Phytochemical and biological studies of Parapiptadenia rigida [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Cleber Alberto Schmidt

De
  Phytochemical and biological studies of Parapiptadenia rigida                Inaugural‐Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften der Albert‐Ludwigs‐Universität Freiburg im Breisgau     vorgelegt von  Cleber Alberto Schmidt aus Três de Maio, RS (Brasilien)   März 2011  Dekan:     Prof. Dr. H. Hillebrecht Leiterin der Arbeit:  Prof. Dr. I. Merfort Referentin:   Prof. Dr. I. Merfort Korreferent:   Prof. Dr. S. Laufer Drittprüfer:   Prof. Dr. A. Bechthold    Tag der Verkündigung des Prüfungsergebnisses: 17.03.2011    Teile  dieser  Arbeit  wurden  in  folgenden  Publikationen  und  Posterpräsentationen veröffentlicht:  Publications  Schmidt, C.A; Murillo, R.; Bruhn, T.; Bringmann, G.; Goettert, M.; Heinzmann, B.; Brecht, V.; Laufer, S.A.; Merfort, I. Catechin Derivatives from Parapiptadenia rigida with In Vitro Wound‐Healing Properties. J. Nat. Prod. 2010, 73, 2035‐2041.  Geller, F., Schmidt, C.A., Göttert, M., Fronza, M., Schattel, V., Heinzmann, B., Werz, O., Flores, E. M., Merfort, I., Laufer, S. Identification of rosmarinic acid as the major active constituent in Cordia americana. J. Ethnopharmacol. 2010, 128, 561‐566.  Schmidt, C.; Fronza, M.; Goettert, M.; Geller, F.; Luik, S.; Flores, E. M. M.; Bittencourt, C. F.; Zanetti, G. D.; Heinzmann, B. M.; Laufer, S.; Merfort, I. Biological studies on Brazilian plants used in wound healing. J.
Publié le : samedi 1 janvier 2011
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Phytochemical and biological studies of Parapiptadenia rigida 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Inaugural‐Dissertation 
zur Erlangung der Doktorwürde 
der Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften 
der Albert‐Ludwigs‐Universität 
Freiburg im Breisgau 
 
 
 
 
vorgelegt von 
 
Cleber Alberto Schmidt 
aus Três de Maio, RS (Brasilien) 
 
 
März 2011  Dekan:     Prof. Dr. H. Hillebrecht 
Leiterin der Arbeit:  Prof. Dr. I. Merfort 
Referentin:   Prof. Dr. I. Merfort 
Korreferent:   Prof. Dr. S. Laufer 
Drittprüfer:   Prof. Dr. A. Bechthold 
 
 
 
Tag der Verkündigung des Prüfungsergebnisses: 17.03.2011 
 
 
 
Teile  dieser  Arbeit  wurden  in  folgenden  Publikationen  und  Posterpräsentationen 
veröffentlicht: 
 
Publications 
 
Schmidt, C.A; Murillo, R.; Bruhn, T.; Bringmann, G.; Goettert, M.; Heinzmann, B.; Brecht, V.; 
Laufer, S.A.; Merfort, I. Catechin Derivatives from Parapiptadenia rigida with In Vitro 
Wound‐Healing Properties. J. Nat. Prod. 2010, 73, 2035‐2041. 
 
Geller, F., Schmidt, C.A., Göttert, M., Fronza, M., Schattel, V., Heinzmann, B., Werz, O., 
Flores, E. M., Merfort, I., Laufer, S. Identification of rosmarinic acid as the major 
active constituent in Cordia americana. J. Ethnopharmacol. 2010, 128, 561‐566. 
 
Schmidt, C.; Fronza, M.; Goettert, M.; Geller, F.; Luik, S.; Flores, E. M. M.; Bittencourt, C. F.; 
Zanetti, G. D.; Heinzmann, B. M.; Laufer, S.; Merfort, I. Biological studies on Brazilian 
plants used in wound healing. J. Ethnopharmacol. 2009, 122, 523‐532. 
 
Schmidt, C.A; Murillo, R.; Heinzmann, B.; Laufer, S.A.; Wray, V.; Merfort, I. Structural and 
Conformational Analysis of Bioactive Proanthocyanidins from Parapiptadenia rigida. 
Submitted.   
Short lectures 
 
Schmidt, C.A; Fronza, M.; Murillo, R.; Wray, V.; Bringmann, G.; Bruhn, T.; Heinzmann, B.; 
Laufer, S.A.; Merfort, I. Catechin derivatives from Parapiptadenia rigida: biological 
studies and conformational analysis. 
th58  International Congress and Annual Meeting of the Society for Medicinal Plant 
thand Natural Product Research ‐ 7  Tannin Conference, 29.08. to 02.09.2010, Berlin. 
Germany. 
 
Schmidt, C.A. Phytochemical and biological studies of the bark from Parapiptadenia rigida.  
  PhD students seminar. 13.07.2010. Albert‐Ludwigs‐Universität, Freiburg,  Germany 
 
Schmidt, C.; Fronza, M.; Goettert, M.; Murillo, R.; Brecht, V.; Heinzmann, B.; Laufer, S.; 
Merfort,  I.  Phytochemical  and  Biological  Studies  of  the  Bark  from  Parapitadenia 
rigida. 
nd th th2  BCNP ‐ Brazilian Conference on Natural Products – São Pedro, SP, Brazil, 09 ‐12  
November 2009. 
 
Poster presentation 
 
Schmidt, C.A.; Fronza, M.; Murillo, R.; Brecht, V.; Heinzmann, B.; Laufer, S.A.; Merfort, I. 
Wound  Healing  Properties  of  Catechin  Derivatives  Isolated  from  Barks  of 
Parapiptadenia rigida.  
ndWorkshop: Drugs from Natural Sources – São Paulo, SP, Brazil, 22  September 2010. 
 
Geller, F., Schmidt, C., Goettert, M., Fronza, M., Heinzmann, B., Werz, O., Merfort, I., Laufer, 
S.  Rosmarinic  acid  as  the  effective  compound  in  Cordia  americana.  Deutsch‐
Brasilianisches Jahr 2010/11, Drugs from Natural Sources: The Potential of Brazilian 
Plants used in Traditional Medicine, São Paulo, Brazil, 22.09.2010. 
 
Geller F., Schmidt C., Goettert M., Fronza M., Heinzmann B., Werz O., Merfort I., Laufer S. 
thRosmarinic acid as the effective compound in Cordia americana. 58  International Congress and Annual Meeting of the Society for Medicinal Plant and Natural Product 
Research, Berlin, 29.08‐02.09.2010. 
 
Geller F., Goettert M., Fronza M., Schmidt C., Schattel V., Heinzmann B., Flores E., Merfort I., 
Laufer  S.  Phytochemical  and  biological  investigation  on  the  ethanolic  extract  of 
Cordia americana. 6th Status Seminar Chemical Biology, Frankfurt, 30.11‐01.12.2009. 
 
Schmidt, C.; Fronza, M.; Goettert, M.; Murillo, R.; Brecht, V.; Heinzmann, B.; Laufer, S.; 
Merfort,  I.  Phytochemical  and  Biological  Studies  of  the  Bark  from  Parapitadenia 
rigida. 
nd th th2  BCNP ‐ Brazilian Conference on Natural Products – São Pedro, SP, Brazil, 09 ‐12  
November 2009. 
 
Goettert M., Luik S., Fronza M., Schmdit C., Geller F., Heinzmann B., Merfort I., Laufer S. 
Structural features and biological evaluation of flavonoids as p38α MAPK inhibitors. 
IV  Simpósio  Brasil  Alemanha:  Desenvolvimento  Sustentável,  Curitiba,  Brazil,  05 
07.10.2009. 
 
Schmidt, C.A.; Fronza, M.; Goettert, M.; Murillo, R.; Brecht, V.; Heinzmann, B.; Laufer, S.A.; 
Merfort, I. New Catechin Derivatives from Parapiptadenia rigida.  
4. Deutsch‐Brasilianisches Symposium / IV Simpósio Brasil‐Alemanha – Curitiba, PR, 
Brazil, 05.‐10. October 2009.  
 
Goettert, M.; Luik, S.; Fronza, M.; Schmidt, C.A.; Geller, F.; Heinzmann, B.; Merfort, I.; Laufer, 
S. Effect of natural phenolic compounds on p38α MAPK activity. 
4. Deutsch‐Brasilianisches Symposium / IV Simpósio Brasil‐Alemanha – Curitiba, PR, 
Brazil, 05.‐10. October 2009. 
 
Schmidt, C.; Fronza, M.; Goettert, M.; Murillo, R.; Brecht, V.; Heinzmann, B.; Laufer, S.; 
Merfort, I. Two New Catechin Derivatives from Parapiptadenia rigida. 
   Drug Discovery and Delivery: Membrane Proteins and Natural Products Research, 
Freiburg, Germany, 17.04.2009.  
Goettert M., Luik S., Fronza M., Schmidt C., Geller F., Merfort I., Laufer S. Natural phenolic 
compounds as inhibitors of p38α MAPK. Drug Discovery and Delivery Membrane 
Proteins and Natural Product Research, Freiburg, 16‐17.04.2009. 
 
Goettert M., Luik S., Fronza M., Geller F., Schmidt C., Merfort I. , Laufer S. Biological testing 
of  bioactive  compounds  that  inhibit  p38α    MAPK.  5th  Status  Seminar  Chemical 
Biology, ChemBioNnet, Frankfurt, 08.12.2008. 
 
Schmidt, C.A.; Fronza, M.; Heinzmann, B.; Merfort, I. Brazilian Tradicional Medicinal Plants – 
interesting targets for bioguided phytochemical research. 
Naturräume  im  Spannungsfeld  zwischen  biologischer  Vielfalt  und  industrieller 
Entwicklung  Brasiliens,  Baden‐Württembergisches  Brasilien‐Zentrum,  Tübingen, 
Germany. July 2008.  
 
Merfort, I.; Heinzmann, B.; Flores, E.; Bittencourt, C.; Schmidt, C.A.; Fronza, M.; Geller, F.; 
Göttert,  M.;  Laufer,  S.A.  Biological  Active  Compounds  from  Traditional  Brazilian 
Medical Plants. 
Naturräume  im  Spannungsfeld  zwischen  biologischer  Vielfalt  und  industrieller 
Entwicklung  Brasiliens,  Baden‐Württembergisches  Brasilien‐Zentrum,  Tübingen, 
Germany. July 2008. 
 
Merfort, I.; Heinzmann, B.; Flores, E.; Bittencourt, C.; Schmidt, C.A.; Geller, F.; Göttert, M.; 
Laufer, S.A. Biological Active Compounds from Brazilian Traditional medicinal Plants. 
3.  Deutsch‐Brasilianisches  Symposium  /  3°  Simpósio  Brasil‐Alemanha  –  Freiburg, 
Germany, July 2007. 
 
 
 
 Index   I
Index 
1. Introduction and Aim...............................................................................1
1.1. Aim of the thesis.................................................................................................4
2. Proanthocyanidins: Current knowledge on their structures and biological 
activity...........................................................................................................5
2.1. General aspects on their structure and biosynthesis...........................................5
2.2. Conformational properties of monomeric and oligomeric flavan‐3‐ols ..............10
2.3. Analytical methods for proanthocyanidins.........................................................14
2.3.1. Methods for identification of proanthocyanidins17
2.4. Biological activities of proanthocyanidins..........................................................21
2.4.1. Antioxidant and radical scavenging activities.................................................21
2.4.2. Anti‐inflammatory activities............................................................................22
2.4.3. Cardiovascular effects.....................................................................................23
2.4.4. Chemopreventive effects................................................................................23
2.4.5. Antimicrobial activity......................................................................................24
2.4.6. Antiallergic properties24
2.4.7. Wound healing................................................................................................25
2.4.8. Bioavailability of proanthocyanidins...............................................................29
3. Results...................................................................................................30
3.1. Screening phase.................................................................................................30
3.2. Phytochemical investigation of Parapiptadenia rigida.......................................35
3.2.1. Isolation procedure.........................................................................................35
3.2.2. Structure elucidation of the monomeric flavan‐3‐ols.....................................35
3.2.3.   of the dimeric flavan‐3‐ols.........................................126
3.2.4. Conformational studies of the isolated dimers ............................................162
3.2.5. HPLC  identification  and  quantification  of  the  compounds  in  the  ethanolic 
extract…….......................................................................................................................169
3.2.6. Biological activity...........................................................................................170
4. Discussion............................................................................................178
4.1. Screening phase...............................................................................................178
4.2. Phytochemical analysis of the ethanolic extract of P. rigida.............................180 II                                                                                                                                                             Index 
4.3. Structure elucidation of the catechin derivatives.............................................181
4.4. Conformational studies....................................................................................186
4.5. Studies on the biological activity .....................................................................189
4.5.1. Wound healing activity ‐ Scratch assay.........................................................189
4.5.2. Anti‐inflammatory properties ‐ NF‐κB EMSA and p38α MAPK assay...........191
5. Summary..............................................................................................196
6. Experimental procedure.......................................................................199
6.1. Materials.........................................................................................................199
6.1.1. Chemicals......................................................................................................199
6.1.2. Antibodies, cytokines, enzymes, kits ............................................................201
6.1.3. Consumables.................................................................................................202
6.1.4. Instruments...................................................................................................203
6.1.5. Computer softwares and databases.............................................................204
6.1.6. Plant material................................................................................................204
6.2. Methods..........................................................................................................205
6.2.1. Physico‐chemical and spectroscopy methods..............................................205
6.2.2. Chromatographic methods...........................................................................207
6.3. Extraction and fractionation procedure of P. rigida.........................................208
6.3.1. Ethanolic extract preparation and main fractions isolation.........................208
6.3.2. Catechin derivatives isolation.......................................................................213
6.3.3. Structural  elucidation  and  physico‐chemical  properties  of  the  isolated 
catechin derivatives.......................................................................................................216
6.4. Conformational analysis..................................................................................223
6.4.1. Heterocyclic ring and rotamer conformation analysis..................................224
6.5. Biological assays..............................................................................................225
6.5.1. Fibroblasts scratch assay...............................................................................225
6.5.2. NF‐κB electrophoretic mobility shift assay (EMSA)......................................226
6.5.3. p38α MAPK assay..........................................................................................230
6.5.4. Cytotoxicity – MTT assay231
6.5.5. Caspase‐3‐like assay......................................................................................232
6.5.6. Antibacterial assay........................................................................................232 Index   III
7. Literature.............................................................................................234
8. List of figures........................................................................................255
9. List of tables.........................................................................................260
10. List of abbreviations.............................................................................262
11. Acknowledgements..............................................................................263
12. Curriculum vitae...................................................................................265
 
 
 
 

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