Quantitative Analyse von T-Zell-Stimulation und Costimulation durch zelluläre Mikrosysteme [Elektronische Ressource] = Quantitative analysis of T cell stimulation and costimulation using cellular microsystems / vorgelegt von Karsten Köhler

De
Quantitative Analyse von T-Zell Stimulation und Costimulation durch zelluläre MikrosystemeQuantitative Analysis of T Cell Stimulation and Costimulation using Cellular MicrosystemsDISSERTATIONDer Fakultät für Chemie und Pharmazie der Eberhard-Karls-Universität Tübingen zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften2006vorgelegt vonKarsten KöhlerITag de r m ündlichen Prüfung : 3. A ugust 2006Dekan: Prof. D r. Stefan Laufer 1. Berichterstatter: Prof. D r. Hans-Georg Ra mmensee2. Berichterstatter: PD Dr. Rol and Broc kIIDie vorl iegende Arbeit w urde unt er Be treuung von H errn P rof. D r. Hans-Georg Ra mmensee unter Co-Be treuung und A nleitung von H errn P D Dr. Rol and Broc k a m Int erfakultären Ins titut für Z ellbiologie de r U niversität Tübingen i n de r Z eit von S eptember 2002 bi s April 2006 durc hgeführt. Ihne n be iden da nke ich s ehr he rzlich für da s fort gesetzte Int eresse an meiner Arbeit, exzellenten A rbeitsbedingungen und A rbeitsatmosphäre sowie da s m ir entgegengebrachte V ertrauen. IIIDanksagungenH erzlich be danken m öchte ich m ich be i allen K ollegen a us de n G ruppen von P D Dr. R. Broc k und P rof. D r. G. J ung. Be i m einen Laborkollegen D r. T homas André, Yi-Da Chung, F alk D uchardt, Dr. Martin E lbs, Nadja Fischer, Dr. Ra iner Fischer, Alexander G anser, Antje Hoff, H ans-Jörg H ufnagel, Wilfred H ummel, Dr. Oliver Mader, Dr.
Publié le : dimanche 1 janvier 2006
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Quantitative Analyse von T-Zell Stimulation
und Costimulation durch zelluläre
Mikrosysteme
Quantitative Analysis of T Cell Stimulation and Costimulation
using Cellular Microsystems
DISSERTATION
Der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Eberhard-Karls-Universität
Tübingen zur Erlangung des Grades eines Doktors der
Naturwissenschaften
2006
vorgelegt von
Karsten Köhler
ITag de r m ündlichen Prüfung : 3. A ugust 2006
Dekan: Prof. D r. Stefan Laufer

1. Berichterstatter: Prof. D r. Hans-Georg Ra mmensee
2. Berichterstatter: PD Dr. Rol and Broc k
IIDie vorl iegende Arbeit w urde unt er Be treuung von H errn P rof. D r. Hans-Georg Ra mmensee
unter Co-Be treuung und A nleitung von H errn P D Dr. Rol and Broc k a m Int erfakultären
Ins titut für Z ellbiologie de r U niversität Tübingen i n de r Z eit von S eptember 2002 bi s April
2006 durc hgeführt. Ihne n be iden da nke ich s ehr he rzlich für da s fort gesetzte Int eresse an
meiner Arbeit, exzellenten A rbeitsbedingungen und A rbeitsatmosphäre sowie da s m ir
entgegengebrachte V ertrauen.
IIIDanksagungen
H erzlich be danken m öchte ich m ich be i allen K ollegen a us de n G ruppen von P D Dr. R. Broc k
und P rof. D r. G. J ung.
Be i m einen Laborkollegen D r. T homas André, Yi-Da Chung, F alk D uchardt, Dr. Martin E lbs,
Nadja Fischer, Dr. Ra iner Fischer, Alexander G anser, Antje Hoff, H ans-Jörg H ufnagel,
Wilfred H ummel, Dr. Oliver Mader, Dr. Mariola Fotin-Mleczek, Günter Rot h, Ivo Rut tekolk,
Michael Sinzinger, Oda Stoevesandt, Dr. Söhnke V oss, Susanne V ollmer und S usann W olf
möchte ich m ich für di e jederzeit angenehme und he itere Atmosphäre am Arbeitsplatz
danken.
H ierbei m öchte ich T homas André für s eine Einführung i n de n Nanospotter, und für s eine
große Hilfsbereitschaft ni cht nur i n Com puter-Fragen da nken. Antje Hoff da nke ich für i hre
Einführung i n di e Zellkultur und i n di e zellbasierten E xperimente sowie in di e Laserscanning-
Mikroskopie. Ra iner Fischer da nke ich für s eine Einführung i n di e Peptidchemie und
-analytik.
Be i Günter Rot h, Prof. D r. Karl-Heinz W iesmüller und P rof. D ieter Kern für di e
Zusammenarbeit in de m interessanten Projekt zur S timulation von Z ellen m it
mikrostrukturierten O berflächen.
Dr. Be rnd M öhrle, J an Jaehrling, Nina Schweizer und P rof. D r. G. Gauglitz da nke ich für di e
spannende und e rfolgreiche Kooperation i m Bereich de r z ellulären Ri fS.
Dr. Ludger G rosse-Hovest, P rof. D r. Gundram Jung, für di e immer w ieder a nregende
Kooperation z ur U ntersuchung de r Effekte stimulatorischer Antikörper
Dr. Anne-Marie Lellouch, Dr. Hans Rogl und P rof. D r. Be rnard M alissen vom CNRS-
INSERM für di e erfolgreiche Kooperation und di e Generierung de r G FP-T-Zell-Linien, sowie
der Be reitstellung on A ntikörpern. A usserdem da nke ich Prof. D r. Ca rl Figdor, D r. Chri stian
Freund, D r. Be n Joosten, PD Dr. Re iner Lammers, Dr. Patrick Pankert und D r. Aukje
Zimmerman, für A ntikörper. Dr. Claus Belka für Z ell-Linien und P rof. D r. Stefan Laufer für
chemische Inhi bitoren
Ic h be danke m ich be i Nicole Sessler für P eptidsynthesen, Dr. T obias Seyberth für H ilfe be i
der H PLC und P rof. D r. Stefan S tevanović be danke ich m ich für di e Möglichkeit zur
Durchführung von M ALDI-TO F Messungen
Stefan W elte da nke ich für s eine immer w ieder in A nspruch ge nommene Hilfsbereitschaft.
Ursula Becker-S anzenbacher, Lisa Neumann und H eiderose Neu m öchte ich für i hre
Unterstützung i n S achen de r O rganisation und V erwaltung da nken.
Regina Bohne rt da nke ich für di e profe ssionelle Programmierung von M akros für di e
Bi ldanalyse.
Den Praktikanten H enrik G rabner, Laura Zöllner, Jan Niederländer, Anja Schindler für i hre
H ilfe be i de r Etablierung de r z ellulären S timulationsprotokolle.
Franziska Löwenstein da nke für da s Spülen und A utoklavieren von s ehr vi eler von m ir
benutzter G efäße und G eorg T iedemann für da s Bri ngen von vi elen Paketen.
Be danken m öchte ich m ich be i Prof. D r. H.-G. Ra mmensee für s eine Betreuung de r
Doktorarbeit, sowie de r Leitung de s Graduiertenkolleg 794 „Zelluläre Mechanismen
Im munassoziierter Prozesse“, und de n K oordinatorinnen V alerie Bahr, Re gine Grund und D r.
Be ttina W eiss für di e langjährige U nterstützung.
IVAdrian S chröder, Chri stan S pieth, Jochen S upper, Prof. D r. Z ell da nke ich für di e anregende
Kooperation i m Bereich de r Bi oinformatik.
Für di e Benutzung de r Mikroarray-S canner be danken w ir uns be i Georg O tto (MPI Tübingen)
und M ichael Hartmann (N MI Tübingen)
Für di e Finanzierung de r Projekte im Namen di eser Arbeit be danken w ir uns sehr be i de r
Volkswagen-S tiftung (I/ 77472). D er Deutschen G esellschaft für S ignaltransduktion (S TS)
and de r Europäischen K ommission da nke ich für Re isestipendien.
Ausserdem be danke ich m ich be i de nen, be i de nen i ch ve rgessen ha be, mich z u be danken.
V0.P reface an d contents of th is th esis 1
1.Introduction 5
1.1T CR-proxi mal signalling c omponents 5
1.2Adapter prot eins in T cell activation 7
1.3 Negative re gulation of t he early s teps in T CR s ignalling 10
1.4 L ipid- and c alcium-associated s ignals in T cell signalling 12
1.5 Cyt oskeletal effects and G prot eins 14
1.6 Cos timuli 15
1.7 Transcription fa ctors in T cell signalling 16
1.8 The immunological synapse 17
1.9 Chemical bi ology 18
1.10 Cellular m icroarrays 19
2.C ontributions to oth er projects 20
3.C hemical ge netics when timing is critical: A pharmacological concept for th e
maturation of T c ell contacts 21
3.1 Summary 21
3.2 Introduction 22
3.3 Re sults 23
3.3.1 F unctional integrity of fus ion prot eins 24
3.3.2 Transient re cruitment of Z AP-70-YFP to CD 3 clusters 24
3.3.3 ZAP-70-YFP colocalizes w ith CD 3 re ceptor c omplexes 26
3.3.4 Cont inuous Src-fa mily ki nase activity i s re quired for
maintenance of c ell contacts onl y i n t he early pha se of c ell
attachment 29
3.3.5 Cell de tachment is actin i ndependent 32
3.3.6 Cell re traction upon S rc-fa mily ki nase inhibition oc curs by
detachment of c ontacts 33
3.4 Discussion 35
3.4.1 Signalling c luster m aturation on a nti-CD3-coated s urfaces 35
3.4.2 M olecular m echanism of c ontact m aturation a nd de tachment37
3.4.3 A nalyis of T cell contacts by c hemical ge netics 37
4. Functional Profiling of C hemical Inhibitors an d Th erapeutic Antibodies using
Cellular M icroarrays 40
4.1 Summary 40
4.2 Introduction 41
4.3 Results 42
VI4.3.1 Implementation of c ellular m icroarrays 42
4.3.2 A ttachment of c ells to t he m icroarrays 45
4.3.3 E ffects of s mall m olecule inhibitors 48
4.3.4 F unctional characterization of a supraagonistic anti-CD28
antibody 52
4.3.5 A nalysis of prot ein c lustering by c onfocal microscopy 56
4.3.6 Q uantification of prot ein c lustering 58
4.4. D iscussion 60
4.4.1 Inhibitor e ffects on c ell spreading a nd N FAT translocation 61
4.4.2 F unctional profi ling of a supraagonistic antibody 64
5. C ell stimulation using mi crostructured surfaces 66
5.1 Int roduction 66
5.2 Re sults and D iscussion 66
5.2.1 A ctin c ytoskeletal re arrangements 67
5.2.2 A nalysis of i nfluences of l ocal stimulation on l ocal and
global prot ein phos phorylation 67

5.3.1 Effects of s timulus size on phos photyrosine clustering 71
6. Lab el-fr ee Characterisation of C ell Adhesion using R eflectometric
Interference Spectroscopy (R IfS) 74
6.1 Summary 74
6.2 Introduction 75
6.3 Re sults and D iscussion 77
6.3.1 Spreading of T cells on a ntibody-func tionalized s urfaces 78
6.3.2 L abel-fre e de tection of c ell attachment by RIfS 80
6.3.3 Cha racterization of m utant cell lines and c hemical inhibitors81
6.3.4 Corre lation of ki netics of c ell attachment and c ell spreading 83
6.4 Conc lusion 85
7. A nalysis of T c ell signalling u sing p eptide mi croarrays 86
7.1 Abstract 86
7.2 Introduction 87
7.3 Results 88
7.3.1 System establishment 90
7.3.2 E xperimental de sign 92
VII7.3.3 P hosphorylation-de pendent changes in i nteraction profi les 96
7.3.4 D issection of c omplex a rchitectures by pe ptide
competition a nd t itration 96
7.3.5 E ffect of s ingle prot ein de ficiency on t he
interaction ne twork 97
7.3.6 Stimulus-de pendence of prot ein i nteractions
in T cell activation 101
7.4 D iscussion 103
8. Exp erimental procedures 107
8.1 General 107
8.1.1 Inhi bitors 107
8.1.2 Stimulatory a ntibodies 107
8.1.3 Cell culture 107
8.1.4 G eneration a nd c haracterization of 3A 9-fus ion prot ein
cell lines 108
8.1.5 Western Bl ots and c oimmunoprecipitation 109
8.1.6 E LIS A 109
8.2 Imaging of c ells in c ontact w ith i mmobilized s timuli 110
8.2.1 P roduction of s urfaces for a ntibody i mmobilization 110
8.2.2 A ntibody m icroarray proc edures 110
8.2.3 Cellular a ntibody s timulation e xperiments 111
8.2.4 P DMS stamps 111
8.2.5 F luorescence m icroscopy of l iving c ells 113
8.2.6 Immunofluorescence 114
8.2.7 Image acquisition a nd da ta analysis for c ell-activation
readouts 114
8.2.8 Imaging of s timulation-de pendent prot ein c lustering 116
8.2.9 Reflectometric Int erference Spectroscopy (RIF S) 120
8.3 P eptide m icroarrays 121
8.3.1 P eptide synthesis 121
8.3.2 G eneration of pe ptide m icroarrays 122
8.3.3 Readouts for pe ptide m icroarrays and
determination of prot ein c oncentration 122
8.3.4 P arallelized pe ptide m icroarray i ncubation a nd a nalysis 123
8.3.5 Image analysis of pe ptide m icroarrays 125
9. R eferences 128
10. Publications an d Presentations 149
10.1 Original Publications 149
10.2 Presentations 150
VIII11. Akademische Le hrer 152
IXAbbreviations
Ab antibody
Ac Acetyl
ACN Acetonitril
AcO H Acetic Acid
Ahx 6-aminohexanoic acid
APC antigen-pre senting c ell
BS A bovine serum albumin
DIPEA N,N’ diisopropylethylamine
DMF N,N’ dimethyl-form amide
DMSO dimethylsulfoxide
DMEM Dulbecco’s Modified E agle’s Medium
EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
FCS fetal calf s erum
FIT C fluorescein i sothiocyanate
Fmoc N-(9-fl uorenyl)m ethoxycarbonyl
G O PTS 3-(glycidyloxypropyl)trimethoxysilane
G SK-3 glycogen s ynthase ki nase-3
H BS H EPES-buffe red s aline
H EPES N-(2-hydroxye thyl)pi perazine-N’(2-ethanesulfonic acid)
H O Bt 1-hydroxybe nzotriazol
H PLC high-pe rformance liquid c hromatography
IT AM/IT IM immunoreceptor t yrosine-ba sed a ctivation/ inhibition m otif
wavelength
LAT linker of a ctivation i n T cells
LSM confocal laser s canning m icroscope
M molar
MALDI matrix-a ssisted l aser de sorption i onisation
MeO H methanol
MH C major hi stocompatibility c omplex
NFAT nuclear fa ctor of a ctivation i n T cells
PBS phosphate-buffe red s aline
PDMS polydimethylsiloxane
PDZ PSD 95/ Disk Large/ZO -1-like dom ain
PFA para-form aldehyde
PH pleckstrin hom ology dom ain
PI3K phosphatidylinositol-3’-kinase
PKC protein ki nase C
PLC phospholipase C
polyP poly-prol ine m otif
PTB phosphotyrosine bi nding dom ain
PTK protein t yrosine ki nase
pY phosphotyrosine (motif)
RIfS reflectometric interference spectroscopy
RT room temperature
SFK Src-fa mily ki nase
SH 2/SH 3 Src-hom ology dom ain 2/3
SH P SH 2-dom ain-c ontaining phos photyrosine phos phatase
SMAC supramolecular a ctivation c omplex
TCR T cell re ceptor
X
l

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