Regulation der transkriptionellen Aktivität der Isoformen des Drosophila-melanogaster-Ecdysteroid-Rezeptors (EcR) [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Christian Tremmel

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Regulation der transkriptionellen Aktivität der Isoformen desDrosophila melanogaster Ecdysteroid-Rezeptors (EcR)Dissertationzur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.der Fakultät für Naturwissenschaften an der Universität Ulmvorgelegt vonChristian Tremmelaus Landshut2010Amtierender Dekan der Fakultät für Naturwissenschaften der Universität Ulm:Prof. Dr. Axel GroßErstgutachterin:Prof. Dr. Margarethe Spindler-BarthZweitgutachter:Prof. Dr. Bernhard EikmannsTag der Promotion:24.06.2010InhaltsverzeichnisInhaltsverzeichnisEinleitung............................................................................................................................. 5Drosophila melanogaster Ecdysteroid-Rezeptor (EcR) ...................................................... 5Ultraspiracle (Usp) ............................................................................................................. 6Der funktionelle Ecdysteroid-Rezeptor............................................................................... 7DNA-Bindung..................................................................................................................... 7Ligandenbindung und Comodulatoren ............................................................................... 8Intrazelluläre Lokalisation..................................................................................................10Liganden von EcR ...................................................................
Publié le : vendredi 1 janvier 2010
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Regulation der transkriptionellen Aktivität der Isoformen des
Drosophila melanogaster Ecdysteroid-Rezeptors (EcR)
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
der Fakultät für Naturwissenschaften an der Universität Ulm
vorgelegt von
Christian Tremmel
aus Landshut
2010Amtierender Dekan der Fakultät für Naturwissenschaften der Universität Ulm:
Prof. Dr. Axel Groß
Erstgutachterin:
Prof. Dr. Margarethe Spindler-Barth
Zweitgutachter:
Prof. Dr. Bernhard Eikmanns
Tag der Promotion:
24.06.2010Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Einleitung............................................................................................................................. 5
Drosophila melanogaster Ecdysteroid-Rezeptor (EcR) ...................................................... 5
Ultraspiracle (Usp) ............................................................................................................. 6
Der funktionelle Ecdysteroid-Rezeptor............................................................................... 7
DNA-Bindung..................................................................................................................... 7
Ligandenbindung und Comodulatoren ............................................................................... 8
Intrazelluläre Lokalisation..................................................................................................10
Liganden von EcR ............................................................................................................11
Motivation und Ziele der Arbeit .........................................................................................11
Zusammenfassung von Ergebnissen und Diskussion ....................................................14
Literatur...............................................................................................................................20
Veröffentlichungen und Manuskripte................................................................................26
(I) Cronauer MV, Braun S, Tremmel Ch, Kröncke KD, Spindler-Barth M. 2007. Nuclear
localization and DNA binding of ecdysone receptor and ultraspiracle. Arch Insect
Biochem Physiol 65: 125-133.....................................................................................27
(II) Ruff H, Tremmel Ch, Spindler-Barth M. 2009. Transcriptional activity of ecdysone
receptor isoforms is regulated by modulation of receptor stability and interaction with
AB- and C-domains of the heterodimerization partner ultraspiracle. Arch Insect
Biochem Physiol 72: 154-171.....................................................................................36
(III) Tremmel Ch, Azoitei A, Schaefer M, Hollmann H, Spindler-Barth, M. Influence of
helix 12 of Drosophila melanogaster Ultraspiracle on ecdysone receptor function......54
(IV) Tremmel Ch, Schaefer M, Azoitei A, Ruff H, Spindler-Barth, M. Interaction of the N-
terminus of the ecdysone receptor isoforms with the ligand binding domain...............75
Eigenanteil an den Veröffentlichungen und Manuskripten...............................................102
Präsentation von Ergebnissen auf Kongressen und Meetings ........................................103
Danksagung......................................................................................................................104
Lebenslauf ........................................................................................................................106
Erklärung ..........................................................................................................................107
3Einleitung
Einleitung
Drosophila melanogaster Ecdysteroid-Rezeptor (EcR)
Ecdysteroide (Häutungshormone) sind die einzigen Vertreter der Steroidhormone in Insekten
und steuern neben Häutung und Metamorphose auch einige andere Prozesse wie Fortpflan-
zung, Verhalten und Metabolismus (Riddiford, 1993; Spindler et al., 2001). Die Hormonant-
wort der Ecdysteroide besteht überwiegend aus genomischen Effekten, die durch Bindung
des Hormons an einen nukleären Rezeptor, den Ecdysteroid-Rezeptor (EcR), gesteuert wer-
den (Koelle et al., 1991). Es ist auch eine Reihe nicht-genomischer Effekte von Ecdysteroi-
den beschrieben, wobei nicht sicher ist, ob diese Effekte ebenfalls von EcR, assoziiert mit
der Membran, oder von anderen membran-gebundenen Rezeptoren vermittelt werden
(Schneider et al., 1996; Ruffner et al., 1999; Schlattner et al., 2006).
Der Ecdysteroid-Rezeptor kommt in Drosophila melanogaster in drei Isoformen vor, EcR-A,
EcR-B1 und EcR-B2, die durch Verwendung verschiedener Transkriptionsstartpunkte und
durch unterschiedliches Spleißen aus einem Gen hervorgehen. Die Expression der EcR-
Isoformen im Tier erfolgt gewebespezifisch und abhängig vom Entwicklungsstadium (Talbot
A/B C D E F
1 198 235 301 402 624 849
EcR-A
1 227 264 330 431 653 878
EcR-B1
1 18 55 121 222 444 669
EcR-B2
keine
100 % Sequenz-IdentitätSequenz-Identität
DNA-Bindung
Ligandenbindung
Transaktivierung
AF-1 AF-2
Abb. 1: Schematische Darstellung der drei Isoformen des Drosophila melanogaster Ecdysteroid-Re-
zeptors mit Einteilung der Rezeptorproteine in die für Steroidhormon-Rezeptoren charakteristischen
Domänen A – F sowie einigen der ihnen zugeordneten Funktionen. AF = Transaktivierungsfunktion.
5Einleitung
et al., 1993). So ist EcR-A überwiegend in proliferierenden und sich differenzierenden Zellen
während der Metamorphose exprimiert und beispielsweise am Umbau von Neuronen betei-
ligt, wohingegen EcR-B1 und EcR-B2 vor allem in larvalen Zellen vorhanden sind, die wäh-
rend der Metamorphose durch Apoptose eliminiert werden (Talbot et al., 1993; Robinow et
al., 1993). Die Isoformen des Ecdysteroid-Rezeptors von Drosophila melanogaster weisen
die Domänenstruktur nukleärer Rezeptoren auf und unterscheiden sich lediglich in Länge
und Sequenz der N-terminalen Transaktivierungsdomäne AF-1 (A/B-Domäne; Abb. 1). Den
einzelnen Domänen lassen sich im Wesentlichen bestimmte Rezeptorfunktionen zuordnen
(Abb. 1), auch wenn sich in zunehmendem Maße zeigt, dass die Domänen nukleärer Re-
zeptoren nicht autonom voneinander agieren, sondern ein ausgeprägter direkter oder indi-
rekter „Cross-Talk“ zwischen Domänen besteht (Doesburg et al., 1997; Tetel et al., 1999;
Schaufele et al., 2005).
Ultraspiracle (Usp)
Der wichtigste Heterodimerisierungspartner von EcR ist Ultraspiracle (Usp), das Invertebra-
ten-Ortholog des Retinsäure-X-Rezeptors (RXR) und damit selbst Mitglied der Familie nuk-
leärer Rezeptoren (Abb. 2; Oro et al., 1990; Henrich et al., 1990). Im Gegensatz zu vielen
1 104 170 224 508
AA//BB CC DD EEUUsspp
VP16-AD C D EUsp I
VVPP1166--AADD CC DD EEUUsspp IIII
VP16-AD D EUsp III
Hexapeptid (aa 98-103)
Abb. 2: Schematische Darstellung von Drosophila melanogaster Ultraspiracle (Usp) und der Varian-
ten Usp I, Usp II und Usp III, bei denen die A/B-Domäne durch die Aktivierungsdomäne des viralen
Proteins 16 (VP16-AD) des Herpes simplex-Virus ersetzt ist. Usp I weist zusätzlich sechs Aminosäu-
ren (98 – 103) der Original-A/B-Domäne von Usp auf, bei Usp III ist die DNA-bindende Domäne dele-
tiert (Beatty et al., 2006).
6Einleitung
anderen Insekten kommt Usp in Drosophila melanogaster nur in einer Isoform vor und ist
weitgehend in allen Geweben exprimiert (Henrich et al., 1994). Wie RXR in Vertebraten ist
Usp Heterodimerisierungspartner mehrerer nukleärer Rezeptoren; am besten untersucht ist
die Rolle von Usp im Heterodimer mit EcR (Spindler et al., 2009a). Zur funktionellen Cha-
rakterisierung von Usp wurden einige Usp-Varianten hergestellt, bei denen die A/B-Domäne
durch die Aktivierungsdomäne des viralen Proteins 16 (VP16) des Herpes simplex-Virus er-
setzt ist (Abb. 2), was zu einer Erhöhung der Aktivität von Usp bei heterologer Expression in
Vertebratenzellen führt (Henrich, 2005; Beatty et al., 2006).
Ob Usp einen endogenen Liganden besitzt, ist bisher nicht vollständig geklärt. Jones und
Sharp (1997) beschreiben, dass Usp als Homodimer Juvenilhormon bindet, im Fall vom
Methylfarnesoat, einem Zwischenprodukt der Juvenilhormonsynthese, liegt die Affinität sogar
im nanomolaren Bereich (Jones et al., 2006).
Der funktionelle Ecdysteroid-Rezeptor
Das Heterodimer aus EcR und Usp gilt als funktioneller Rezeptor, der die Effekte von Ecdy-
steroiden als ligandenabhängiger Transkriptionsfaktor vermittelt (Riddiford et al., 2000; Hen-
rich, 2005). EcR ist zwar ohne Usp in der Lage, Hormon zu binden und mit der DNA zu inter-
agieren, Hormonbindung und DNA-Bindung sind in Gegenwart von Usp jedoch erheblich
verstärkt (Lezzi et al., 2002; Grebe et al., 2003; Azoitei und Spindler-Barth, 2009; Braun et
al., 2009). Dennoch ist EcR wohl auch ohne Usp biologisch aktiv, so ist beispielsweise eine
durch Ecdysteroide vermittelte Induktion der für die Metamorphose zentralen Gene des
„Broad Complex“ (BRC) ohne die Beteiligung von Usp in Drosophila beschrieben (Costantino
et al., 2008).
Die Dimerisierung von EcR und Usp erfolgt DNA-abhängig über die C-Domäne und ligan-
denabhängig über die E-Domäne. Teile der D-Domäne sind ebenfalls wichtig für die Dimeri-
sierung (Perera et al., 1999; Grebe et al., 2003).
DNA-Bindung
EcR und Usp interagieren mittels Zinkfinger-Strukturen, die von den C-Domänen gebildet
werden, mit spezifischen Sequenzen auf der DNA in der Promotorregion von Zielgenen
(„hormone response elements“, HREs) und regulieren die Transkription dieser nachge-
schalteten Gene durch Interaktion mit der Transkriptionsmaschinerie (Koelle et al., 1991;
Devarakonda et al., 2003). Zusätzlich zu den Zinkfinger-Strukturen sind auch C-terminal ge-
7Einleitung
legene Abschnitte im Übergangsbereich zur D-Domäne essentiell für die DNA-Bindung von
EcR (Jakób et al., 2007).
Die HREs nukleärer Rezeptoren weisen ein charakteristisches Kernmotiv auf, das sich in
zwei „half-sites“ gliedert (Khorasanizadeh und Rastinejad, 2001). In Drosophila melanogaster
vorkommende EcREs (ecdysone response elements) sind hauptsächlich asymmetrische,
palindromische Sequenzen (Spindler et al., 2001; Nakagawa und Henrich, 2009).
Wie mittels „in-vitro“-Experimenten gezeigt wurde, erhöhen sich DNA-Bindung und Ligan-
denbindung (s.u.) des EcR/Usp-Heterodimers wechselseitig, d.h. die DNA-Bindung ist in
Gegenwart von Hormon verstärkt und umgekehrt (Azoitei und Spindler-Barth, 2009; Braun et
al., 2009).
Ligandenbindung und Comodulatoren
Die ligandenbindende Domäne (LBD; E-Domäne, AF-2) nukleärer Rezeptoren besteht aus
elf bis zwölf -Helices und zwei antiparallelen -Faltblättern, die die ligandenbindende Ta-
sche formen (Abb. 3). Kristallisationsstudien mit den LBDs von EcR und Usp haben gezeigt,
dass dieser Aufbau auch für EcR und Usp gilt (Clayton et al., 2001; Billas et al., 2003; Billas
et al., 2009).
Abb. 3: Schematische Darstellung der ligandenbindenden Domäne von EcR. Die Helix 12 (H12) be-
findet sich in der agonistischen, geschlossenen Konformation, die durch Ausbildung einer Salzbrücke
zwischen den Aminosäuren K497 in Helix 4 und E648 in Helix 12 stabilisiert wird (verändert nach Vi-
vat et al., 1997).
8Einleitung
Die Bindung eines (agonistischen) Liganden an die LBD von EcR führt durch Umlagerung
der Helix 12 zu einer Steigerung der Aktivität des Rezeptors, hervorgerufen durch das Ab-
dissoziieren von gebundenen Corepressor-Proteinen und die Interaktion mit Coaktivator-
Proteinen (Billas et al., 2003). Die Coaktivator-Proteine, die meist über ein LXXLL-Motiv mit
nukleären Rezeptoren interagieren, werden durch eine Salzbrücke „festgehalten“, die sich
bei EcR von Drosophila zwischen den Aminosäuren Lys497 in Helix 4 und Glu648 in He-
lix 12 ausbildet (Abb. 3; Wurtz et al., 1996; Heery et al., 1997; Grebe et al., 2003). Für
EcR-B1 ist die Interaktion mit dem Drosophila-spezifischen Corepressor SMRTER (SMRT
related ecdysone receptor interacting factor) gezeigt, der dem Vertebraten-Corepressor
nukleärer Rezeptoren SMRT (silencing mediator of retinoid X receptor and thyroid receptor)
funktionell ähnlich, strukturell jedoch verschieden ist (Tsai et al., 1999). Eine Reihe weiterer
EcR-Corepressoren in Drosophila ist bekannt (Nakagawa und Henrich, 2009; Spindler et al.,
2009a). Die Aktivität von Corepressoren ist häufig mit Histondeacetylase-Aktivität assoziiert,
was durch dichteres Packen der DNA die Chromatinanordnung verändert und damit die
Transkription inhibiert (Pazin und Kadonaga, 1997). Demgegenüber entfalten Coaktivatoren
ihre Aktivität häufig über Histon-Modifizierung durch Acetyltransferase- und Methyltransfe-
rase-Aktivität, was entsprechend die Zugänglichkeit zur DNA durch weniger dichtes Packen
erhöht (Sedkov et al., 2003).
Auch die in der A/B-Domäne lokalisierte ligandenunabhängige AF-1 nukleärer Rezeptoren
interagiert mit Comodulator-Proteinen. Darüber ist jedoch bisher wenig bekannt, da die A/B-
Domäne in ihrer räumlichen Anordnung sehr flexibel und teilweise unstrukturiert ist, so dass
Vorhersagen schwierig sind. Die AF-1 nimmt eine funktionelle Konformation wohl erst in
Gegenwart zelltyp-spezifischer Faktoren wie Comodulatoren oder DNA ein, wobei über die
genauen Mechanismen nur Hypothesen existieren, da strukturelle Daten weitgehend fehlen
(Chandra et al., 2008; Kumar und Litwack, 2009).
Die Helix 12 der LBD von Drosophila Usp weist interessanterweise auch ohne gebundenen
Liganden (s.o.) eine Konformation auf, die normalerweise von Steroidhormon-Rezeptoren
bekannt ist, die einen antagonistischen Liganden gebunden haben. Die Fixierung der He-
lix 12 von Usp in dieser „antagonistischen“ Konformation ist nur von Dipteren und Lepidopte-
ren und nicht von anderen Insektengruppen bekannt und wird durch Wechselwirkungen von
Aminosäuren der Helix 12 mit einem außergewöhnlich großen Loop zwischen den Helices 1
und 3 (L1-3) vermittelt (Clayton et al., 2001; Sasorith et al., 2002; Billas et al., 2009).
9Einleitung
Intrazelluläre Lokalisation
Die Lokalisation innerhalb einer Zelle ist ein wichtiger Regulationsmechanismus für die Akti-
vität von Steroidhormon-Rezeptoren und Transkriptionsfaktoren allgemein. Der Transport
zellulärer Proteine zwischen Cytoplasma und Zellkern durch den Kernporenkomplex erfolgt
unter Energieverbrauch durch spezifische Transporter-Proteine (Importine, Exportine), die
mit bestimmten Erkennungssequenzen in der Primärstruktur der transportierten Proteine,
sogenannten NLS (nuclear localization signals) und NES (nuclear export signals), interagie-
ren (Kaffman und O'Shea, 1999). Für die EcR-Isoformen sind zwei aktive NES in der ligan-
denbindenden Domäne und ein NLS in der DNA-bindenden Domäne (DBD) beschrieben.
EcR-A und EcR-B1 weisen zusätzlich ein NLS in der isoformspezifischen A/B-Domäne auf.
Im Gegensatz dazu ist für Usp nur ein NLS in der DNA-bindenden Domäne und kein NES
bekannt (Gwó źd ź et al., 2007). Entsprechend dieser Befunde ist EcR abhängig vom Zelltyp
und der Isoform in unterschiedlichen Verhältnissen in Zellkern und Cytoplasma lokalisiert,
während Usp grundsätzlich nahezu ausschließlich im Zellkern zu finden ist. Werden EcR und
Usp gemeinsam exprimiert, ist auch EcR fast vollständig im Zellkern lokalisiert, da durch Di-
merisierung mit Usp die NES-Aktivität in der ligandenbindenden Domäne von EcR abge-
schirmt wird (Nieva et al., 2005; Gwó źd ź et al., 2007; Beta ńska et al., 2007; Spindler et al.,
2009b).
Ecdyson 20-OH-Ecdyson
Muristeron A Ponasteron A
Abb. 4: Strukturformeln der Ecdysteroide Ecdyson, 20-OH-Ecdyson, Muristeron A und Ponasteron A.
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