Role of ion channels and exchangers in the regulation of dendritic cells [Elektronische Ressource] = Bedeutung von Ionenkanälen und -austauschern bei der Regulation von Dendritischen Zellen / vorgelegt von Nicole Heise geb. Matzner

De
Role of Ion Channels and Exchangers in the Regulation of Dendritic Cells Bedeutung von Ionenkanälen und -austauschern bei der Regulation von Dendritischen Zellen DISSERTATION der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Eberhard Karls Universität Tübingen zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften 2010 vorgelegt von Nicole Heise geb. Matzner Tag der mündlichen Prüfung: 20.04.2010 Dekan: Prof. Dr. Lars Wesemann 1. Berichterstatter: Prof. Dr. Michael Duszenko 2. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Florian Lang Die vorliegende Arbeit wurde am Physiologischen Institut I der Eberhard Karls Universität Tübingen unter der Leitung von Prof. Dr. Michael Duszenko des Interfakultären Instituts für Biochemie und Prof. Dr. med. Florian Lang durchgeführt. Mein Dank gilt Prof. Dr. med. Florian Lang, der mir, sowohl mit seiner intensiven fachlichen wie auch finanziellen Unterstützung, am Physiologischen Institut die Möglichkeit gegeben hat meine Forschungsprojekte umzusetzen, und somit den Grundstein für diese Arbeit gelegt hat. Zudem danke ich ihm für seine zahlreichen Ideen und Ratschläge sowie die einzigartige Möglichkeit, wertvolle Auslandserfahrungen zu sammeln. Ich danke Prof. Dr.
Publié le : vendredi 1 janvier 2010
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Role of Ion Channels and Exchangers in the
Regulation of Dendritic Cells

Bedeutung von Ionenkanälen und -austauschern bei der
Regulation von Dendritischen Zellen




DISSERTATION

der Fakultät für Chemie und Pharmazie
der Eberhard Karls Universität Tübingen

zur Erlangung des Grades eines Doktors
der Naturwissenschaften


2010




vorgelegt von
Nicole Heise geb. Matzner




























































Tag der mündlichen Prüfung: 20.04.2010

Dekan: Prof. Dr. Lars Wesemann

1. Berichterstatter: Prof. Dr. Michael Duszenko
2. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Florian Lang



































Die vorliegende Arbeit wurde am Physiologischen Institut I der Eberhard Karls Universität
Tübingen unter der Leitung von Prof. Dr. Michael Duszenko des Interfakultären Instituts für
Biochemie und Prof. Dr. med. Florian Lang durchgeführt.

Mein Dank gilt Prof. Dr. med. Florian Lang, der mir, sowohl mit seiner intensiven fachlichen
wie auch finanziellen Unterstützung, am Physiologischen Institut die Möglichkeit gegeben hat
meine Forschungsprojekte umzusetzen, und somit den Grundstein für diese Arbeit gelegt
hat. Zudem danke ich ihm für seine zahlreichen Ideen und Ratschläge sowie die einzigartige
Möglichkeit, wertvolle Auslandserfahrungen zu sammeln.

Ich danke Prof. Dr. Michael Duszenko, der mir ermöglicht hat, an der Fakultät für Chemie
und Pharmazie zu promovieren, mich trotz der räumlichen Trennung von Biochemie und
Physiologie herzlich in seiner Arbeitsgruppe willkommen hieß und mir stets mit Rat und Tat
zur Seite stand.

Ein weiterer Dank gilt Dr. Ekaterina Shumilina für ihre uneingeschränkte Hilfsbereitschaft,
Geduld und konstruktive Kritik, ihre freundliche und fröhliche Art, mit der sie stets für ein
positives Arbeitsklima sorgte, sowie für ihr offenes Ohr und ihre Ratschläge sowohl in
wissenschaftlichen als auch nicht wissenschaftlichen Angelegenheiten.

Ich danke der Arbeitsgruppe „Cell Physiology of dendritic and mast cells“ und allen anderen
Kollegen und Mitstreitern am Physiologischen Institut, insbesondere Xuan NguyenThi, Irina
Zemtsova, Evi Schmid, Kalina Steyn, Yuliya Kucherenko, Madhuri Bhandaru, Anand Rotte,
Teresa Ackermann, Hasan Mahmud, Rexhep Rexhepaj, Leonid Tyan und Ying Zhang für
ihre Freundschaft, Kollegialität und mentale Unterstützung. Ein weiterer Dank gilt Dr.
Stephan Huber für seine Hilfsbereitschaft und guten Ideen, v.a. beim trouble shooting in der
Anfangsphase. Ebenso danke ich Uwe Schüler und Peter Dürr für ihre unermüdliche
technische und handwerkliche Hilfe beim Aufbau des Imaging-Setups. Weiterhin danke ich
der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Michael Duszenko, die mich sehr freundlich aufgenommen
hat und stets willkommen hieß.

Von ganzem Herzen danke ich meinen Eltern für ihre bedingungslose Unterstützung in allen
Lebenslagen, ohne die eine akademische Ausbildung nicht möglich gewesen wäre.
Besonders am Herzen liegt mir auch der Dank an meinen Verlobten Sascha, der mich stets
ermutigt und unterstützt hat und mir und meiner Arbeit immer viel Verständnis entgegen
gebracht hat. Insgesamt möchte ich meiner gesamten Familie danken, die durch ihre
mentale Unterstützung einen erheblichen Anteil an dieser Arbeit hat.

Table of Contents

Table of Contents


1 Introduction 1
1.1 Dendritic cells in innate and adaptive immunity 1
1.2 Pattern recognition via TLRs 3
1.3 TLR signaling pathways 5
1.3.1 MyD88-dependent pathway 5
1.3.2 MyD88-independent pathway 7
1.4 Role of TLR signaling in DC function 7
1.4.1 Cytokine production 7
1.4.2 Cell surface marker expression 8
1.4.3 Phagocytic capacity 8
1.5 Regulation of intracellular calcium concentration 9
2+1.5.1 Removal and storage of Ca 9
2+ 2+1.5.1.1 Ca -ATPases and Ca exchangers 9
2+1.5.1.2 Ca -sensing mechanisms 11
2+1.5.2 Entry of extracellular Ca 12
2+1.5.2.1 Store-operated Ca channels 12
1.5.2.2 TRP channels 14
2+1.5.2.3 Voltage-gated Ca channels 15
+1.5.2.4 Voltage-gated K channels 15
2+1.5.3 Relevance of Ca -signaling for DC function 16
1.6 Immunoregulation by Vitamin D 16
1.7 Selective suppression of Th1 immune responses by glucocorticoids 19
1.8 Aim of the study 21

2 Materials and Methods 23
2.1 Materials 23
2.1.1 Tissue culture 23
2.1.1.1 Equipment 23
2.1.1.2 Chemicals 23
2.1.1.3 Culture medium composition 24
2.1.2 Intracellular Calcium Imaging 24
2.1.2.1 Technical equipment 24
2.1.2.2 Chemicals 25
2.1.2.3 Buffer composition 26
I Table of Contents

2.1.3 Patch Clamp 28
2.1.3.1 Technical Equipment 28
2.1.3.2 Chemicals 28
2.1.3.3 Bath solutions 28
2.1.3.4 Pipette solutions 30
2.1.4 Immunostaining and phagocytosis 30
2.1.4.1 Technical equipment 30
2.1.4.2 Antibodies and chemicals 31
2.1.4.3 Buffers 31
2.1.5 Migration and cytokine production 31
2.1.5.1 Technical equipment 31
2.1.5.2 Chemicals and Kits 31
2.1.5.3 Buffers and solutions 32
2.1.6 Immunoblotting 32
2.1.6.1 Technical equipment 32
2.1.6.2 Chemicals 32
2.1.6.3 Antibodies and Kits 33
2.1.6.4 Buffers 33
2.1.7 RNA measurements 34
2.1.7.1 Technical equipment 34
2.1.7.2 Chemicals 34
2.1.7.3 Kits 34
2.1.8 Animals 35
2.2 Methods 35
2.2.1 Cell culture 35
2.2.2 Immunostaining and flow cytometry 36
2.2.3 Intracellular Calcium Imaging 36
2.2.4 Patch clamp 38
2.2.5 RT-PCR 39
2.2.6 Real time-PCR 40
2.2.7 Immunoblotting 41
2.2.8 Cytokine measurement 42
2.2.9 Phagocytosis assay 43
2.2.10 Migration assay 43
2.2.11 Statistics 43



II Table of Contents

3 Results 44
2+3.1 LPS- and PGN-induced Ca entry 44
2+3.2 Involvement of TLR2 in PGN-induced effects on [Ca ] 46 i
3.3 Activation of Calcium release-activated Calcium (CRAC) channels is
measurable upon store depletion 47
3.4 CRAC channels are expressed and active in mouse DCs 48
2+3.5 Modulation of Ca entry through CRAC channels by Kv channel blockers 51
3.6 Effect of CRAC and Kv channel blockers on DC maturation and function 54
3.6.1 LPS- and PGN-induced cytokine production 54
3.6.2 LPS- and PGN-induced DC maturation 56
3.6.3 Phagocytic capacity 57
3.6.4 DC migration 58
2+3.7 1,25(OH) D and dexamethasone impair the LPS-induced increase in [Ca ] 59 2 3 i
+ 2+3.8 Expression of Na /Ca exchangers in mouse DCs 61
+ 2+3.9 Effect of 1,25(OH) D and dexamethasone on Na /Ca exchangers 62 2 3
2+3.10 Effect of 1,25(OH) D on LPS-induced Ca entry is counteracted by NCKX 66 2 3
3.11 Effect of 1,25(OH) D on Calbindin-D28K expression in DCs 67 2 3
3.12 Effect of 1,25(OH) D and dexamethasone on DC maturation and cytokine 2 3
production 67
3.13 The inhibitory effect of dexamethasone and 1,25(OH) D is abolished by 2 3
+ 2+blockers of Na /Ca exchangers 69

4 Discussion 70
4.1 DC culture 70
2+4.2 Assessment of changes in [Ca ] 70 i
2+4.3 LPS- and PGN-induced Ca entry in mouse DCs 71
4.4 Role of CRAC and Kv channels in DC maturation and function 73
2+4.5 Regulation of Ca homeostasis by 1,25(OH) D and dexamethasone 75 2 3
4.6 Conclusions and future experiments 77
4.7 Clinical Relevance 78

5 Summary 80
6 Zusammenfassung 82
7 References 84
8 Akademische Lehrer 98
9 Curriculum Vitae 99
10 Publications 101
III Figures and Tables

List of Figures

Introduction
Figure 1. The life cycle of dendritic cells (DCs) 2
Figure 2. TLR dependent and independent recognition of LPS and PGN 6
2+Figure 3. Ca extrusion mechanisms in DCs 10
Figure 4. STIM1-Orai1-interaction activates store-operated calcium entry (SOCE) 14
Figure 5. Synthesis of Vitamin D 17 3
Figure 6. Effects of 1,25(OH) D on DC maturation and function 18 2 3
Figure 7. Chemical structures of cortisol, prednisolone and dexamethasone 19
Figure 8. Effects of glucocorticoids on DC maturation and function 20

Materials and Methods
Figure 9. Intracellular Calcium Imaging Setup 36
Figure 10. Calibration Equation for the calculation of intracellular calcium concentrations 37
Figure 11. Standard curve to calculate the dissociation constant K of Fura-2 38 d

Results
Figure 12. Pseudocolor images of Fura-2 loaded DCs 44
2+Figure 13. LPS or PGN exposure increases [Ca ] in mouse DCs 45 i
2+Figure 14. The effect of PGN on [Ca ] is concentration-dependend 46 i
2+Figure 15. Effect of PGN exposure on [Ca ] depends on TLR2 47 i
Figure 16. Activation of CRAC channels in mouse DCs 48
Figure 17. All three CRAC channels CRACM1, CRACM2 and CRACM3 are expressed
in mouse DCs 49
2+Figure 18. Entry of extracellular Ca upon LPS-stimulation of DCs is mediated by
CRAC channels 50
Figure 19. Blockers of Kv1.3 and Kv1.5 inhibit Kv-like currents in mouse DCs 52
2+Figure 20. Blocking of Kv channels attenuates the increase in [Ca ] upon TLR i
stimulation of DCs 53
Figure 21. Inhibition of SOCE impairs LPS- and PGN-induced cytokine production by
DCs 54
Figure 22. Kv channel blockers attenuate cytokine production by LPS- and PGN-
stimulated DCs 55
Figure 23. CRAC and Kv channel blockers do not affect IκBα phosphorylation in
mouse DCs 56
IV

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