Recherche de déterminants génétiques permettant l'adaptation d'une souche Escherichia coli à la mamelle bovine, Screening and characterization of genetic markers for the bovine mammary gland adaptation of an Escherichia coli strain

De
Publié par

Sous la direction de Annie Dary, Yves Le Roux
Thèse soutenue le 24 octobre 2008: INPL
L’objectif de ce travail a été de caractériser la souche MPEC Escherichia coli P4. Une étude phylogénétique a montré qu’elle appartenait au groupe phylogénétique A de l’espèce E. coli et que son génome “core” se rapprochait de celui de la souche commensale non pathogène E. coli K12 MG1655 appartenant également au groupe A. Une recherche au sein de son génome de gènes codant différents facteurs de virulence connus chez les autres pathotypes de l’espèce E. coli a permis de détecter uniquement la présence du gène traT, codant un facteur de résistance au sérum. Un criblage de quinze loci d’ARNt connus pour accueillir fréquemment des îlots génomiques, effectué au sein de son génome, a révélé, pour sept d’entre eux la présence de telles structures. Le séquençage partiel ou complet des régions aval à ces sept loci a montré la présence systématique de séquences nucléotidiques différentes de celles présentes chez E. coli K12 MG1655. Si l’analyse du contenu de ces îlots n’a pas encore permis d’expliquer directement la virulence d’E. coli P4, leur mise en évidence est une première de ce type au sein du pathotype MPEC et laisse envisager la découverte d’autres régions génomiques spécifiques à ce pathotype, pouvant expliquer son tropisme et sa nature. Par ailleurs, afin d’évaluer le rôle d’E. coli P4 dans la caséinolyse élevée du lait observée lors d’une mammite bovine, une sécrétion apparemment constitutive de quatre protéases extracellulaires a été mise en évidence par zymographie caséines. L’activité caséinolytique de ces enzymes ne semble toutefois pas significative, laissant envisager plutôt un rôle dans la virulence de la souche
-Escherichia coli
-Mammite bovine
-Caséinolyse
-Protéase
-Virulence
-Ilot génomique
The objective of this work was to characterize the MPEC Escherichia coli P4 strain. A phylogenetic study showed that it belongs to the phylogenetic group A of the E. coli species and that its core genome is similar to the one of the commensal non-pathogenic E. coli K12 MG1655 strain which also belongs to the group A. A search in its genome of different genes encoding virulence factors known among other pathotypes of the E. coli species was done and only the traT gene, encoding a serum resistance factor, was detected. A screening of fifteen tRNA loci known for frequently hosting genomic islands, made in its genome, revealed for seven of them the presence of such structures. The partial or complete sequencing of the regions downstream from these seven loci showed the systematic presence of nucleotide sequences different from those present in E. coli K12 MG1655. If the content analysis of these islands does not yet explain the virulence of E. coli P4, their highlighting is the first of this kind in the pathotype MPEC and suggests the discovery of other genomic regions specific to this pathotype, which may explain its tropism and its nature. In addition, to assessing the role of E. coli P4 in milk caseinolysis observed during bovine mastitis, a constitutive secretion of four extracellular proteases was highlighted by casein zymography. However, the caseinolytic activity of these enzymes does not seem significant. This fact may suggest a role in virulence of the strain
-Escherichia coli
-Virulence
-Genomic island
-Bovine mastitis
-Caseinolysis
-Protease
Source: http://www.theses.fr/2008INPL050N/document
Publié le : jeudi 27 octobre 2011
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Ecole :
Ecole Nationale Supérieure d’Agronomie et des Industries
Alimentaires
Ecole doctorale :
Sciences et Ingénierie des Ressources Procédés Produits et Environnement





Thèse

présentée pour l’obtention du titre de

Docteur de l’Institut National Polytechnique de Lorraine

en Sciences Agronomiques

par Delphine DUFOUR





Recherche et caractérisation de déterminants génétiques permettant
l’adaptation d’une souche d’Escherichia coli à la mamelle bovine




Soutenue publiquement le 24 octobre 2008 devant la commission d’examen :




Membres du jury :

Rapporteurs : C. Le Bouguènec, Chef de Laboratoire, Institut Pasteur, Paris
C. Burvenich, Professeur, Faculté de Médecine Vétérinaire, Gand, Belgique

Examinateurs : P. Germon, Chargé de recherche, Institut National de la Recherche
Agronomique, Tours
Y. Le Roux, Maître de Conférence, Institut National Polytechnique de Lorraine,
Nancy
A. Dary, Professeur, Université Henri Poincaré, Nancy 1




Unité de Recherche sur l’Animal et les Fonctionnalités des Produits Animaux
Faculté des Sciences – 54506 Vandoeuvre les Nancy

1






























2 Remerciements

Merci Messieurs les Professeurs Jean-Luc Gaillard et Guido Rychen de m’avoir accueillie au sein de
votre laboratoire et de la confiance que vous m’avez témoignée pour la réalisation de ce travail.

Merci Madame Annie Dary et Monsieur Yves Le Roux pour tous les savoirs que vous m’avez
transmis, pour le suivi rigoureux et attentif de mes travaux et pour votre gentillesse de tous les
instants.

Merci Madame Chantal Le Bouguènec et Monsieur Christian Burvenich d’avoir accepté d’être
rapporteurs de ce travail.

Merci Monsieur Pierre Germon pour votre accueil lors de mon séjour à Tours, d’avoir accepté de
juger ce travail et surtout pour le suivi, les conseils et l’aide considérable que vous m’avez si
gentiment accordés pour sa réalisation.

Merci Monsieur Gérard Guédon pour vos conseils qui m’ont aidé à mieux comprendre et interpréter
mes résultats.

Merci Emilie pour ta précieuse aide technique de haute qualité et nos bavardages de tout et de rien.

Merci Nawara et Wessam pour votre gentillesse, votre bonne humeur et les moments de franches
rigolades que nous avons eu ensemble. Je vous souhaite une belle réussite pour la suite et d’être
heureux comme vous le désirez.

Merci Monsieur Gérard Humbert de m’avoir accueillie pour la toute première fois au laboratoire et
pour votre gentillesse.

Merci Monsieur Alain Driou pour votre gentillesse.

Merci Madame Catherine Corbier de la confiance que vous me témoignez pour m’avoir accordé des
postes d’ATER à l’IUT.

Merci Chantal, Clarisse, Katy, Madame Lagrange, Laurent, Jean-Michel, Frank, Oukni, Maira,
Aurélie, Emeline, Céline et Faiza.

Papa, je te dédie ce travail, maman, je t’embrasse très fort, et je vous remercie tous les deux d’être
toujours là pour moi et avec moi car j’en ai toujours eu besoin et j’en aurai toujours besoin.

Mon amour et mon petit bébé, je vous aime et vous fais mille bisous tous doux.












3




































4 Sommaire































5































6 Sommaire ............................................................................................................................................................................... 5
Abréviations ........................................................................................................................................................................ 11
Liste des figures ................................................................................................................................................................... 15
Liste des tableaux ................................................................................................................................................................ 19
Introduction ......................................................................................................................................................................... 23
Avant-propos ....................................................................................................................................................................... 25
1. Les éléments génétiques bactériens mobiles ou mobilisables par transfert génétique horizontal ............................ 28
1.1. Présentation de différents types ................................................................................................................................ 29
1.1.1. Les plasmides .................................................................................................................................................... 29
1.1.2. Les transposons ................................................................................................................................................. 31
1.1.3. Les intégrons ..................................................................................................................................................... 33
1.1.4. Les prophages .................................................................................................................................................... 36
1.1.5. Les îlots génomiques ......................................................................................................................................... 37
1.2. Mécanismes responsables de leur mobilité intercellulaire ....................................................................................... 39
1.2.1. La transformation .............................................................................................................................................. 40
1.2.2. La conjugaison .................................................................................................................................................. 43
1.2.3. La transduction .................................................................................................................................................. 47
1.3. Mécanismes responsables de leur insertion chromosomique .................................................................................... 47
1.3.1. La recombinaison homologue ........................................................................................................................... 48
1.3.2. La recombinaison site-spécifique ...................................................................................................................... 48
1.3.3. La recombinaison transpositionnelle ................................................................................................................. 52
2. Les apports fonctionnels des éléments génétiques mobiles ou mobilisables bactériens ............................................ 54
2.1. La symbiose ............................................................................................................................................................... 55
2.2. Le métabolisme .......................................................................................................................................................... 57
2.2.1. Métabolisme des composés organiques “naturels” ............................................................................................ 57
2.2.2. Métabolisme des composés organiques “ non naturels” .................................................................................... 58
2.2.3. Métabolisme des métaux lourds ........................................................................................................................ 60
2.3. La résistance aux antibiotiques ................................................................................................................................. 61
2.3.1. L’élément SXT .................................................................................................................................................. 62
2.3.2. L’élément SGI1 ................................................................................................................................................. 63
2.3.3. L’élément SCCmec ........................................................................................................................................... 65
2.3.4. L’élément pNR1 ................................................................................................................................................ 66
2.4. La virulence ............................................................................................................................................................... 67
2.4.1. Les plasmides porteurs de fonctions de virulence ............................................................................................. 68
2.4.2. Les prophages porteurs de fonctions de virulence ............................................................................................. 68
2.4.3. Les îlots génomiques porteurs de fonctions de virulence .................................................................................. 70
2.5. Conclusion ................................................................................................................................................................ 74
3. Les éléments génétiques mobiles ou mobilisables et leur impact sur la diversification de l’espèce Escherichia coli
.............................................................................................................................................................................................. 75
3.1. Situation de l’espèce E. coli au sein de la famille Enterobacteriaceae ...................................................................... 76
3.1.1. Proximité des genres Escherichia, Shigella et Salmonella ................................................................................ 77
3.1.2. Escherichia coli au sein du genre Escherichia .................................................................................................. 78
3.2. Etude comparative des génomes de différentes souches de l’espèce E. coli ............................................................. 79
3.2.1. Génome de la souche E. coli K12 MG1655 ...................................................................................................... 81
3.2.2. Génome de la souche E. coli O157:H7 Sakaï .................................................................................................... 82
3.2.3. Génome de la souche E. coli CFT073 ............................................................................................................... 85
3.2.4. Génome de la souche E. coli APEC01 .............................................................................................................. 87
3.2.5. Etude partielle des génomes des souches E. coli A0 34/86 et E. coli Nissle 1917 ............................................ 88
3.2.6. Conclusion ......................................................................................................................................................... 89
3.3. Description des différents pathotypes de l’espèce E. coli ......................................................................................... 89
7 3.3.1. Pathotypes intestinaux ....................................................................................................................................... 89
3.3.2. Pathotypes extra-intestinaux .............................................................................................................................. 91
3.3.3. Relation entre pathotypes et groupes phylogénétiques ...................................................................................... 92
4. Objectif du travail : caractérisation d’une souche Escherichia coli inductrice de mammites bovines .................... 94
4.1. Présentation des mammites bovines .......................................................................................................................... 94
4.1.1. Définition........................................................................................................................................................... 94
4.1.2. Agents inducteurs .............................................................................................................................................. 95
4.1.3. Conséquences .................................................................................................................................................... 96
4.2. Connaissances actuelles des souches E. coli inductrices de mammites bovines ....................................................... 97
4.2.1. Variabilités génotypique et pathologique .......................................................................................................... 97
4.2.2. Constance du lipopolysaccharide ...................................................................................................................... 99
4.2.3. Apparition de souches persistantes et invasives .............................................................................................. 100
4.3. Problématique abordée ........................................................................................................................................... 101
Résultats ............................................................................................................................................................................. 103
1. Etude de la croissance d’E. coli P4 dans un lait issu de mammite bovine ................................................................ 105
2. Typage moléculaire d’E. coli P4 .................................................................................................................................. 107
2.1. Détermination du groupe phylogénétique et séquençage d’un ITS 16S-23S ........................................................... 107
2.2. Séquençage de multiples loci (MLST) ..................................................................................................................... 108
3. Etude du rôle d’E. coli P4 dans la caséinolyse du lait observée lors d’une mammite ............................................. 109
3.1. Mise en évidence d’une sécrétion de protéases extracellulaires par la technique de zymographie ........................ 110
3.2. Evaluation de l’activité caséinolytique d’E. coli P4 et des quatre protéases extracellulaires mises en évidence .. 113
3.3. Essai de purification des protéases extracellulaires mises en évidence .................................................................. 116
3.4. Publication .............................................................................................................................................................. 120
4. Recherche de séquences nucléotidiques particulières à E. coli P4 ............................................................................ 120
4.1. Recherche de facteurs de virulence ......................................................................................................................... 132
4.2. Recherche d’îlots génomiques ................................................................................................................................. 134
4.2.1. Criblage des loci d’ARNt ................................................................................................................................ 134
4.2.2. Caractérisation partielle des régions aval des loci asnT, leuX, pheV et thrW grâce à une technique de PCR
arbitraire .................................................................................................................................................................... 136
4.2.2.1. Cas du locus asnT ......................................................................................................................................... 138
4.2.2.2. Cas du locus leuX ......................................................................................................................................... 138
4.2.2.3. Cas du locus pheV ........................................................................................................................................ 140
4.2.2.4. Cas du locus thrW ......................................................................................................................................... 142
4.2.3. Caractérisation partielle de la région aval au locus serU grâce au séquençage partiel d’un cosmide recombinant
................................................................................................................................................................................... 142
4.2.4. Caractérisation complète de la région aval au locus argW .............................................................................. 143
4.2.4.1. Contenu en ORFs ......................................................................................................................................... 144
4.2.4.2. Analyse de l’ORF 4-argW ............................................................................................................................ 148
4.2.5. Conclusion ....................................................................................................................................................... 149
4.3. Affiche ..................................................................................................................................................................... 150
4.4. Publication .............................................................................................................................................................. 151
Discussion et perspectives ................................................................................................................................................. 181
1. E. coli P4 appartient au groupe phylogénétique A de l’espèce E. coli ...................................................................... 185
2. Implication d’E. coli P4 dans la caséinolyse observée lors d’une mammite bovine ................................................ 188
2.1. Mise en doute du rôle caséinolytique des quatre protéases extracellulaires mises en évidence ............................. 188
2.2. Rôle des protéases extracellulaires sécrétées par les bactéries E. coli pathogènes................................................ 190
8 3. Recherche, au sein du génome d’E. coli P4, de gènes codant des facteurs de virulence connus chez les autres
pathotypes de l’espèce E. coli ........................................................................................................................................... 192
3.1. Pertinence des gènes de virulence recherchés ........................................................................................................ 192
3.1.1. Gènes bactériens de résistance aux défenses immunitaires hôtes .................................................................... 192
3.1.1.1. Gènes neuA-neuC ......................................................................................................................................... 194
3.1.1.2. Gène traT ...................................................................................................................................................... 194
3.1.1.3. Gène iucD ..................................................................................................................................................... 195
3.1.2. Gènes bactériens d’adhérence et d’invasion aux cellules hôtes ....................................................................... 197
3.2. Hypothèses expliquant les résultats obtenus ........................................................................................................... 200
4. E. coli P4 renferme dans son génome plusieurs îlots génomiques potentiels à proximité de différents loci d’ARNt
............................................................................................................................................................................................ 203
4.1. Analyse des loci d’ARNt altérés partiellement caractérisés .................................................................................... 203
4.1.1. Cas du locus asnT ............................................................................................................................................ 203
4.1.2. Cas du locus leuX ............................................................................................................................................ 204
4.1.3. Cas du locus pheV ........................................................................................................................................... 205
4.1.4. Cas du locus thrW ............................................................................................................................................ 207
4.1.5. Cas du locus serU ............................................................................................................................................ 207
4.2. Analyse de l’îlot génomique argW entièrement caractérisé .................................................................................... 208
4.2.1. Caractéristiques générales ............................................................................................................................... 208
4.2.2. Hypothèses sur le rôle de la protéine codée par l’ORF 4-argW ...................................................................... 213
4.3. Conclusion .............................................................................................................................................................. 216
Références bibliographiques ............................................................................................................................................ 217
Résumé ............................................................................................................................................................................... 245
Annexe ............................................................................................................................................................................... 249


















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