Regulation of CD4 T cell functions by the p38 mitogen-activated protein kinase and CD28 [Elektronische Ressource] = Regulation der CD4-T-Zellfunktion durch die p38-mitogen-activated-protein-kinase und CD28 / vorgelegt von Francis Dodeller

Regulation of CD4 T cell functions by the p38 mitogen-activated protein kinase and CD28 Regulation der CD4 T-Zellfunktion durch die p38 mitogen-activated protein kinase und CD28 Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades vorgelegt von Francis Dodeller aus Thionville Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 19.10.2005 Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. D.-P. Häder Erstberichterstatter: Prof. Dr. T. Winkler Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Dres. h.c. J. R. Kalden A mes parents Table of contents TABLE OF CONTENTS Table of contents ....................................................................................................................1 Abstract..................................................................................................................................4 Zusammenfassung (German summary)...................................................................................6 1 INTRODUCTION ........................................................................................................8 1.1 CD4 T cells and the immune response ..................................................................8 1.1.
Publié le : samedi 1 janvier 2005
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Regulation of CD4 T cell functions
by the p38 mitogen-activated protein kinase and CD28


Regulation der CD4 T-Zellfunktion durch die p38 mitogen-activated protein
kinase und CD28









Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades



vorgelegt von
Francis Dodeller
aus Thionville





Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Universität Erlangen-Nürnberg


















Tag der mündlichen Prüfung: 19.10.2005

Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. D.-P. Häder

Erstberichterstatter: Prof. Dr. T. Winkler

Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Dres. h.c. J. R. Kalden















A mes parents

Table of contents
TABLE OF CONTENTS
Table of contents ....................................................................................................................1
Abstract..................................................................................................................................4
Zusammenfassung (German summary)...................................................................................6
1 INTRODUCTION ........................................................................................................8
1.1 CD4 T cells and the immune response ..................................................................8
1.1.1 General properties of the immune response .........................................................8
1.1.2 Antigen presentation and T cell receptor..............................................................8
1.1.3 T cell activation...................................................................................................9
1.1.4 T helper cell subsets ..........................................................................................10
1.1.4.1 Th1 and Th2 cells functions...........................................................................10
1.1.4.2 Th1/Th2 cells and disease..............................................................................13
1.1.4.3 Regulation of Th1 and Th2 differentiation.....................................................13
1.1.4.4 Molecular aspects of Th1/Th2 cell differentiation..........................................15
1.1.5 T cell signaling..................................................................................................16
1.1.6 CD28 as an independent signaling unit..............................................................18
1.2 The p38 MAPK signaling cascade.......................................................................20
1.2.1 Enzymology of p38...........................................................................................21
1.2.2 Activation of p38 ..............................................................................................21
1.2.3 Inactivation of p38 ............................................................................................23
1.2.4 Substrates of p38...............................................................................................24
1.2.5 Stimuli activating p38 .......................................................................................25
1.2.6 p38 and cytokine expression..............................................................................26
1.2.6.1 IFN-γ and IL-2 ..............................................................................................26
1.2.6.2 IL-4, IL-5, and IL-13.....................................................................................27
1.2.7 p38 inhibitors in Th1-mediated diseases ............................................................28
1.3 Aims of the thesis .................................................................................................29
2 MATERIALS AND METHODS................................................................................30
2.1 Materials...............................................................................................................30
2.1.1 Reagents, enzymes, cytokines ...........................................................................30
2.1.2 Antibodies.........................................................................................................32
2.1.3 TaqMan gene expression assays ........................................................................33
2.1.4 Plasmids............................................................................................................34
2.2 Methods................................................................................................................34
2.2.1 Cell purification ................................................................................................34
2.2.2 Cell culture .......................................................................................................35
2.2.2.1 Cell stimulation.............................................................................................35
2.2.2.2 Actinomycin D chase experiments.................................................................35
2.2.2.3 T cell differentiation......................................................................................36
2.2.3 Immunofluorescence staining for flow cytometry..............................................36
2.2.4 RNA isolation ...................................................................................................37
2.2.5 RNase protection assay .....................................................................................37
1 Table of contents
2.2.5.1 Probe synthesis..............................................................................................37
2.2.5.2 RNA hybridization and RNase treatment.......................................................38
2.2.5.3 Gel resolution of protected RNA ...................................................................38
2.2.6 cDNA synthesis and quantitative RT-PCR (qRT-PCR)......................................39
2.2.7 Cell transfection................................................................................................39
2.2.8 Luciferase assay ................................................................................................40
2.2.9 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blotting ....41
2.2.10 Cytokine ELISA................................................................................................41
2.2.11 Mice immunization and Ig ELISA.....................................................................42
2.2.12 Microarrays.......................................................................................................43
2.2.12.1 cDNA and biotin-labeled cRNA synthesis .................................................43
2.2.12.2 Hybridization, washing, staining and scanning of the arrays ......................44
2.2.12.3 Data transformation and analysis ...............................................................44
3 RESULTS....................................................................................................................46
3.1 Function of p38 in CD4 T cells ............................................................................46
3.1.1 T cell effector functions ....................................................................................46
3.1.1.1 Resting T cells...............................................................................................46
3.1.1.2 Specificity of the inhibition ...........................................................................51
3.1.1.3 Effect of polarizing cytokines........................................................................53
3.1.1.4 Activated Th1 and Th2 cells..........................................................................54
3.1.2 Molecular mechanisms of p38 control of cytokine expression ...........................56
3.1.2.1 Promoter activation .......................................................................................56
3.1.2.2 mRNA stabilization.......................................................................................57
3.1.3 T cell differentiation..........................................................................................59
3.1.4 Inhibition of p38 in vivo ....................................................................................61
3.2 Antigen-independent T cell stimulation via CD28..............................................63
3.2.1 CD28-induced cytokine gene expression ...........................................................63
3.2.1.1 Nature of cytokines induced ..........................................................................63
3.2.1.2 Role of p38 in CD28-induced cytokine gene expression ................................65
3.2.2 Effect of CD28/IL-2 stimulation on the gene expression profile in memory CD4
T cells ..............................................................................................................68
3.2.2.1 Genes activated by CD28/IL-2 ......................................................................70
3.2.2.2 Genes downmodulated by CD28/IL-2 ...........................................................71
3.2.2.3 Role of the p38 MAPK in CD28/IL-2 modulated gene expression.................73
3.2.2.4 Validation of microarray data by qRT-PCR...................................................74
4 DISCUSSION..............................................................................................................79
4.1 Regulation of cytokine expression by p38...........................................................79
4.1.1 Th2 cytokines and IL-10 ...................................................................................79
4.1.2 Th1 cytokines and IL-2 .....................................................................................82
4.2 Role of p38 in the regulation of the immune response in vivo ............................83
4.3 Consequences of CD28 triggering on immune functions....................................84
4.3.1 Secreted molecules............................................................................................85
4.3.2 Receptors ..........................................................................................................87
2 Table of contents
4.4 Consequences of CD28 triggering on cell signaling molecules and on
transcription factors ............................................................................................88
4.4.1 Transcription.....................................................................................................89
4.4.2 Signal transduction............................................................................................90
4.5 Role of p38 in CD28/IL-2-induced gene expression............................................91
4.6 Concluding remarks ............................................................................................92

Appendix..............................................................................................................................93
Bibliography ......................................................................................................................101
Abbreviations.....................................................................................................................117
Acknowledgements ............................................................................................................120
Publications........................................................................................................................121
Curriculum vitae ................................................................................................................123


3 Abstract - Zusammenfassung
ABSTRACT

Type 1 and type 2 CD4 T cell subsets orchestrate adaptive immune responses via their
specific effector mechanisms. Because of their important role in the development of
pathologic immune responses, such as those driving autoimmune or atopic diseases, CD4 T
cell subsets and their specific effector functions constitute potentially important therapeutic
targets, and the delineation of the molecular mechanisms that regulate such effector functions
(e.g. cytokine production) and T cell differentiation is, therefore, of great importance.

Although the p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) has been implicated in cytokine
expression in different cell populations, its precise function in primary human CD4 T cells is
incompletely defined. The role of p38 in CD4 T cells was analyzed in detail in the first part of
this study by disruption of the p38 MAPK signaling cascade using a specific inhibitor or a
dominant-negative mutant. p38 mediated the expression of Th2 cytokines as well as of the
anti-inflammatory cytokine IL-10. In contrast, inhibition of p38 activity did not affect
expression of the Th1 cytokines induced by TCR-stimulation, but decreased IL-12-mediated
IFN-γ expression. Cytokine expression from established Th2 effector cells was also regulated
by p38, however, the role of p38 was less pronounced compared to primary CD4 T cells.
Experiments employing luciferase reporter vectors under the control of the human IL-4 and
IL-5 promoter revealed that p38 regulated Th2 cell cytokine expression at the transcriptional
level. As a result of the effect of p38 on IL-4 expression, p38 activity modulated
differentiation of naive precursor T cells by inducing a shift of the Th1/Th2 balance towards
the Th2 direction. In vivo, inhibition of p38 resulted in a similar shift of the Th1/Th2 balance
by promoting Th1-dependent effector functions as exemplified by an increase of IgG2a serum
levels. Together, these data indicate that the p38 MAPK signaling pathway plays a pivotal
role in Th2 cells.

CD28 stimulation in the absence of TCR engagement has been previously shown to signal via
the p38 MAPK signaling cascade and has been associated with the development of a Th2
response in vitro and in vivo. The molecular mechanisms regulating Th2 immunity and the
precise function of p38 in this regulation were therefore further dissected in the second part of
this thesis by analyzing the mechanisms by which CD28 stimulation activates a Th2 immune
response. Compared to CD3/CD28 stimulation, CD28 stimulation in the presence of non-
4 Abstract - Zusammenfassung
mitogenic levels of IL-2 moderately but specifically induced the expression of Th2 cytokines.
Analysis of gene expression profiles by microarray experiments revealed that in addition to
Th2 cytokines, CD28 stimulation induced the expression of many genes involved in the
regulation of the immune response such as cytokines, chemokines, and receptors, that may
participate in the development of a Th2 response in vivo. Within these genes, the p38 MAPK
signaling cascade was primarily involved in regulating cytokine gene expression.
Inhibition of translation by cycloheximide blocked Th2 cytokine gene expression induced by
CD28/IL-2 stimulation, indicating that this process requires a prior translational event,
probably the expression of transcription factors or signaling molecules that are indispensable
for Th2 cytokine expression. Analysis of the gene expression profiles induced by CD28/IL-2
stimulation permitted the identification of several of such molecules and indicated that these
molecules may be necessary to render the p38 MAPK signaling cascade functional with
regard to cytokine gene expression.

This study demonstrates that the p38 MAPK signaling cascade plays an essential and complex
role in the regulation of T cell effector functions and that this pathway may be a potential
therapeutic target for Th2-driven disorders but that p38 inhibitors should be employed in Th1-
driven diseases with some cautions.
5 Abstract - Zusammenfassung
ZUSAMMENFASSUNG

Auf Grund ihrer Effektorfunktionen sind T-Helfer (Th) 1 und Th2-Zellen die zentralen
Regulatoren einer spezifischen Immunreaktion. Angesichts der maßgeblichen Rolle von CD4-
T-Zellen in der Entstehung von pathologischen Immunantworten, wie zum Beispiel denen bei
autoimmunen und atopischen Erkrankungen, stellen CD4-T-Zellpopulationen und ihre
spezifischen Effektorfunktionen potentiell wichtige therapeutische Ziele dar. Die
Identifikation der molekularen Mechanismen, die solche Effektorfunktionen (zum Beispiel
Zytokinproduktion) und die T-Zell-Differenzierung steuern, ist daher von großer Bedeutung.

Obwohl die Beteiligung der p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) an der
Zytokinexpression unterschiedlicher Zelltypen beschrieben worden ist, ist ihre genaue
Funktion in primären menschlichen CD4-T-Zellen unvollständig bekannt. Im ersten Teil
dieser Studie wurde die Rolle von p38 in CD4-T-Zellen durch Blockade der p38 MAPK-
Signalkaskade mittels eines spezifischen Inhibitors oder einer dominant-negativen Mutante
untersucht. Die Expression von Th2-Zytokinen und des immunregulatorischen Zytokins IL-10
wurde von p38 reguliert. Im Gegensatz dazu beeinflusste die Inhibition der p38 MAPK die
durch T-Zell-Rezeptor (TZR)-Stimulation induzierte Expression von Th1-Zytokinen nicht,
während die durch IL-12-vermittelte IFN-γ-Expression verringert wurde. Die
Zytokinexpression von etablierten Th2-Effektorzellen wurde ebenfalls durch p38 reguliert,
wenngleich die Rolle von p38 hier von geringerer Bedeutung war, als in primären CD4 T-
Zellen. Mittels Luciferase-Reporter-Vektoren, die unter der Kontrolle des IL-4- oder des IL-5-
Promoters waren, konnte gezeigt werden, dass p38 die Th2-Zytokinexpression auf
transkriptioneller Ebene reguliert. Als Resultat der Wirkung von p38 auf der IL-4-Expression
veränderte die Inhibition der p38 MAPK die Th2-Zell-Differenzierung von naiven Vorläufer-
T-Zellen und führte zu einem Anstieg des Th1/Th2-Gleichgewichts. In vivo verursachte die
Inhibition der p38 MAPK eine ähnliche Veränderung der Th1/Th2-Balance durch eine
Steigerung der Th1-abhängigen Effektorfunktionen, wie zum Beispiel einem Anstieg der
IgG2a Serumspiegel. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die p38 Signalkaskade
von großer Bedeutung für die Funktion von Th2-Zellen ist.

Es ist gezeigt worden, dass in Abwesenheit von TZR-vermittelten Signalen die CD28-
Stimulation die p38 MAPK-Signalkaskade aktiviert. CD28-Stimulation ist mit der
6 Abstract - Zusammenfassung
Entwicklung von Th2-Immunantworten in vitro und in vivo assoziert worden. Im zweiten Teil
dieser Doktorarbeit wurden die molekularen Mechanismen, die die Th2-Immunität regulieren,
sowie die genaue Funktion von p38 in dieser Regulation, untersucht. Im Vergleich zur
CD3/CD28-Stimulation führte die CD28-Stimulation im Anwesenheit von einer nicht-
mitogenen Konzentration von IL-2 zu einer mäßigen aber spezifischen Expression von Th2-
Zytokinen. Die Analyse der Geneexpression mittels Microarray zeigte, dass zusätzlich zu
Th2-Zytokinen die Expression von mehreren Genen, die in der Regulation einer
Immunantwort von Bedeutung sind und in der Entwicklung einer Th2-Antwort in vivo
beteiligt sein könnten, wie zum Beispiel Zytokine, Chemokine, und Rezeptoren, durch CD28-
Stimulation induziert wird. Innerhalb dieser Gene war die p38 MAPK-Signalkaskade vor
allem in der Regulation der Zytokingenexpression von Bedeutung.
Inhibition der Translation durch Cyclohexamid blockierte die durch CD28/IL-2-Stimulation
induzierte Genexpression von Th2-Zytokinen. Dieses weißt darauf hin, dass für diesen
Prozess die Translation notwendig ist, wie zum Beispiel die Expression von
Transkriptionsfaktoren oder Signalmolekülen, die für die Th2-Zytokinexpression unersetzlich
sind. Die Analyse des CD28/IL-2-vermittelten Genexpressionsprofils ermöglichte die
Identifikation mehrerer solcher Moleküle und unterstrich, dass diese Moleküle notwendig sein
können, um die p38-Signalkaskade im Hinblick auf die Zytokingenexpression funktionsfähig
zu machen.

Diese Studie zeigt, dass die p38 MAPK-Signalkaskade eine essentielle und komplexe Rolle in
der Regulation von T-Zell-Effektorfunktionen spielt und dass diese Kaskade ein mögliches
therapeutisches Ziel für Th2-Zell-vermittelte Erkrankungen ist, dass aber p38-Inhibitoren in
Th1-Zell-vermittelten Erkrankungen mit Vorsicht verwendet werden sollten.

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