Rôle de ERK dans l'activation des osmorécepteurs hypothalamiques

Julien Dine

Description

Sous la direction de Daniel Voisin
Thèse soutenue le 27 novembre 2009: Bordeaux 2
La vasopressine (VP), hormone anti-diurétique, joue un rôle fondamental dans l’homéostasie des compartiments liquidiens de l’organisme. Ainsi, la concentration de VP libérée dans la circulation sanguine est proportionnelle à l’osmolalité plasmatique. Or, la libération de la VP est étroitement dépendante de l’activité électrique des neurones magnocellulaires hypothalamiques (MNCs) qui la synthétisent. L’activité électrique des MNCs est donc régulée lors de variations de l’osmolalité plasmatique. Cette régulation implique la modulation concertée de propriétés intrinsèques dépendant de l’expression de canaux ioniques mécanosensibles, mais aussi d’entrées synaptiques excitatrices provenant de structures cérébrales osmosensibles. Les Extracellular signal-regulated kinases (ERK 1 et 2) sont des protéines de la voie des MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinases) qui convertissent des stimulus extracellulaires en réponses intracellulaires transcriptionnelles et post-traductionnelles. Elles contribuent en particulier à la plasticité des propriétés membranaires intrinsèques et des synapses excitatrices glutamatergiques dans le système nerveux central. Elles sont exprimées par les MNCs de l’hypothalamus. L’objet de ce travail de thèse a été l’étude du rôle de ERK dans l’activation des osmorécepteurs hypothalamiques. Les expériences d’immunohistochimie montrent qu’en réponse à une stimulation systémique hypertonique, la voie ERK 1/2 est activée rapidement, de façon transitoire et sélectivement dans des structures osmoréceptrices de l’encéphale ou directement impliquées dans l’osmorégulation : noyaux supraoptiques (NSO) et paraventriculaires (NPV), organe subfornical, noyau préoptique médian et OVLT. ERK est aussi activée dans la portion parvicellulaire du NPV, mais pas dans une structure témoin qui ne participe pas à l’osmorégulation, la strie médullaire thalamique. De plus, il existe un codage de l’intensité de la stimulation osmotique par le nombre de neurones exprimant phosphoERK dans l’encéphale. Les Western Blot indiquent qu’il existe également un codage de l’intensité du stimulus hypertonique par le degré d’expression de la protéine phosphoERK dans le NSO. Nous montrons aussi qu’il existe une activation plus importante de ERK dans les neurones à VP que dans les neurones à ocytocine. L’ensemble de ces résultats suggère que phosphoERK pourrait contribuer aux mécanismes de l’osmorégulation. Cette hypothèse a été testée en mesurant les effets de l’inhibition de la phosphorylation de ERK sur l’activation des centres osmorégulateurs. Effectivement, l’administration intracérébroventriculaire d’un inhibiteur sélectif de MEK 1/2, l’U 0126, inhibe la phosphorylation de ERK et l’activation neuronale (mesurée par l’expression de Fos) résultant de l’application d’un stimulus hypertonique. La phosphorylation de ERK joue donc un rôle majeur dans l’activation des centres osmorégulateurs de l’encéphale. En accord avec ces données, les enregistrements électrophysiologiques sur tranches d’hypothalamus montrent que ERK est impliqué dans la réponse cellulaire des neurones magnocellulaires à une stimulation osmotique : l’inhibition de la phosphorylation de ERK réduit la dépolarisation membranaire et diminue l’augmentation de la fréquence de décharge des potentiels d’action ainsi que l’augmentation de l’amplitude des potentiels synaptiques spontanés induits par un stimulus hypertonique. Les données obtenues sur les neurones supraoptiques isolés montrent qu’une partie au moins des effets de l’activation de ERK implique une modulation de la conductance membranaire qu’on sait responsable de l’osmotransduction dans ces neurones. En résumé, l’activation de ERK est nécessaire à la réponse normale des neurones magnocellulaires à une stimulation osmotique.
-Erk
-Vasopressine
-Osmotransduction
-Osmorécepteurs
-Hypothalamus
The release of the anti-diuretic hormone vasopressin into the general circulation varies as a function of plasma osmolality and therefore plays a major role in systemic osmoregulation. It is primarily determined by the firing rate of the hypothalamic magnocellular neurons (MNCs). The regulation of MNC firing rate during changes in systemic osmolality involves the concerted modulation of intrinsic mechanosensitive ion channels in these neurons, as well as excitatory glutamatergic inputs derived from osmosensitive forebrain regions. Extracellular signal-Regulated protein Kinases (ERK) are mitogen-activated protein kinases that transduce extracellular stimuli into intracellular post-translational and transcriptional responses, which include changes in intrinsic neuronal properties and synaptic function. In the present work, we investigated whether ERK activation (i.e. phosphorylation) plays a role in the functioning of osmoregulatory networks. First, we found that within 10 minutes of intraperitoneal injections of hypertonic saline (3M, 6M), many phosphoERK-immunopositive neurons were observed within osmosensitive forebrain regions including suparoptic and paraventricular nuclei, subfornical organ, median preoptic nucleus and Organum vasculosum lamina terminalis (OVLT), but not in a control region such as the thalamic stria medullaris. This staining was intensity dependent and was reduced 30 minutes after the stimulus. In the supraoptic nucleus, it predominated in vasopressin neurons compared to oxytocin neurons. Western blotting experiments confirmed that ERK phosphorylation in the supraoptic nucleus was intensity dependent. Inhibition of ERK phosphorylation by a MEK inhibitor reduced both the numbers of phosphoERK-immunopositive neurons and Fos expressing neurons, a measure of neuronal activation after hypertonic stimuli. Inhibition of ERK phosphorylation also decreased the membrane depolarization, the increase in firing frequency and the increase in excitatory and inhibitory synaptic potential amplitude that were osmotically-induced in both oxytocin and vasopressin supraoptic neurons recorded from adult acute hypothalamic slices. It also reduced the increase in mechanically-gated membrane cation conductance evoked by hypertonic stimuli in isolated MNC neurons. Altogether, these findings strongly suggest that ERK phosphorylation is a key step in the transduction and integration of osmotic stimuli into activity changes in osmosensitive hypothalamic neurons.
Source: http://www.theses.fr/2009BOR21657/document

Sujets

• ERK
• Vasopressine
• Hypothalamus

Informations

• Publié par: Thesee
• Nombre de lectures: 658
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 116 Mo

Extrait

Université Victor Segalen Bordeaux 2


Année 2009 Thèse n°


THESE
pour le
DOCTORAT DE L’UNIVERSITE BORDEAUX 2


Mention : Sciences Biologiques et Médicales
Option : Neurosciences et Pharmacologie



Présentée et soutenue publiquement
Le 27 Novembre 2009
Par Julien DINE
Né le 10 Novembre 1983 à Lyon (69)



Rôle de ERK dans l’activation des osmorécepteurs hypothalamiques


Directeur de thèse : Dr Daniel VOISIN






JURY


Dr Abdelhamid BENAZZOUZ Président
Dr Charles W. BOURQUE Rapporteur
Dr Vincent PREVOT Rapporteur
Dr Marc LANDRY Examinateur
Dr Yves TILLET Examinateur
Dr Daniel VOISIN Directeur de thèse

1







« L’homéostasie est l’équilibre dynamique
qui nous maintient en vie »

Claude Bernard








2









A mes parents et à ma famille,
























3
































Remerciements









4
Remerciements

Ça y est une dernière page se tourne et la thèse se termine ! Ceci mérite bien
quelques mots ! La thèse, travail personnel par définition, doit son accomplissement à
un travail d’équipe. J’aimerais donc remercier ici toutes les personnes avec qui j’ai
collaboré et qui m’ont soutenu depuis le début de ma courte carrière scientifique,
tant au laboratoire qu’à l’extérieur.

Je voudrais tout d’abord remercier très sincèrement les membres de mon jury
de thèse : Monsieur le Dr. Abdelhamid Benazzouz pour avoir accepté de présider ce
jury et pour avoir été un tuteur de thèse formidable, Messieurs les Dr. Charles
Bourque et Vincent Prévot pour avoir accepté d’être rapporteurs et Messieurs les
Dr. Marc Landry et Yves Tillet pour avoir accepté d’évaluer mon travail de thèse.
Qu’ils trouvent ici le témoignage de ma profonde reconnaissance et de ma gratitude
d’avoir consacré de leur temps à juger ce travail.

Je tenais aussi à exprimer toute ma reconnaissance à mon directeur de thèse,
le Dr. Daniel Voisin pour m’avoir fait confiance et m’avoir accompagné avec
enthousiasme et rigueur durant ces trois années. Je le remercie de m’avoir accueilli
dans son équipe et de m’avoir formé à la recherche scientifique. Daniel, je vous
remercie très sincèrement de m’avoir confié ce projet de thèse passionnant et de
l’avoir réorienté lorsqu’il a fallu le faire, d’avoir partagé votre savoir (qui est
immense !!! comment faites-vous ?). Vous avez su aussi me faire partager votre
passion et votre savoir-faire pour l’enseignement et ce fut pour moi une expérience
très enrichissante tant d’un point de vue personnel que professionnel. Enfin, je tenais
sincèrement à vous remercier pour votre aide formidable lors de l’écriture de ce
manuscript ; vous y avez apporté toute votre rigueur scientifique quand je
m’éparpillais un peu partout… J’espère que ces trois années furent aussi plaisantes
pour vous qu’elles le furent pour moi.

Je tenais à exprimer mes sincères remerciements au Dr. Stéphane Oliet,
directeur de l’équipe « Physiologie intégrée des systèmes neuroendocrines », qui m’a
accueilli au sein de son laboratoire, permis d’effectuer ce travail dans les meilleures
conditions possibles jusqu’à la fin et fais profité de son savoir scientifique.

Je voudrais aussi remercier le Dr. Jean-Marc Israel pour tout ce qu’il a fait
pour moi durant ces trois années. Jean-Marc vous avez été pour moi un mentor, une
sorte de papa dans ce laboratoire et aussi une oreille attentive lorsque j’en ai eu
besoin. Vous m’avez initié et formé à l’enregistrement intracellulaire en sharp, vous
avez partagé avec moi tous vos secrets et vos petites ruses de sioux pour empaler les
MNCs que ce soit sur les tranches organotypiques ou in vivo. Je regrette que nous
n’ayions pas pu travailler plus longtemps ensemble sur les enregistrements in vivo
pour enfin arriver à empaler ces s…aletés de neurones et voir ce qu’ils avaient dans
le ventre…La question reste en suspens. Pour finir, je voudrais vous souhaiter le
meilleur pour la nouvelle vie qui s’offre à vous : profitez bien de votre retraite, vous
l’avez bien mérité. J’espère avoir de vos nouvelles très souvent.

Je tenais aussi à remercier le Dr. Marie-Christine Lombard pour son aide
inestimable de chaque instant, ses conseils et son écoute. Marie, tu es un peu le
McGyver de ce laboratoire ; pour toi il n’y a pas de problèmes, il n’y a que des
5
solutions et un peu de bricolage règle tout çà. J’espère avoir très vite l’occasion de te
revoir et de goûter à nouveau ta super tarte au citron meringuée et ton gâteau au
chocolat.

J’adresse aussi mes sincères remerciements au Dr. Jean-Pierre Mothet qui a
toujours été là pour m’écouter, me conseiller et répondre à mes questions sur le vaste
sujet qu’est la biochimie. Jean-Pierre, nos discussions, qu’elles soient scientifiques ou
non, ont toujours été une grande joie pour moi. Cependant, permet moi de te le dire,
il serait grand temps que tu t’achètes un bon bouquin de blagues en tout genre. En
tout cas, je te souhaite beaucoup de réussite et de bonheur pour la suite de ta
carrière. A très bientôt j’espère.

Je voudrais aussi remercier Frau Magalie Martineau (nouvelement
expatriée au nord de l’Allemagne dans le froid et la neige), qui de collègue de travail
et devenue une amie. Merci pour tous ces bons moments et ces passionnantes
discussions dans la cage aux fauves du labo ou en dehors, le soir après une dure
journée de manip. Je te souhaite plein de réussite pour la suite de ta carrière et plein
de bonheur dans ta vie personnelle. Normalement si tout ce passe bien, nous devrions
nous recroiser en Allemagne.

Je voudrais remercier chaleureusement le Dr. Valérie Fénelon et Thomas
Papouin pour le temps qu’ils ont consacré à la lecture de ce manuscript. Vos
corrections et vos conseils ont été d’une grande aide pour moi. J’espère que cette
lecture ne fut pas trop indigeste pour vous.

Je souhaiterais adresser mes remerciements les plus sincères à Pascal Fossat et
à Vincent Ducourneau pour leur participation et leur investissement car sans eux ce
travail n’aurait pas été le même. Pascal, je te souhaite plein de bonheur avec ta
petite famille et dans ton travail d’enseignant-chercheur. Vincent, tu commences ta
thèse et je te souhaite toute la réussite possible. Valérie, merci de m’avoir transmis la
technique d’immunoidentification des neurones enregistrés en patch-clamp, que tu as
si patiemment mis au point durant ces longs mois.

J’aimerais enfin remercier tous les membres de l’’équipe « Physiologie intégrée
des systèmes neuroendocrines ». Philippe et Dyonisia, pour leurs précieux conseils
sur l’anatomie et l’immunohistochimie, j’ai beaucoup appris grâce à vous. Philippe, je
te remercie aussi pour tes histoires, parfois très salaces, lors de mémorables séances
de montage de coupes sériées. Dominique pour vos précieux conseils sur le SHN et
votre gentillesse. Federico, pour sa disponibilité, sa gentillesse et son aide pendant
ma recherche de post-doc : Forza AS Roma !!! Fabrice, Jérôme, Aurélie, Sabira,
Nathalie et Peggy pour leur bonne humeur quotidienne.

Je voudrais aussi remercier La Société des Neurosciences avec qui j’ai partagé
des supers moments pendant ces trois années. Francis, Clémence, Isabelle et Diane,
merci pour votre gentillesse de chaque instant et votre bonne humeur.

Je voudrais aussi adresser de sincères remerciements aux membres de la
PICIN pour leur aide et leurs précieux conseils concernant le travail de microscopie.
Grâce à eux, j’ai beaucoup appris sur le fonctionnement et l’utilisation des
microscopes. Merci beaucoup Christel et Philippe d’avoir donné de votre temps pour
6
améliorer la qualité de mes images et essay