Reconstitution d'un système cellulaire de glycosylation : application à la synthèse des o-glycannes, Reconstitution of a glycosylation cellular system : application of glycan synthesis

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Sous la direction de Assou El-Battari
Thèse soutenue le 16 décembre 2010: Aix Marseille 2
La glycosylation des protéines est une modification co/post-traductionnelle, localiséeprincipalement dans l’appareil de golgi, impliquée dans divers processus physiologiques. Àl’inverse de la synthèse des protéines et des nucléotides, celle des sucres est plus complexe,en partie, à cause des nombreux branchements structuraux et de la diversité stéréochimiquedes glycannes. Les glycosyltransférases sont les enzymes responsables de la biosynthèse desoligo- et polysaccharides. Cependant, il existe différents procédés permettant de réaliser lasynthèse in vitro d’oligosaccharides tels que des procédés chimiques, enzymatiques ouchimio-enzymatiques. La Core 2 β(1,6)-N-acétylglucosaminyltransférase I (C2GnT-I) est uneglycosyltransférase (GT) transmembranaire de type II qui crée une liaison β1,6 entre une Nacétylglucosamine(GlcNAc) et la N-acétylgalactosamine (GalNAc) d’un noyau Core 1,formant ainsi une structure branchée de type Core 2. Une fois le branchement Core 2 initié,au moins trois réactions successives de transfert peuvent avoir lieu, impliquant les β(1,4)-galactosyltransférases, les α(2,3)-sialyltransférases et les α(1,3)-fucosyltransférases. Il estadmis que les GTs sont réparties séquentiellement dans les compartiments cis, médian ettrans de l’appareil de Golgi selon leur ordre d’intervention et le type cellulaire. Nous avonsmis au point un procédé de reconstitution membranaire, comportant des glycoprotéinesgolgiennes, dont les GTs, par l’intermédiaire d’une lectine, la wheat germ agglutinin (WGA).Il est admis que la WGA interagit avec les composants de la membrane plasmique et ceux del’appareil de Golgi. L’étude de notre système membranaire reconstitué a mis en évidence uneactivité élevée de la C2GnT-1 in vitro, et son efficacité à synthétiser des oligosaccharidesbranchés Core 2, par glycosylation séquentielle.
-Glycosylation
-Reconstitution membranaire
-O-glycannes
-Glycosyltransférases
-Core2 β16- N-acetylglucosaminyltransférase
-Synthèse d’oligosaccharides
Protein glycosylation is a co/posttranslational modification, localized in the Golgi apparatus,involved in various physiological processes. Sugar synthesis is more complex than that ofproteins and nucleic acids, in part because of the glycosidic bond and glycan stereochemistrydiversity. Glycosyltransferases are enzymes responsible of oligo- and polysaccharidesbiosynthesis. Various methods are used for the synthesis of oligosaccharides, in vitro, suchas chemical, enzymatic or chemo-enzymatic. Core 2 β(1,6)-N-acetylglucosaminyltransferase I(C2GnT-I) is a type-II transmembrane glycosyltransferase (GT). This enzyme create a β1,6bond between N-acetylglucosamine (GlcNAc) and Core 1 N-acetylgalactosamine (GalNAc),forming a Core 2 branched structure. Once the Core 2 branch is initiated, at least threesuccessive transfer reactions can take place, involving β(1,4)-galactosyltransferases, α(2,3)-sialyltransferases and α(1,3)-fucosyltransferases. It is known that GT are distributedsequentially in the cis, medial and trans Golgi apparatus in order of intervention andaccording to cell type. We have developed a membrane reconstitution process comprisinggolgi glycoproteins, including GT, by the use of a lectin, the wheat germ agglutinin (WGA). Itis known that WGA interacts with plasma membrane and Golgi apparatus components. Ourreconstituted membrane system showed a high C2GnT-1 activity in vitro and its effectivenessin synthesizing Core2 branched oligosaccharides by sequential glycosylation.
-Glycosylation
-Membrane reconstitution
-O-glycans
-Glycosyltransferases
-Core2 β16-Nacetylglucosaminyltransferase
-Oligosaccharide synthesis
Source: http://www.theses.fr/2010AIX20713/document
Publié le : jeudi 27 octobre 2011
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UNIVERSITÉ DE LA MÉDITERRANÉE

FACULTÉ DE MÉDECINE DE MARSEILLE

ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTÉ


THÈSE

Présentée et soutenue publiquement par

Melle Sandrine SUSINI

Le 16 Décembre 2010


Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE LA MÉDITERRANÉE

Spécialité : Oncologie



RECONSTITUTION D’UN SYSTÈME CELLULAIRE DE
GLYCOSYLATION

APPLICATION À LA SYNTHÈSE DES O-GLYCANNES







Thèse dirigée par le Pr. Assou EL-BATTARI



Président : Mr. José LUIS Professeur, Université de Provence

Rapporteurs : Mme. Véronique PILLER Chargée de Recherches, Université d’Orléans
Mr. Ossarath KOL Professeur, Université de Lille

Examinateurs : Mme. Claire DUMON Chargée de Recherches, INSA de Toulouse
Mr. Assou EL-BATTARI Professeur, Université de Provence


































“ Ce n’est pas assez de faire des pas qui doivent un jour conduire au
but, chaque pas doit être lui-même un but en même temps qu’il nous
porte en avant.”


Goethe

Conversations avec Eckermann









































A ma mère.



REMERCIEMENTS



Il n’est pas évident de trouver les mots justes pour remercier toutes les personnes qui m’ont
apporté leur soutien pendant ces quatre années...

Je commencerai par remercier le docteur Dominique Lombardo, directeur du CRO2, de
m’avoir accueilli en 2005 au sein de l’Unité 777 et de m’avoir permis d’obtenir une bourse
afin de réaliser ma thèse dans son laboratoire.

Je remercie sincèrement mon directeur de thèse, le professeur Assou El-Battari. Assou, votre
enthousiasme, votre dynamisme et votre passion pour votre spécialité ont été un réel
moteur durant ces années. Je ne saurais jamais assez vous remercier pour votre soutien,
pour vos encouragements. Votre optimisme m’a permis dans les moments d’incertitude de
trouver la motivation nécessaire afin d’arriver aux buts que nous nous étions fixés. Grâce a
vous, j’ai non seulement eu l’occasion de travailler sur un sujet passionnant, mais j’ai
également pu m’initier à l’enseignement grâce au poste d’ATER. A toutes vos qualités
professionnelles s’ajoutent votre gentillesse et votre générosité qui ont contribué à rendre
ces années de thèse inoubliables.

Je remercie les membres de mon jury d’avoir accepté de juger mon travail de thèse. Mme.
Véronique Piller et Mr. Ossarath Kol, rapporteurs. Mme. Claire Dumon, examinatrice. Merci
également au professeur José Luis d’avoir accepté de présider mon jury de thèse.

J’adresse tous mes remerciements à Charlotte Jeanneau. Charlotte, comment trouver les
bons mots ? Je ne pense pas que tu saches à quel point ta présence a été précieuse pour
moi ces dernières années. Merci pour ta disponibilité (jusqu’à des heures tardives alors que
tes fils t’attendaient impatiemment chez toi...), ta persévérance (comme pour l’obtention des
constructions FUT7 ou PSGL-1 recombinant) et ta patience. Merci également pour tes
nombreux conseils tous aussi inestimables les uns que les autres. Merci infiniment Charlotte.

Je tiens à remercier chaleureusement Sylvie Mathieu. Sylvie, votre détermination et vos
engagements ont contribué à gommer les moments d'inquiétude. Merci pour votre écoute,
votre disponibilité, votre soutien pendant toutes ces années au laboratoire. Merci pour tout
Sylvie.

Je remercie également Sylvie Carmona. Merci Sylvie pour ta générosité, pour ta bonne
humeur. Merci pour ta contribution si précieuse dans les manips fastidieuses, tu n’as jamais
hésité à me proposer ton aide, je t’en suis infiniment reconnaissante. Merci également pour
tes petites attentions. Sylvie ta présence a été un véritable soutien, je te remercie
sincèrement.

Je tiens à remercier l’ensemble des membres du CRO2 qui m’ont soutenu au cours de ces
années, particulièrement à Françoise Silvy pour sa disponibilité, Evelyne Béraud pour ses
conseils et ses attentions. Merci également à Nadine Bruneau qui a été présente au début de
ma thèse et sans qui je n’aurais jamais intégré le groupe d’Assou El-Battari.

Je tiens à remercier les filles qui ont rendu le quotidien du laboratoire si agréable et avec qui
des amitiés sincères se sont créées.



Merci à Lydie Crescence. Ma petite Lydie, dès mon arrivée tu m’as accueillie
chaleureusement. Ta générosité, ta spontanéité, ta gentillesse, tes encouragements, ta
confiance en moi m’ont donné beaucoup de courage et de détermination. Tu es une
personne exceptionnelle, je suis chanceuse de t’avoir rencontré et de t’avoir eu à mes côtés
tout au long de ces années. Merci pour tes conseils, ton soutien et ton amitié. Je ne saurais
jamais assez te remercier de tout ce que tu m’as apporté...

Merci également à Cécile Franceschi. Cécile, tu as toujours eu les mots justes pour détendre
l’atmosphère quand les situations avaient tendance à se corser... (et il y en a eu des
situations complexes depuis le DEA !) Je te remercie pour ton écoute et ta disponibilité sans
faille qui ont été un véritable réconfort.

Merci à Aurélie Collignon. Aurélie tu as toujours été présente depuis que tu as intégré le
labo. Je te remercie pour ton soutien, pour tes petites attentions ainsi que pour ta
disponibilité.

A toutes les trois, je vous souhaite beaucoup de bonheur et bonne continuation dans la
Recherche (ou pas...).

Je remercie également Elodie Ristorcelli. Elodie, bien que tu sois partie faire ton post-
doctorat depuis 2 ans, il m’était impossible de ne pas te citer dans mes remerciements ! Je
te remercie pour tes conseils bienveillants. Ta passion pour ton travail et ta détermination
ont été une source d’inspiration.

Je remercie mon père pour tout ce qu’il a fait pour moi. Papa, tu m’as toujours poussé à
donner le meilleur de moi-même, sans toi je n’aurais certainement pas été aussi loin. Je te
remercie pour tout l’amour et la confiance que tu me portes. J’ai une chance fabuleuse de
t’avoir.

Merci également à ma sœur qui m’a toujours épaulé. Stéphanie je te remercie d’avoir
toujours été présente, à n’importe quel moment. Merci pour ton soutien, ta patience. Merci
de supporter mon caractère si souvent pénible... Merci de m’avoir fait déconnecter du labo
en rendant mes week-ends si agréables grâce à (entre autres) Chjara-Stella et Jean-Mathieu.
Merci d’avoir cru en moi, du fond du cœur, merci.

Merci à Mathieu qui a supporté les 660 kilomètres qui nous ont séparé ces cinq années et
tous les allers-retours en TGV. Mathieu je ne te remercierai jamais assez de toute la
confiance que tu m’as accordée, de ton soutien quotidien, de ta compréhension, de ta
patience. Merci infiniment pour tout cela et pour tout le reste...

Merci à ma colocataire préférée. Gaëlle, tu m’as tellement entendu parler du labo... Un
immense merci pour ton écoute et tes encouragements. Merci également à Marie-Madeleine,
d’avoir suivi de si près cette thèse. Merci pour ton soutien, merci pour tout.

Je tiens à remercier mes amies qui m’ont soutenu tout au long de cette aventure. Merci
Norah pour ton soutien, tes encouragements, merci pour tous ces moments passés au
laboratoire ou non et qui m’ont permis de décompresser. Merci à Nathalie, toujours présente
depuis la Corse. Merci de te préoccuper autant de moi, nos longues conversations
téléphoniques m’ont apporté beaucoup de réconfort. Merci pour tout. Merci à Céline d’avoir
su me changer les idées, généralement autour d’un café, en me parlant de tous ses projets
architecturaux, merci pour ton soutien Célinette.



Je remercie l’ADEREM qui a financé les trois derniers mois de ma thèse.

Je terminerai en remerciant tous ceux qui, bien que non cités, resteront chers à mon cœur.

Merci à toutes et à tous.






ABRÉVIATIONS





A Core2GlcNAcT : Core2-("1,6)-N-
ADN : Acide désoxyribonucléique
acétylglucosaminyl-transférase
ADNc : Acide désoxyribonucléique
Core3GlcNAcT : Core3-("1,3)-N-
complémentaire
acétylglucosaminyl-transférase
ADP : Adénosine diphosphate
Core4GlcNAcT : Core4-("1,6)-N-
Ala : Alanine
acétylglucosaminyl-transférase
!2-FucT : !(1,2)-fucosyltranférase
CRD : “Carbohydrate Recognition Domain”
!3-GalT : !(1,3)-galactosyltranférase
CSH : Cellule Souche Hématopoïétique
!3-ST : !(2,3)-sialyltranférase
CXCR2 : “C X C Chemokine Receptor type 2”
AMP : Adénosine monophosphate
CXCR4 : “C X C Chemokine Receptor type 4”
AMPc : Adénosine monophosphate cyclique

AP1 : “Activator Protein 1” D
Dol : Dolichol
Ara : Arabinose
Dol-P : Dolichol phosphate
Arg : Arginine

ARN : Acide ribonucléique
E
ARNm : Acide ribonucléique messager
EGF : “Endothelial Growth Factor”
Asn : Asparagine
EGFP : “Enhanced Green Fluorescent Protein”
ATP : Adénosine triphosphate
ELAM-1 : “Endothelial Leucocyte Adhesion

Molecule 1”
B
ERp57 : disulfure isomérase du réticulum
BacA2 : Bacillosamine (2,4-diamino-2,4,6-
endoplasmique
trideoxy-D-glucose)
ESL-1 : “E-selectin ligand-1”


C
C2GnT-I : Core 2 "(1,6)-N- F
Fuc : Fucose
acétylglucosaminyltransférase-I
Fuc-1-P : Fucose-1-phosphate
CAZY : “Carbohydrates-actives enzymes”
FucNAc : N-Acetylfucosamine
CHO : Cellules d’Ovaires de Hamsters Chinois
FucT : Fucosyltransférase
CIMPr : “Cation-Independent Mannose 6-
FucT-III : !(1,3/4)-fucosyltransférase III
Phosphate Receptor”
FucT-VI : !(1,3)-fucosyltransférase VI
CMP : Cytidine monophosphate
FucT-VII : !(1,3)-fucosyltransférase VII
CMP-NeuAc : Cytidine monophosphate acide
neuraminique
G
CMP-Sia : Cytidine monophosphate acide
Gal : Galactose
sialique
GalCer : Galactosylcéramide
COPI : “Coat protein I”
GalCer synthase : Galactosylcéramide
COPII : “Coat protein II”
synthase
Core1GalT : Core1-"1,3-galactosyltransférase
GalNAc : N-acétylgalactosamine

GalNAcT : N-acétylgalactosaminyltransférase


GalT : Galactosyltransférase ICAM-1 : “Intercellular Adhesion Molecule 1”
GDP : Guanosine diphosphate IL-(x) : Interleukine-x
GDP-Fuc : Guanosine diphosphate fucose IUBMB : “International Union of Biochemistry
GDP-Man : Guanosine diphosphate mannose and Molecular Biology”
GEMS : “Glycosyltransferase-Enriched
Membrane System” L
LAM : “Lymphocyte Adhesion Molecule”
Glc : Glucose
aLe : Lewis a
GlcCer : Glucosylcéramide
b
Le : Lewis b
GlcCer synthase : Glucosylcéramide synthase
x
Le : Lewis x
GlcNAc : N-acétylglucosamine
y
Le : Lewis y
GlcNAc-1-P : N-acétylglucosamine-1-
LFA-1 : “Lymphocyte Function Associated
phosphate
Antigen 1”
GlcNAcT: N-acétylglucosaminyltransférase
LS174T : cellules de carcinomes de colon
GlcT : Glucosyltransférase
Lys : Lysine
GlyCAM-1 : “Glycosylation-dependent cell

adhesion molecule 1”
M
GMP-140 : “Granule Membrane Protein 140”
Man : Mannose
GnT (x) : N-acétylglucosaminyltransférases(x)
Man-1-P : Mannose-1-phosphate
GPI : Glycophosphatidyl-inositol
Mann II : Mannosidase II
GPL : Glycérophospholipide
Man-6-P-EthN : Mannose-6-phosphate
GSL : Glycosphingolipide
Ethanolamine
GT : Glycosyltransférase
MAP kinases : “Mitogene activated protein
GVHD : “Graft Versus Host Disease”
kinase”

MSC : “Mesenchymal stem cell”
H

HCELL : “Hematopoietic cell E-/L- selectin
N
ligand”
NeuAc : Acide neuraminique
HEV : “High endothelial venules”
NF#B : “Nuclear Factor kappa B”
HL60 : cellules promyéloïdes cancéreuses
nm : nanomètre
humaines

HLA : “Human Leukocyte Antigen”
O
HTLV-1 : “Human T-Cell leukemic Virus OST : Oligosaccharidyltransférase
type1”
hMSC : “Human Mesenchymal stem cell” P
pH : Potentiel hydrogène
Hyl : Hydroxylysine
ppGalNAc-T(x) : Polypeptide N-
Hyp : Hydroxyproline
acétylgalactosaminyltransférase(x)

Pse : “Pseudaminic Acid”
I
IdoA : Iodoacétamide PSGL-1 : “P-selectin protein ligand-1”


R VLA-5 : “Very Late Antigen-5”
RE : Réticulum endoplasmique

Rha : Rhamnose
W
RITC : Rhodamine Isothiocyanate WGA : “Wheat germ agglutinin”
RNAse : Ribonucléase
X
Xyl : Xylose
S
SDF-1 : “Stromal derived Factor 1” Xyl-1-P : Xylose-1-phosphate
Ser : Sérine
SIGLEC : “Sialic acid immunoglobulin lectins”
SL : Sphingolipide
a
sLe : Sialyl-Lewis a
x
sLe : Sialyl-Lewis x
ST : Sialyltransférase
ST3GalI : "-Galactoside !(2,3)-
sialyltransférase I
ST3GalIV : "-Galactoside !(2,3)-
sialyltransférase IV
ST6GalI : "-Galactoside !(2,6)-
sialyltransférase I

T
Thr : Thréonine
TNF! : “Tumor necrosis factor !”
TM : “Transmembrane Domain”
Trp : Tryptophane

U
UDP-Gal : Uridine diphosphate galactose
UDP-GalNac : Uridine diphosphate N-
acétylgalactosamine
UDP-Glc : Uridine diphosphate glucose
UDP-GlcNac : Uridine diphosphate N-
acétylglucosamine
UTP : Uridine triphosphate

V
VCAM-1 : “Vascular Cell Adhesion Molecule 1”
VEGF : “Vascular Endothelial Growth Factor”
VLA-4 : “Very Late Antigen-4”

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