Role of the TL1A/DR3 pathway in NK cell effector functions [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Stephanie Claudia Heidemann

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Aus dem Universitätsklinikum Münster Medizinische Klinik und Poliklinik B – Direktor: Univ.-Prof. Dr. med. Dr. h.c. W. Domschke – Role of the TL1A/DR3 pathway in NK cell effector functions INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des doctor medicinae der Medizinischen Fakultät der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster vorgelegt von Heidemann, Stephanie Claudia aus Münster 2008 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster Dekan: Univ.-Prof. Dr. med. V. Arolt 1. Berichterstatter: Univ.-Prof. Dr. med. T. Kucharzik 2. Priv.-Doz. Dr. med. M. Brüwer Tag der mündlichen Prüfung: 27. Februar 2008 Aus dem Universitätsklinikum Münster Medizinische Klinik und Poliklinik B – Direktor: Univ.-Prof. Dr. med. Dr. h.c. W. Domschke – Referent: Univ.-Prof. Dr. med. T. Kucharzik Koreferent: Priv.-Doz. Dr. med. M. Brüwer Zusammenfassung Bedeutung des TL1A/DR3-Signalwegs für die Effektorfunktionen Natürlicher Killerzellen Stephanie Claudia Heidemann Das vor kurzem identifizierte Zytokin der TNF-Superfamilie TL1A (TNFSF15) ist Ligand des Todesrezeptors DR3 (TNFRSF25), welcher nach Zellaktivierung in T-Zellen und Natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) exprimiert wird.
Publié le : mardi 1 janvier 2008
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Aus dem Universitätsklinikum Münster
Medizinische Klinik und Poliklinik B
– Direktor: Univ.-Prof. Dr. med. Dr. h.c. W. Domschke –



Role of the TL1A/DR3 pathway in
NK cell effector functions


INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des doctor medicinae

der Medizinischen Fakultät
der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster


vorgelegt von

Heidemann, Stephanie Claudia
aus Münster
2008











































Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät
der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster




































Dekan: Univ.-Prof. Dr. med. V. Arolt

1. Berichterstatter: Univ.-Prof. Dr. med. T. Kucharzik
2. Priv.-Doz. Dr. med. M. Brüwer
Tag der mündlichen Prüfung: 27. Februar 2008 Aus dem Universitätsklinikum Münster
Medizinische Klinik und Poliklinik B
– Direktor: Univ.-Prof. Dr. med. Dr. h.c. W. Domschke –
Referent: Univ.-Prof. Dr. med. T. Kucharzik
Koreferent: Priv.-Doz. Dr. med. M. Brüwer
Zusammenfassung
Bedeutung des TL1A/DR3-Signalwegs für die Effektorfunktionen Natürlicher Killerzellen
Stephanie Claudia Heidemann

Das vor kurzem identifizierte Zytokin der TNF-Superfamilie TL1A (TNFSF15) ist Ligand des
Todesrezeptors DR3 (TNFRSF25), welcher nach Zellaktivierung in T-Zellen und Natürlichen
Killerzellen (NK-Zellen) exprimiert wird. TL1A steigert die durch Interleukin (IL)-12 und IL-18
induzierte Produktion von IFN- γ in T-Zellen um das 10-fache oder mehr. Während ein Großteil der
NK-Zellen infolge Stimulation mit den Zytokinen IL-12 und IL-18 DR3 exprimiert, führt die
Kostimulation mit TL1A nur zu einer zweifachen Steigerung der IFN- γ-Produktion. Diese Studie hat
sich deshalb mit der Fragestellung beschäftigt, ob der TL1A-DR3-Signalweg von Bedeutung ist für
eine weitere durch IL-12 and IL-18 regulierte Effektorfunktion der NK-Zellen, die Lyse von
Tumorzellen. Der Einfluß von TL1A auf die Zytotoxizität von mit IL-12 und IL-18 kostimulierten, aus
mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) isolierten NK-Zellen wurde in
51Chromfreisetzungstests untersucht.
Es konnte kein zusätzlicher Einfluß von TL1A auf die durch IL-12 and IL-18 induzierte Zytotoxizität
der NK-Zellen gegenüber der NK-sensitiven Tumorzelllinie K562 (CML) nachgewiesen werden.
TL1A war jedoch in der Lage, die Zytotoxizität der NK-Zellen gegenüber der NK-resistenten
Tumorzelllinie Daudi (Burkitt-Lymphom), welche nur durch Zytokin-aktivierte NK-Zellen lysiert wird,
zu steigern. TL1A erhöhte die durch IL-12 und IL-18 induzierte Lyse der Daudi-Zellen durch PBMC
um das zweifache und durch aus PBMC isolierten NK-Zellen um das 7-fache. TL1A steigerte ferner
die durch IL-12 und IL-18 koaktivierte NK-Zell-vermittelte Lyse der Tumorzellinien WiDr and
SW837, die von Adenokarzinomen des Kolon und Rektums abgeleitet sind, wenn auch in geringerem
Ausmaß. Durch die hier nachgewiesene Fähigkeit, die Zytotoxizität von NK-Zellen gegenüber NK-
resistenten Tumoren zu steigern, könnte dem TNF-Superfamilienmitglied TL1A in vivo eine
Schlüsselrolle als Koaktivator der Zytotoxizität Natürlicher Killerzellen zukommen.
3Mittels Durchflußzytometrie, ELISA bzw. H -Thymidin-Inkorporationsassays konnte die vorliegende
Studie ferner belegen, daß aus einer Anzahl von getesteten Zytokinen und Zytokinkombinationen nur
die Kombination von IL-12 und IL-18 zu einer signifikanten Induktion der DR3-Expression in NK-
Zellen führt, daß TL1A einen synergistischen Effekt auf die Produktion von IFN- γ durch mit optimalen
und suboptimalen Konzentrationen von IL-12 und IL-18 kostimulierten NK-Zellen hat und daß dieser
Effekt überwiegend durch die Proliferation von NK-Zellen bedingt ist.
Tag der mündlichen Prüfung: 27. Februar 2008 Table of Contents
Table of Contents

1 Introduction 1
1.1 Immunosurveillance……………………………………………………. 1
1.2 Effector cells of immunosurveillance………………………………….. 1
1.2.1 NK cells………………………………………………………... 1
1.2.2 T cells………………………………………………………….. 3
1.3 IL-12 and IL-18………………………………………………………… 4
1.4 The TL1A/DR3 pathway……………………………………………….. 6
1.5 Aims of the study……………………………………………………..… 8

2 Materials 9
2.1 Peripheral blood cells…………………………………………………... 9
2.2 Tumor cell lines………………………………………………………... 9
2.3 Cytokines………………………………………………………………. 10
2.4 Antibodies……………………………………………………………… 10
2.4.1 Flow cytometry………………………………………………… 10
2.4.2 ELISA…………………………………………………………. 11
2.5 Chemicals and buffers…………………………………………………. 11
2.5.1 Isolation of PBMC and NK cells................................................ 11
2.5.2 Cell culture…………………………………………………….. 12
2.5.3 Flow cytometry………………………………………………... 12 2.5.4
51 2.5.5 Cr-release assay……………………………………………… 13
3 2.5.6 H -Thymidine incorporation assay………..……...…………… 13
2.6 Composition of prepared solutions……………………………………. 13
2.6.1 PBMC isolation……………………………………………….. 13
2.6.2 NK cell isolation………………………………………………. 14
2.6.3 Cell culture…………………………………………………….. 14
2.6.4 Flow cytometry……………………………………………...…
2.6.5 ELISA…………………………………………………………. 14
2.7 Kits…………………………………………………………………….. 15
iv Table of Contents
2.7.1 NK cell isolation……………………………………………….. 15
2.7.2 Flow cytometry……………………………………………….... 16
2.8 Laboratory equipment…………………………………………………..
2.9 Other materials…………………………………………………………. 17
2.9.1 Cell culture…………………………………………………...... 17
2.9.2 ELISA………………………………………………………….
51 2.9.3 Cr-release assay…………………………………………….... 17
3 2.9.4 H -Thymidine incorporation assay…………..………………... 17
2.10 Software……………………………………………………………...… 18

3 Methods 19
3.1 Isolation and culture of PBMC, NK cells, and non-NK cells………….. 19
3.1.1 Isolation of PBMC ……………………………………………. 19
3.1.2 Isolation of NK cells and non-NK cells……………………….. 20
3.1.3 Culture conditions……………………………………………... 22
3.1.4 Stimulation with cytokines……………………………………..
3.2 Culture of tumor cell lines……………………………………………… 22
3.3 Flow cytometric analysis……………………………………………….. 23
3.3.1 Evaluation of NK cell purity…………………………………… 25
3.3.2 Analysis of DR3 surface expression…………………………… 26
3.3.3 Analysis of intracellular IFN- γ production……………………. 27
3.4 Detection of IFN- γ by ELISA………………………………………….. 28
513.5 Cr-release assay…………………………………………………..…... 30
33.6 H -Thymidine incorporation assay…………………………………….. 35
3.7 Statistical analysis……………………………………………………… 36

4 Results 37
4.1 Regulation of DR3 expression on NK cells by cytokines……………… 37
4.2 Dose-kinetic analysis of the effect of IL-12/IL-18 on NK cell
IFN- γ production and proliferation and effect of co-stimulatory TL1A.. 38
4.2.1 NK cell IFN- γ production at titrated concentrations of IL-12/
IL-18 and the effect of co-stimulatory TL1A…………….……. 38
v Table of Contents
4.2.2 NK cell proliferation at titrated concentrations of IL-12/
IL-18 and the effect of co-stimulatory TL1A………….….…… 39
4.3 Effect of TL1A on IL-12/IL-18-induced NK cell cytotoxicity
against NK-sensitive K562 target cells……………………………….... 41
4.4 Time-kinetic analysis of the effect of TL1A on IL-12/IL-18-induced
NK cell cytotoxicity against K562 tumor cells……………………….... 44
4.5 Effect of low level stimulation with IL-12/IL-18 on NK cell DR3
expression and IFN- γ production………………………………………. 45
4.5.1 NK cell DR3 expression at low level stimulation with IL-12/
IL-18…………………………………………………………... 46
4.5.2 Intracellular IFN- γ production of NK cells at low level
stimulation with IL-12 and IL-18 and effect of co-stimulatory TL1A................................................................... 47
4.6 Effect of TL1A on NK cell cytotoxicity against NK-sensitive K562
target cells at low level stimulation with IL-12 and IL-18………….…. 49
4.7 Time-kinetic analysis of the effect of TL1A on NK cell cytotoxicity
against K562 tumor cells at low level stimulation with IL-12/IL-18…... 50
4.8 Effect of TL1A on IL-12/IL-18-induced cytotoxicity of PBMC
tested against cell lines lysed only by activated NK cells………….….. 52
4.9 Effect of TL1A on IL-12/IL-18-induced cytotoxicity of purified NK
cells and cytotoxic T-cells towards NK-resistant cell lines …………… 54

5 Discussion 58
5.1 Summary of the results…………………………………………………. 58
5.2 Mechanisms potentially involved in TL1A selective enhancement
of IL-12/IL-18-induced NK cytotoxicity towards NK-resistant target
cells………………………………………………………………….…. 60
5.2.1 General mechanisms of tumor resistance to NK cell-mediated
lysis………………………………………………………..….... 60
5.2.2 Surface phenotype of the NK-sensitive tumor target K562
and the NK-resistant tumor cell lines Daudi, SW837 and WiDr. 61
5.2.3 Tumor resistance towards the perforin/granzyme pathway……. 62
vi Table of Contents
5.2.4 Effects of cytokines on NK cell recognition of tumor
targets and triggering of NK cells……….…….…………….…. 63
5.2.5 Signal transduction pathways regulated by IL-12, IL-18 and
TL1A…………………………………………………………… 65
5.2.6 Potential role of TL1A in activation-induced cell death of NK
cells…………………………………………………..………… 66
5.3 Conclusion……………………………………………………………... 67

6 Abstract 68

7 References 69

8 Acknowledgements 81

9 Curriculum vitae 82

10 Lebenslauf 83

vii List of Figures
List of Figures

513.1 Results of a representative 2-hr Cr-release assay with PBMC…………… 32
3.2 A plating scheme for the cytotoxicity assay with PBMC………………...... 34

4.1 NK cell IFN- γ production at titrated concentrations of IL-12/IL-18 and
effect of co-stimulatory TL1A………………….………………………….. 39
4.2 DNA replication of NK cells at titrated concentrations of IL-12 and IL-18
and effect of co-stimulatory TL1A………………………………………..... 40
4.3 Effect of TL1A on IL-12/IL-18-induced NK cell cytotoxicity against NK-
sensitive K562 target cells……………………………………………….…. 42
514.4 Comparison of percent specific lysis in a 2-h and a 4-h Cr-release assay... 43
4.5 NK cell DR3 expression at low level stimulation with IL-12/IL-18……….. 47
4.6 Intracellular IFN- γ production of NK cells at low level stimulation with IL-
12/IL-18 without and with co-stimulatory TL1A…………………………... 48
4.7 Effect of TL1A on the cytotoxicity of PBMC and NK cells against NK-
sensitive K562 target cells at low level stimulation with IL-12 and IL-18… 50
4.8 Time-kinetic analysis of the effect of TL1A on NK cell cytotoxicity against
K562 tumor cells at low level stimulation with IL-12/IL-18......................... 51
4.9 Effect of TL1A on IL-12/IL-18 induced cytotoxicity of PBMC tested
against cell lines lysed only by activated NK cells……………………..…... 53
4.10 ed cytotoxicity of purified NK cells
and cytotoxic T-cells towards Daudi……………………………………….. 55
4.11
towards WiDr and SW837………………………………………………….. 56

viii List of Tables
List of Tables

4.1 Regulation of DR3 expression on NK cells by cytokines…………………… 37
51 514.2 Spontaneous and maximal release of Chromium in a 2-h and a 4-h Cr-
release assay……………………………………………………………….… 44
4.3 Time-kinetic analysis of the effect of TL1A on NK cell cytotoxicity
against K562 tumor cells at maximal concentrations of IL-12/IL-18………. 45
4.4 Time-kinetic analysis of the effect of TL1A on NK cell cytotoxicity against
K562 tumor cells at low level stimulation with IL-12/IL-18……………….. 52
ix

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