks to Dr. RuAngelie Edrada-Ebel for her constructive advises, NMR
courses, sharing her expertise in NMR data interpretation as well as for her help and support
in good times and bad times.
Many thanks for the friendly cooperation to Prof. Dr. rer. nat. Werner E. G. Müller
and Renate Steffen, Institut für Physiologische Chemie und Pathobiochemie, University of
Mainz, for carrying out the cytotoxicity tests, PD. Dr. Ute Hentschel, Zentrum für
Infektionsforschung, University of Würzburg, for performing the biofilm inhibition test and
Dr. Michael Kubbutat, ProQinase GmbH, Freiburg, for conducting the protein kinase
inhibition assays.
I also appreciate the sincere cooperation of Dr. W. Peters and his coworkers, Institut
für Anorganische und Strukturchemie, Heinrich-Heine-Universität, Düsseldorf, for 500 MHz
NMR measurements, Dr. Victor Wray, Helmholtz Centre for Infection Research,
Braunschweig, and his coworkers for 600 MHz NMR measurements as well as HR-mass
spectrometry experiments, Dr. H. Keck and Dr. P. Tommes, Institut für Anorganische und
Strukturchemie, Heinrich-Heine-Universität, Düsseldorf, for conducting EI- and FAB-mass
spectrometry experiments.
My deep thanks are also to Prof. Dr. Amin El-Sayed Ali, Department of Crops,
Faculty of Agriculture, Alexandria University, and Prof. Dr. Rafiq El-Gharib Mahmoud,
Department of Botany, Faculty of Science, Alexandria University, for the identification of the
plant material, as well as the molecular biology and antimicrobial assay teams at the institute
for the identification of purified fungal strains and performing antimicrobial assays,
respectively.
I would like to thank my past and present colleagues Dr. Moustafa Abdelgawwad, Dr.
Mohamed Ashour, Dr. Ziyad Baker, Dr. Tu N. Duong, Dr. Gero Eck, Dr. Hefni Effendi, Dr.
iv Acknowledgement
Wafaa Hassan, Dr. Sabrin Ibrahim, Dr. Yoshi B. Murti, Dr. Suwigarn Pedpradab, Dr. Yudi
Rusman, Dr. Bärbel Steffan, Dr. Franka Teuscher, Dr. Carsten Thoms, Dr. Yasman, Mirko
Bayer, Abdessamad Debbab, Arnulf Diesel, Sherif Elsayed, Clécia Freitas-Richard, Ashraf
Hamed, Triana Hertiani, Ine Dewi Inderiani, Julia Jacob, Ehab Moustafa, Edi W. Sri
Mulonyo, Sofia Ortlepp, Annika Putz, Frank Riebe, Anke Suckow-Schnitker, Yao Wang,
Nadine Weber, Sabri Younes, and all the others for the nice multicultural time I spent with
them, for their help and assistance whenever I needed it. Special thanks to Mareike Thiel for
her administrative help whenever needed, as well as Katrin Rohde and Waltraud Schlag for
their kind help in any technical problem encountered during the work.
My great appreciation to DAAD (German Academic Exchange Service) for the
financial support during my stay in Germany, and to my region reference Margret Leopold for
her kind support during my stay.
Finally, I would like to thank my small scientific family, my father, my mother and
my sister, who were always there for me, especially my parents, who supported me and made
it possible for me to set my own goals and to reach them.
Thank you!

v Zusammenfassung
Zusammenfassung

Endophytische Pilze produzieren Naturstoffe mit einer Vielfalt an chemischen
Strukturen, die für spezifische medizinische oder agrochemische Anwendungen von großem
Interesse sein könnten. Viele dieser Sekundärstoffe weisen biologische Aktivitäten in
pharmakologisch relevanten Assaysystemen auf, die sie zu potentiellen Leitstrukturen für die
Entwicklung neuer Arzneistoffe machen.
Ziel dieser Arbeit war die Isolierung von Sekundärstoffen aus Endophyten
terrestrischer Pflanzen, gefolgt von Strukturaufklärung und Untersuchung ihres
pharmakologischen Potentials. Vier endophytische Pilze, nämlich Alternaria sp.,
Ampelomyces sp., Stemphylium botryosum und Chaetomium sp., gewonnen aus ägyptischen
Arzneipflanzen, wurden als Naturstoffquellen ausgewählt und über einen Zeitraum von drei
bis vier Wochen in Standkulturen in Wickerham-Flüssigmedium sowie in Reis-Festmedium
angezogen. Die aus der folgenden Extraktion erhaltenen Fraktionen wurden zur Isolierung der
Naturstoffe weiteren chromatographischen Trennmethoden unterzogen.
Zur Strukturaufklärung wurden moderne analytische Verfahren wie die
Massenspektrometrie (MS) und die Kernresonanzspektroskopie (NMR) eingesetzt. Zusätzlich
wurden für einige optisch aktive Verbindungen chirale Derivatisierungsreaktionen
angewendet, um deren absolute Konfiguration zu ermitteln. Schließlich wurden die erhaltenen
Substanzen verschiedenen Biotests unterzogen, um ihre antimikrobiellen, antifungalen und
cytotoxischen Eigenschaften sowie die Wirkung als Inhibitoren verschiedener Proteinkinasen
sowie der Biofilmbildung von Staphylococcus epidermidis zu ermitteln.

1. Alternaria sp.
Drei neue Alternariolderivate wurden aus Alternaria sp., isoliert aus Polygonum
senegalense, gewonnen. Des weiteren wurden aus diesem Pilz vier neue Verbindungen,
nämlich Desmethylaltenusin, 4`-Epialtenuene, Alterlacton und Alternariasäure, isoliert. Die
Alternariolderivate sowie einige strukturverwandte Verbindungen wiesen sowohl ausgeprägte
zytotoxische Eigenschaften im Test mit der Zellinie L5178Y (murines T-Zell Lymphom) als
auch inhibitorische Aktivität gegenüber Proteinkinasen auf.

2. Ampelomyces sp.
Ampelomyces sp. ist ein Isolat aus Urospermum picroides. Aus diesem Pilz wurden
sechs neue Verbindungen isoliert, darunter ein neues Pyron, zwei neue Isocoumarine, zwei
vi Zusammenfassung
neue sulfatierte Anthrachinone und ein neues Hexahydroanthronol. In den Biotests zeigten
Desmethyldiaportinol, Altersolanol A und Methylalaternin zytotoxische Aktivität gegenüber
L5178Y-Zellen. Des weiteren zeigten Altersolanol A und Methylalaternin inhibitorische
Aktivität gegenüber der Biofilmbildung von S. epidermidis.

3. Stemphylium botryosum
Aus Chenopodium album wurde der Pilz Stemphylium botryosum isoliert. Daraus
konnten Curvularinderivate isoliert werden, die ausgeprägte zytotoxische Eigenschaften im
Test mit der Zellinie L5178Y zeigten.

4. Chaetomium sp.
Schließlich wurde der Pilz Chaetomium sp., gewonnen aus Otanthus maritimus,
untersucht. Ein neues Tetrahydrofuranderivat sowie zwei bekannte Cochliodinolderivate und
Orsellinsäure wurden aus Extrakten dieses Pilzes gewonnen. Die Cochliodinolderivate wiesen
inhibitorische Aktivität gegenüber Proteinkinasen auf; weiterhin zeigten Cochliodinol und
Orsellinsäure ausgeprägte zytotoxische Eigenschaften gegenüber der Zellinie L5178Y.

Insgesamt wurden in dieser Arbeit zweiundvierzig Verbindungen isoliert, von denen
vierzehn neue Naturstoffe darstellen. Sowohl die neuen als auch die bekannten Substanzen
wurden in Hinsicht auf bioaktiven Eigenschaften in verschiedenen Biotests untersucht.
Die Extrake der jeweiligen Wirtspflanzen wurden mit Hilfe von LC/MS gezielt auf die
isolierten Naturstoffe aus den endophytischen Pilzen hin untersucht. Keiner der isolierten
Sekundärstoffe des endophytischen Pilzes Chaetomium sp. war in den Fraktionen von O.
maritimus zu detektieren. Dagegen konnten Komponenten der übrigen Pilzextrakte eindeutig
in Fraktionen der jeweiligen Wirtspflanzen P. senegalense, U. picroides and C. album
nachgewiesen werden.




vii Contents
Table of Contents

1. Introduction 1
1.1. Endophytes 1
1.2. Endophyte-host plant interaction 2
1.3. Microbial biodiversity 3
1.4. Plant selection for isolation of endophytes 4
1.5. The potential of natural products in drug discovery 5
1.6. The potential of fungal natural products in drug discovery 5
1.7. Endophytic fungi as a source of bioactive natural products 7
1.7.1. Secondary metabolites from endophytes as antibiotics 8
1.7.2. Secondary metabolites from endophytes as antimycotic agents 8
1.7.3. Secondary metabolites from endophytes as antiviral agents 9
1.7.4. Secondary metabolites from endophytes as anticancer agents 10
1.7.5. Secondary metabolites from endophytes with further interesting pharmacological 12
activities
1.8. The potential of microbial natural products in agriculture 13
1.9. Aim and scopes of the study 15

2. Materials and Methods 16

2.1. Materials 16
2.1.1. Biological materials 16
2.1.1.1. Plant material 16
2.1.1.2. Pure fungal strains isolated from the collected plants 16
2.1.2. Media 17
2.1.2.1. Composition of malt agar (MA) medium 17
2.1.2.2. Composition of Wickerham medium for liquid cultures 17
2.1.2.3. Composition of rice medium for solid cultures 18
2.1.2.4. Composition of Luria Bertani (LB) medium 18
2.1.2.5. Composition of yeast medium 18
2.1.2.6. Composition of fungal medium for bioassay 18
2.1.2.7. Composition of potato dextrose agar (PDA) medium for bioassay 19
2.1.2.8. Composition of trypticase soy broth (TSB) 19
viii Contents
2.1.3. Chemicals 19
2.1.3.1. General laboratory chemicals 19
2.1.3.2. Chemicals for culture media 20
2.1.3.3. Chemicals for agarose gel electrophoresis 20
2.1.4. Chromatography 20
2.1.4.1. Stationary phases 20
2.1.4.2. Spray reagents 21
2.1.5. Solvents 21
2.1.5.1. General solvents 21
2.1.5.2. Solvents for HPLC 21
2.1.5.3. Solvents for optical rotation 22
2.1.5.4. Solvents for NMR 22

2.2. Methods 22
2.2.1. Purification of fungal strains 22
2.2.2. Cultivation of pure fungal strains 22
2.2.2.1. Cultivation for short term storage 22
2.2.2.2. Cultivation for screening and isolation of secondary metabolites 23
2.2.3. Extraction of fungal cultures and host plant material 23
2.2.3.1. Extraction of fungal liquid cultures 23
2.2.3.1.1. Total extraction of culture media and mycelia 23
2.2.3.1.2. Separate extraction of culture media and mycelia 24
2.2.3.2. Extraction of solid rice cultures 25
2.2.3.3. Extraction and fractionation of the plant material 26
2.2.3.4. Solvent-solvent extraction 26
2.2.4. Identification of fungal strains and their taxonomy 27
2.2.4.1. Fungal identification 27
2.2.4.2. Taxonomy 28
2.2.5. Isolation and purification of secondary metabolites 33
2.2.5.1. Isolation of the secondary metabolites from Alternaria sp. 33
2.2.5.1.1. Secondary metabolites isolated from liquid cultures of Alternaria sp. 33
2.2.5.1.2. Secondary metabolites isolated from rice cultures of Alternaria sp. 34
2.2.5.2. Isolation of the secondary metabolites from Ampelomyces sp. 35
2.2.5.2.1. Secondary metabolites isolated from liquid cultures of Ampelomyces sp. 35
ix Contents
2.2.5.2.2. Secondary metabolites isolated from rice cultures of Ampelomyces sp. 37
2.2.5.3. Isolation of the secondary metabolites from Stemphylium botryosum 38
2.2.5.4. Isolation of the secondary metabolites from Chaetomium sp. 39
2.2.5.5. Chromatographic methods 39
2.2.5.5.1. Thin layer chromatography (TLC) 39
2.2.5.5.2. Vacuum liquid chromatography (VLC) 40
2.2.5.5.3. Column chromatography 40
2.2.5.5.4. Flash chromatography 41
2.2.5.5.5. Preparative high pressure liquid chromatography (HPLC) 41
2.2.5.5.6. Semi-preparative high pressure liquid chromatography (HPLC) 42
2.2.5.5.7. Analytical high pressure liquid chromatography (HPLC) 43
2.2.6. Structure elucidation of the isolated secondary metabolites 43
2.2.6.1. Mass spectrometry (MS) 43
2.2.6.1.1. Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) 43
2.2.6.1.2. Electron impact mass spectrometry (EI-MS) 44
2.2.6.1.3. Fast atom bombardment mass spectrometry (FAB-MS) 45
2.2.6.1.4. High resolution mass spectrometry (HR-MS) 45
2.2.6.2. Nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) 45
2.2.6.3. Optical activity 46
2.2.6.4. Determination of absolute stereochemistry by Mosher reaction 46
2.2.7. Testing the biological activity 47
2.2.7.1. Antimicrobial assay 47
2.2.7.1.1. Agar diffusion assay 47
2.2.7.1.2. Inhibition of biofilm formation 49
2.2.7.2. Cytotoxicity test 49
2.2.7.2.1. Microculture tetrazolium (MTT) assay 49
2.2.7.2.2. Protein kinase assay 50
2.2.8. General laboratory equipments 53

3. Results 54

3.1. Compounds isolated from the endophytic fungus Alternaria sp. 54
3.1.1. Alternariol (1, known compound) 56
3.1.2. Alternariol-5-O-sulphate (2, new compound) 58
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