Rôle du facteur de transcription HIF-1α dans la physiologie cutanée et dans la réponse à l'exposition UV, Role of the transcription factor HIF-1α in skin physiology and response to UV exposure

De
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Sous la direction de Hubert De Verneuil
Thèse soutenue le 04 octobre 2010: INPL
Le facteur de transcription HIF-1 est un hétérodimère composé d’une sous-unité α et d’une sous-unité ß. HIF-1 est capable de reconnaître une séquence consensus appelée HRE (HIF Response Element) et de réguler l’expression de plus de 200 gènes cibles impliqués dans divers mécanismes cellulaires. Nous nous intéressons à étudier le rôle de HIF-1α dans la peau, d’une part dans la régulation des enzymes de la réparation de l’ADN suite à l’irradiation UVB, d’autre part dans la physiologie cutanée.Nos résultats montrent bien que HIF-1α régule l’expression des gènes participant à la réparation de l’ADN (XPC et XPD). Ces gènes contiennent dans leurs régions promotrices des HRE de HIF-1α. La quantification de l’immunoprécipitation de chromatine révèle des HRE putatifs dans les gènes codant pour d'autres protéines de la réparation de l'ADN (XPB, XPG, CSA et CSB), ce qui suggère que HIF-1α est un régulateur clé de la machinerie de réparation de l'ADN. Nous avons prouvé que HIF-1α est indispensable à l’adhésion des kératinocytes par sa régulation exercée sur la laminine-332 et les intégrines (α6 et ß1). L’absence de l’expression de HIF-1α empêche aussi la reconstruction des épidermes à partir des kératinocytes humains. Nos résultats ont montré que les souris invalidées pour HIF-1α développent avec l’âge un phénotype d’inflammation dans plusieurs régions. Ces souris sont très sensibles au moindre stress consécutif à une blessure et une irradiation UVB. L’induction de l’inhibition de HIF-1α dans des souris inductibles avec le tamoxifène indique un détachement de l’épiderme au niveau des couches supra-basales. Ces souris meurent deux semaines après injection du tamoxifène
-HIF-1α
-Réparation de l'AND
-Laminime-332
-Kératinocytes
-Épiderme reconstruit
The transcription factor HIF-1 is a heterodimer composed of an α and ß subunit. HIF-1 is capable of recognizing a consensus sequence called HRE (hypoxia Response Element) and regulate the expression of more than 200 target genes involved in various cellular mechanisms. We are interested in studying the role of HIF-1α in the skin physiology.Our results show that HIF-1α regulates the expression of two main factors (XPC and XPD) involved in nucleotide excision repair through binding on HRE in their promoter regions. Quantitative chromatin immunoprecipitation assays further revealed putative HREs in the genes encoding other DNA repair proteins (XPB, XPG, CSA and CSB), suggesting that HIF-1α is a key regulator of the DNA repair machinery. We proved that HIF-1α is essential for keratinocyte adhesion through its regulation exerted on laminin-332 and integrins (α6, ß1). The lack of HIF-1α expression also prevents the reconstruction of epidermis by human keratinocytes. Our results showed that mice constitutively depleted for HIF-1α in their epidermis develop with age a phenotype of inflammation in several regions. These mice are very sensitive to the stress resulting from wound injury and UVB irradiation. HIF-1α depletion in the epidermis of inducible mice using tamoxifen results in a detachment of the epidermis in suprabasal layers. These mice die within two weeks after injection of tamoxifen
-HIF-1α
-DNA repair
-Laminin-332
-Integrins
-Keratinocytes
-Reconstructed epidermis
Source: http://www.theses.fr/2010INPL041N/document
Publié le : lundi 19 mars 2012
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INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE LORRAINE

ÉCOLE DOCTORALE : RP2E

Laboratoire Mixte INSERM/Université de Bordeaux U876


THÈSE

Présentée et soutenue publiquement le 04/10/2010 pour l’obtention du
grade de Docteur de l’INPL



Par
Nsrein ALI


Rôle du facteur de transcription HIF-1α dans la
physiologie cutanée et dans la réponse à
l’exposition UV





Directeur de thèse : Hubert DE VERNEUIL Pr (Université Bordeaux)

Composition du jury :

Président du jury : Alain TAIEB

Rapporteurs : Guerrino MENEGUZZI Dr (Université de Nice)

Marie-Dominique GALIBERT Pr (Université de Rennes)

Examinateurs : Jean Claude LECRON Pr (Université de Poitiers)

Michel FICK Pr (Nancy-Université-INPL)

Hubert DE VERNEUIL Pr (Université Bordeaux)
1Remerciements

Je tiens tout d’abord à remercier le Ministère des Etudes Supérieures de la Syrie qui m’a
accordé le soutien financier sans lequel je n'aurais pu réaliser ce travail.

Je voudrais remercier le Professeur Hubert de Verneuil pour m’avoir accueillie au sein de son
équipe, INSERM U876, et ainsi permis d effectuer ce travail dans les meilleures
conditions.

Je tiens à remercier,
Le Pr. Alain Taïeb de m’avoir fait l’honneur de présider ce jury, pour son soutien et aussi
pour ses idées qui ont enrichi ce travail

Le Dr. Guerrino Meneguzzi et le Pr Marie-Dominique Galibert d’avoir accepté d’être
rapporteurs de cette thèse.

Le Pr. Jean Claude LECRON et le Pr Michel FICK d’avoir accepté d’être membres de ce
jury.

Mes plus sincères remerciements vont également à Hamid Rezvani qui m’a suivie
quotidiennement pendant trois ans avec ses conseils et son soutien.

Je voudrais également exprimer mes remerciements à Frédéric Mazurier qui a activement
participé à ce travail.

Enfin, mes chaleureux remerciements s’adressent à Catherine Pain qui m’a beaucoup aidée
dans l’apprentissage des techniques. Je voudrais aussi remercier tous les membres du
laboratoire pour leur soutien durant ces années.


2Remerciements

A celle et à celui qui m’ont donné la vie et fait de nombreux sacrifices pour subvenir aux
besoins de leurs enfants
A ma mère et mon père
A celles et ceux qui m’ont donné la force et apporté beaucoup de joies
A mes sœurs et mes frères
A toute ma famille,
A ma deuxième famille qui m’a accueillie les bras ouverts et qui m’a soutenue pendant trois
ans

A la personne qui a accompli tous les devoirs d’un véritable frère, à toi Hamid et ta
magnifique épouse Maryame

A toi Fater, je dédie cette thèse car grâce à toi j’ai pu apprécier cette jolie ville dans
mes rares moments de libre

Je remercie toutes les personnes rencontrées au cours de ces dernières années, qui, sans
avoir participé directement à ce travail, ont ensoleillé les longues journées au labo !

Je ne sais comment exprimer tous mes remerciements vers l’homme qui a su par toutes
ses attentions, sa tendresse, et sa patience m’apporter la force de finaliser mon projet et
donner un sens profond à ma vie A Emmanuel
3

PREMIERE PARTIE : Exposé bibliographique

Chapitre I : La Peau

1. Epiderme ...................................................................................... 10
1.1. Kératinocytes ....................................................................................... 11
1.2. Mélanocytes.......................................................................................... 11
1.3. Cellules Langerhans............................................................................ 12
1.4. Cellules de Merkel............................................................................... 12
2. Derme ........................................................................................... 12
3. Hypoderme................................................................................... 13
4. Membrane basale......................................................................... 14
4.1. Généralité 14
4.2. Formation de la membrane basale .................................................. 15
4.3. Membrane basale épidermique........................................................ 17
4.3.1. Structure ..................................................................................... 17
4.3.1.1. Hémidesmosomes ............................................................. 17
4.3.1.1.1. Structure et fonction................................................. 17
4.3.1.1.2. Nidogènes ................................................................ 18
4.3.1.1.2.1. Nidogène-1 ..................................................................... 18
4.3.1.1.2.2. Nidogène-2 19
4.3.1.1.2.3. Fonctions ........................................................................ 19
4.3.1.1.3. Perlécane.................................................................. 19
4.3.1.2. Lamina lucida 20
4.3.1.3. Lamina densa 20
4.3.1.4. Zone fibrillaire ................................................................ 21
4.3.2. Composition ............................................................................... 21
4.3.2.1. Collagènes....................................................................... 21
4.3.2.1.1. Structure................................................................... 21
4.3.2.1.2. Biosynthèse du collagène ........................................ 22
4.3.2.1.3. Collagènes fibrillaires.............................................. 23
4.3.2.1.4. Collagènes non fibrillaires....................................... 23
4.3.2.1.4.1. Collagène IV 23
4.3.2.1.4.2. Collagène XVII ............................................................... 27
4.3.2.1.4.3. Collagène VII.................................................................. 28
4.3.2.2. Laminines........................................................................ 30
44.3.2.2.1. Isoformes et distribution .......................................... 30
4.3.2.2.2. Ligands et fonctions................................................. 34
4.3.2.2.3. Laminines dans les modèles de souris..................... 36
4.3.2.2.4. Laminines dans l’épiderme...................................... 38
4.3.2.2.5. Laminines dans les tumeurs..................................... 41
4.3.2.3. Intégrines......................................................................... 42
4.3.2.3.1. Structure et fonctions............................................... 42
4.3.2.3.2. Intégrines dans l’épiderme....................................... 46
4.3.2.3.3. Intégrines dans les kératinocytes ............................. 47
4.3.2.3.3.1. Expression dans les kératinocytes.................................. 47
4.3.2.3.3.2. Rôle dans l’adhésion et la migration.............................. 49
4.3.2.3.3.3. Rôle dans la différenciation et l’apoptose...................... 51
4.3.2.3.3.4. Rôle dans l’hyperprolifération et l’inflammation........... 52
4.3.2.3.4. Intégrines dans le cancer épithélial.......................... 53
4.3.2.3.5. Intégrines dans l’angiogenèse.................................. 55
4.4. Epidermolyse bulleuse ..................................................................... 58
4.4.1. Type simple................................................................................ 58
4.4.2. Type jonctionnelle...................................................................... 59
4.4.3. Type dystrophique 59
5. Métalloprotéinases....................................................................... 60
5.1. Structure et fonctions........................................................................ 60
5.2. Classification...................................................................................... 61
5.2.1. Collagénases............................................................................... 61
5.2.2. Gélatinases ................................................................................. 62
5.2.3. Stromélysines ............................................................................. 64
5.2.4. Matrilysines................................................................................ 65
5.2.5. Métalloprotéinases de type transmembranaire .......................... 65
5.3. Inhibiteurs de métalloprotéinases............................................ 67
6. Cicatrisation 68
6.1. Hémostase .......................................................................................... 69
6.2. Inflammation ..................................................................................... 69
6.3. Prolifération....................................................................................... 69
6.3.1. Granulation................................................................................. 69
6.3.2. Contraction 70
6.3.3. Réépithélialisation...................................................................... 70
6.3.3.1. Rôle des intégrines et protéines de la MEC.................... 71
6.3.3.2. Rôle des métalloprotéinases............................................ 72
6.3.3.3. Rôle des facteurs de croissance ...................................... 74
7. Rayonnement solaire................................................................... 77
7.1. Introduction ....................................................................................... 77
7.2. Effets des UV sur la peau ................................................................. 78
7.3. Principaux acteurs de la réponse aux UV....................................... 80
7.3.1. Dommage de l’ADN induits par les UV.................................... 80
57.4. Espèces réactives de l’oxygène et réponse aux UV ........................ 82
7.4.1. Introduction................................................................................ 82
7.4.2. Production physiologique des radicaux libres dans l’organisme et
en réponse aux UV..................................................................... 84
7.4.3. Rôle des ROS dans la réponse cellulaire aux UV...................... 85
7.4.3.1. Effets oxydatifs des ROS................................................ 85
7.4.3.2. ROS comme second messager........................................ 85
7.5. Facteurs de croissance et leurs récepteurs dans la réponse
cellulaire aux UV.............................................................................. 86
7.6. Système immunitaire et UV ............................................................. 86
7.7. Réparation de l’ADN ........................................................................ 88
7.7.1. Systèmes de réparation de l’ADN.............................................. 88
7.7.1.1. Réparation par excision de base (BER) .......................... 88
7.7.1.2. Réparation des mésappariements (MMR) ...................... 89
7.7.1.3. Réparation des cassures double brin (DSBR)................. 89
7.7.1.4. Réparation par excision de nucléotides (NER)............... 89
7.7.1.4.1. Réparation globale du génome (GGR) .................... 90
7.7.1.4.2. Réparation couplée à la transcription (TCR)........... 90
7.7.2. Importance physiopathologique des systèmes de réparation..... 92
7.7.2.1. Xeroderma pigmentosum (XP)....................................... 92
7.8. Apoptose............................................................................................. 95
7.8.1. Généralité ................................................................................... 95
7.8.2. Apoptose UV-induit................................................................... 96
7.9. Photoprotection par adaptation naturelle ...................................... 98
7.9.1. Pigmentation .............................................................................. 98

Chapitre II : Le facteur de transcription HIF-1α

1. Hypoxie, situation où intervient le facteur HIF-1................... 100
2. Structure de HIF-1 .................................................................... 102
2.1. Isoformes de HIF-1α......................................................................... 103
3. Régulation de HIF-1α ............................................................... 106
3.1. Régulation O dépendante................................................................ 106 2
3.1.1. Hydroxylation .......................................................................... 106
indépendante ............................................................ 108 3.2. Régulation O2
3.2.1. Acétylation ............................................................................... 108
3.2.2. Phosphorylation ....................................................................... 108
3.2.3. SUMOylation ........................................................................... 109
3.2.4. S-nitrosation ............................................................................. 110
3.3. Cofacteurs impliqués dans la régulation de HIF-1α...................... 112
3.4. Rôle des ROS dans l’activation de HIF-1α..................................... 113
64. Rôle de HIF-1α dans la peau .................................................... 116
4.1. HIF-1α, cancer et angiogenèse tumorale ........................................ 116
4.2. HIF-1α et cicatrisation...................................................................... 119
4.3. HIF-1α et molécules d’adhésion ...................................................... 120
4.3.1. HIF-1α et intégrines................................................................. 120
4.3.2. HIF-1α et laminine-332 ........................................................... 122
4.3.3. HIF-1α, collagènes et d'autres molécules d'adhésions ............ 122
4.4. HIF-1α et métalloprotéinases 124


DEUXIEME PARTIE : Travaux personnels

Chapitre I : Introduction.................................................. 125

1. Présentation générale................................................................................. 125
2. Résumé du premier article ........................................................................ 126
3. Premier article : HIF-1α régule l’expression des protéines de la
réparation par excision de nucléotides dans les kératinocytes .................. 128

Chapitre II : Matériels et Méthodes................................ 142

1. Etudes in vitro sur les kératinocytes........................................ 142
1.1. Origine des prélèvements ................................................................. 142
1.2. Culture cellulaire............................................................................... 142
1.3. Transduction des kératinocytes ....................................................... 143
2. Constructions plasmidiques et lentivirales ............................. 143
2.1. Amplification des plasmides............................................................. 144
2.1.1. Culture bactérienne .................................................................. 144
2.1.2. Transformation des bactéries ................................................... 144
2.1.3. Amplification des clones et extraction plasmidique................ 144
2.1.4. Quantification et vérification 144
2.2. Production de vecteurs lentiviraux.................................................. 145
3. Préparation des épidermes reconstruits .................................. 146
4. Etudes morphologiques............................................................. 147
4.1. Histologie ...........................................................................................147
4.2. Immunohistochimie........................................................................... 148
4.3. Immunofluorescence......................................................................... 148
5. Analyse par cytométrie en flux................................................. 149
6. Analyse des protéines par Western Blot.................................. 149
6.1. Préparation des échantillons ............................................................ 149
76.2. Migration sur gel de polyacrylamide .............................................. 149
6.3. Transfert ............................................................................................ 150
6.4. Révélation........................................................................................... 150
7. Caractérisation des lignées de souris transgéniques............... 150
7.1. Origine des lignées de souris ............................................................ 150
7.2. Croisement des lignées...................................................................... 150
7.2.1. KO inductible de HIF-1α......................................................... 150
7.2.2. KO constitutif de HIF-1α 152
7.3. Génotypage ........................................................................................ 152
7.4. Test de cicatrisation .......................................................................... 153

Chapitre III : Résultats..................................................... 154

1. Etude du rôle de HIF-1α chez la souris ................................... 156
1.1. Génération des lignées de souris transgéniques ............................. 156
flox/flox 1.2. La souris K14-Cre/HIF-1α développe des symptômes cutanés
au fur et à mesure de son vieillissement................................................. 158
1.3. L’absence d’expression de HIF-1α au niveau de l’épiderme entraîne
chez la souris une diminution de la laminine-322 ainsi que de l’intégrine
β1................................................................................................................ 161
1.4. L’inactivation de HIF-1α au niveau de l’épiderme entraîne chez la
souris un retard de la cicatrisation......................................................... 162
1.5. L’inactivation de HIF-1α (induite par injection du tamoxifène)
T2entraîne brusquement une mortalité chez les souris K14-CreER /HIF-
flox/flox1α ...................................................................................................... 164
2. Etude du rôle de HIF-1α, in vitro, dans les cellules humaines.....
......................................................................................................... 166
2.1. L’inhibition de HIF-1α dans les kératinocytes humains entraîne une
diminution d’expression de la laminine-332 ainsi que des intégrines qui
lui sont liées ............................................................................................... 166
2.2. L’inhibition de HIF-1α dans les kératinocytes humains conduit à
l’incapacité de former des épidermes reconstruits (ER)...................... 171
2.3. L’inhibition de HIF-1α aboutit à un arrêt du cycle cellulaire et à
l’apoptose des kératinocytes.................................................................... 176

Chapitre IV : Discussion Générale et Perspectives........ 179

1. Rôle de HIF-1α dans la physiologie cutanée ........................... 179
1.1. Rôle de HIF-1α dans la régulation des molécules d’adhésion ...... 179
1.2. Rôle de HIF-1α dans la cicatrisation............................................... 183
81.3. Rôle de HIF-1α dans la régulation de l’homéostasie épidermique ....
.................................................................................................................... 184
2. Rôle de HIF-1α dans la réponse aux UVB .............................. 185


REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES........................ 189


ANNEXES.......................................................................... 248


9

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