Régulations de la protéine proapoptotique Bax : rôle des kinases Akt et GSK-3β et de la protéine antiapoptotique Bcl-xL, Regulations of proapoptotic protein Bax : role of Akt and GSK-3β kinases and of antiapoptotic protein Bcl-xL

Thibaud Renault

Description

Sous la direction de Stephen Manon
Thèse soutenue le 16 décembre 2010: Bordeaux 2
La protéine proapoptotique Bax joue un rôle fondamental au cours de la voie intrinsèque de l’apoptose. Elle participe au déclenchement de la mort en permettant la libération de facteurs apoptogéniques mitochondriaux vers le cytosol. Un des points-clé de la fonction de Bax est son activation, caractérisée par la transition entre une forme cytosolique, globulaire et inactive de la protéine et une conformation mitochondriale, membranaire et active. Les différentes étapes de l’activation de Bax sont relativement bien connues, toutefois un grand nombre de questions reste en suspens quant-à leur régulation.Ce travail s’est focalisé sur la régulation de l’activation de Bax par les kinases Akt et GSK-3β ainsi que par la protéine antiapoptotique Bcl-xL . Ces régulations ont été caractérisées en exprimant la protéine Bax humaine chez la levure Saccharomyces cerevisiae, un paradigme d’étude simplifié qui permet d’accéder aux composantes individuelles des mécanismes d’activation de Bax.Les données obtenues suggèrent qu’il existe deux étapes régulées indépendamment au cours de l’activation de Bax. Nous avons montré que la protéine kinase GSK-3β favorise l’adressage de Bax vers la mitochondrie mais qu’elle n’entraîne pas un changement de conformation suffisant à son activation complète et à la perméabilisation de la membrane mitochondriale externe. Des changements de conformations complémentaires de Bax sont requis pour conduire à une forme capable d’entraîner la libération des facteurs apoptogéniques mitochondriaux. La protéine kinase Akt est impliquée dans le contrôle de Bax via la phosphorylation de la sérine 184 et participe à l’inhibition de l’apoptose. Nous avons mis en évidence qu’une mutation phosphomimétique de la sérine 184 ou l’expression d’Akt, en l’absence de partenaires antiapoptotiques, stimulent un changement de conformation de Bax vers une forme active. Akt semble donc plus jouer un rôle sur la conformation de Bax qu’entraîner une inhibition directe. La présence de protéines antiapoptotiques serait ainsi requise pour l’inhibition de Bax en présence d’Akt.D’autre part, nous nous sommmes intéressés aux mécanismes d’action de la protéine antiapoptotique Bcl-xL . Nous avons déterminé que Bcl-xL pouvait favoriser l’adressage de Bax vers la membrane mitochondriale tout en exerçant un rôle antiapoptotique. Ceci suggère que Bcl-xL intervienne dans le contrôle des étapes tardives de l’activation de Bax. Ce contrôle est dépendant d’une interaction stable entre les deux protéines. Inversement, un variant de Bcl-xL n’interagissant que de façon transitoire avec Bax (Bcl-xL ∆C) entraîne l’activation de Bax. Cette observation est en faveur d’un modèle d’activation indirecte de Bax consécutive à la rupture de l’interaction avec Bcl-xL et dans lequel les protéines à BH3-seulement telles que Bad joueraient un rôle crucial.
-Bax
-Apoptose
-Mitochondrie
-Akt
-GSK-3β
-Bcl-xL
Proapoptotic protein Bax plays a major role during apoptosis intrinsic pathway. Bax promotes cell death by inducing the release of apoptogenic factors from mitochondria to cytosol. Bax activation is a key step of its function which involves a change from a globular, cytosolic and inactive conformation to an active mitochondrial, membrane inserted conformation. Bax activation substeps are rather well known, however their regulation remains to be characterized.This work focuses on the study of the regulation of Bax activation by kinases Akt and GSK-3β and by antiapoptotic protein Bcl-xL . Human Bax regulations have been studied by expressing the protein in yeast Saccharomyces cerevisiae which represents a simplified paradigm for the understanding of the individual components of Bax activation mecha- nisms.Our data suggest that there are two independently regulated steps during Bax activation. We showed that GSK-3β expression led to Bax addressing to mitochondria but was not sufficent to promote a complete activation and mitochondrial outer membrane premeabilization. Further conformational changes are required to promote Bax full activation and the release of mitochondrial apoptotic factors. Protein kinase Akt is involved in Bax activation control through the phosphorylation of serine 184 and contributes to apoptosis inhibition. We observed that either a phosphomimetic mutation of serine 184 or coexpression of Akt, in the absence of antiapoptotic partners, were responsible of Bax conformational change into an active form. By itself Akt did not inhibit Bax but appeared more likely to control its conformational change. Thus, implication of antiapoptotic proteins seems to be critical in a model of Bax inhibition by Akt.Furthermore, we tried to understand the molecular mechanisms of antiapoptotic protein Bcl-xL inhibition on Bax. We determined that Bcl-xL could increase Bax mitochondrial localization while leading to its inhibition suggesting that Bcl-xL controled Bax late activation steps. Bax inhibition was dependent on a stable interaction with Bcl-xL . Conversely, a variant of Bcl-xL having a transitory interaction with Bax (Bcl-xL ∆C) was able to promote Bax activation. This supports a model of Bax indirect activation following the rupture of interaction with Bcl-xL in which BH3-only proteins like Bad would play an important role.
-Bax
-Apoptosis
-Mitochondria
-Akt
-GSK-3β
-Bcl-xL
Source: http://www.theses.fr/2010BOR21794/document

Sujets

• BAX
• Apoptose
• Mitochondrie

Informations

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Extrait

UNIVERSITÉ BORDEAUX II - VICTOR SÉGALEN
Année 2010 Thèse n° 1794
THÈSE
pour le
DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ BORDEAUX II
mention : Sciences, technologie, santé
option : Biochimie
présentée et soutenue publiquement le
16 décembre 2010
par
Thibaud RENAULT
né le 30 décembre 1985 à Thouars
Régulations de la protéine proapoptotique Bax
rôle des kinases Akt et GSK-3b
et de la protéine antiapoptotique Bcl-xL
Membres du jury :
M. Érick DUFOURC, directeur de recherches, CNRS Bordeaux Président
M. Philippe JUIN, de INSERM Nantes Rapporteur
M. Jérôme ESTAQUIER, directeur de recherches, INSERM Créteil
Mme. Francesca DE GIORGI, chargée de INSERM Bordeaux Éxaminatrice
M. Abdel AOUACHERIA, chargé de recherches, CNRS Lyon Éxaminateur
M. Stéphen MANON, chargé de CNRS Bordeaux Directeur de ThèseÀ mon frère, Simon.
À ma famille et mes amis.
Une civilisation sans la Science, ce
serait aussi absurde qu’un poisson
sans bicyclette.
Pierre Desproges (1939–1988)
Vivons heureux en attendant la mortATTENTION ! Cette thèse contient 2,2 zeptomoles de Bax.Remerciements
Ce travail de thèse a été réalisé à l’Institut de Biochimie et Génétique Cellulaires à Bordeaux au sein
rde l’équipe Mitochondries, Stress et Morts Cellulaires sous la direction du D Stéphen Manon.
r rEn premier lieu, je tiens à remercier les membres du jury, le D Érick Dufourc, le D Philippe Juin,
r r rle D Jérôme Estaquier, le D Francesca De Giorgi et le D Abdel Aouacheria d’avoir pris part à l’évalua-
tion de ce travail. Je garderai un très bon souvenir de la discussion passionnante qui a eu lieu lors de la
soutenance.
Ces quelques années passées à l’IBGC auront été particulièrement agréables et enrichissantes notam-
ment grâce aux personnes admirables que j’ai eu la chance de côtoyer.
À mon directeur de thèse, Stéphen, un très grand merci ! Merci tout d’abord de m’avoir fait confiance
et laissé une liberté très appréciable dans la réalisation de mon travail. Merci de m’avoir fait partager une
passion pour la recherche, d’avoir été très présent pour me conseiller. Capitaine d’un équipage d’Ama-
zones au caractère fort, le spectro dans l’œil et le chronomètre au bout des lèvres.
Nadine, merci d’avoir été présente pour me conseiller et répondre à mes questions les innombrables
fois où j’avais perdu Stéphen ! Bon courage sur la route
Gisèle, ¡ muchas gracias ! pour ta gentillesse et ton soutien sans failles, en particulier au cours de ces
longues heures que nous avons passées en chambre froide à préparer des mitochondries. Merci pour le
thé salvateur du matin qui m’aura aidé à tenir le coup ! Je te souhaite un repos bien mérité et de profiter
de ta famille !
Muriel, merci pour tes précieux conseils, pour les nombreuses discussions, scientifiques ou non, que
nous avons eues. Je te suis également très reconnaissant de m’avoir initié au monde de la culture cellu-
laire.
Florian, je suis très heureux d’avoir fait ta connaissance et d’avoir partagé de très bon moments. J’es-
père que tu ne vas pas te sentir trop seul désormais parmi toutes ces filles. Je te souhaite toute la réussite
que tu ne manqueras pas d’avoir pour la fin de ta thèse !
iREMERCIEMENTS
Je tiens à exprimer toute mon amitié aux personnes que j’ai rencontrées au cours de la vie de l’équipe ;
èmeMaïka, Noëlle, Cécile, Xavier, Ingrid, Rui, Dario, Sara, ainsi qu’aux membres des équipes des 4 et
ème5 étages que j’ai côtoyés tout au long de ma thèse. En particulier, Patrick , Johann et Marion (bon
courage à vous deux pour la dernière année).
AJe remercie Emmanuel pour son aide et ses conseils sur LT X lors de la rédaction de cette thèse etE
Julien pour son aide à la réalisation des images des structures tridimensionnelles de Bax.
.736920766f757320706f7576657a206c69726520c3a7612c20766f757320c3aa74657320756e206765656be280af21
iiSommaire
I Introduction 3
1 Morts cellulaires 5
2 Mécanismes moléculaires des morts cellulaires 15
3 La mitochondrie, organite central de la voie intrinsèque de l’apoptose 33
4 La protéine proapoptotique Bax 59
Objet de l’étude et stratégie mise en œuvre 75
II Résultats 77
1 Caractérisation du rôle des kinases Akt et GSK-3b sur le processus d’activation de Bax 79
2 Rôle de la protéine antiapoptotique Bcl-x sur les changements de conformation de Bax 111L
3 Mise en œuvre d’une méthode de criblage 133
III Discussion et perspectives 139
Discussion 141
Perspectives 144
IV Matériels et Méthodes 151
1 Biologie moléculaire 153
2 Biologie Cellulaire 161
3 Biochimie 165
4 Bioinformatique 171
1SOMMAIRE
Table des matières 174
Table des figures 180
Nomenclature 185
Index 187
Bibliographie 189
2Première partie
Introduction