Rôles fonctionnels de neuropeptides chez Drosophila melanogaster : développement d'outils génétiques et exemples d'études physiologique et comportementale

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Sous la direction de Jan A. Veenstra
Thèse soutenue le 25 juin 2010: Bordeaux 1
Dans le but d’étudier le rôle fonctionnel des neuropeptides chez la drosophile, nous avons essayé d’utiliser le récepteur µ aux opioïdes (MOR) afin d’inhiber temporairement la libération de neuropeptides. Cependant, quand nous l’avons exprimé dans les cellules endocrines produisant l’hormone adipokinétique (AKH), le récepteur MOR a présenté une activité constitutive empêchant tout contrôle dans le temps. Nous proposons d’utiliser les récepteurs RASSL (Receptors Activated Solely by Synthetic Ligands) développés chez les vertébrés. Ces récepteurs, activés uniquement par des ligands synthétiques, ont été modifiés afin qu’ils soient dénués d’activité constitutive. Afin de tester rapidement l’efficacité d’un récepteur RASSL inhibiteur chez la drosophile, nous avons cherché une alternative à la mesure des taux de tréhalose et de glycogène (démontrant la libération d’AKH) qui en plus d’être laborieuse produit des résultats variables. L’hormone GPA2/GPB5, récemment découverte, est particulièrement intéressante, en effet, elle semble avoir un rôle antidiurétique. Nous avons généré des lignées transgéniques exprimant la protéine Gal4 dans les cellules GAP2/GPB5 et nous avons montré que l’ablation génétique de ces cellules compromet la survie suggérant qu’elles pourraient représenter un bon système pour tester l’efficacité du RASSL inhibiteur. Ensuite nous nous sommes intéressés au contrôle de la libération du neuropeptide AKH qui a un rôle fonctionnel homologue à celui du glucagon des vertébrés. Malgré quelques résultats encourageants, nous n’avons pas pu confirmer le rôle inhibiteur de l’AstA sur la libération de l’AKH. Enfin nous nous sommes intéressés au réseau qui contrôle le comportement de cour. Nous avons généré des lignées transgéniques exprimant la protéine Gal4 sous la dépendance du promoteur potentiel du récepteur du neuropeptide SIFamide (SIFR) et nous avons démontré que ce neuropeptide contrôle le comportement de cour via son récepteur SIFR en agissant, du moins en partie, sur les neurones fruitless.
-Drosophile
-Neuropeptide
-Rcpg
-Akh
-AstA
-SIFamide
-Sifr
-Fruitless
-Mor
In order to study the functional roles of neuropeptides in Drosophila, I attempted to use the µ opioïd receptor (MOR) to temporarily inhibit liberation of neuropeptides. However, when expressed in the AKH (adipokinetic hormone) endocrine cells of Drosophila, MOR turned out to be constitutively active, making it impossible to use it as envisioned. Others have encountered and subsequently solved similar problems for the so-called RASSL (Receptors Activated Solely by Synthetic Ligands) in vertebrates. As the bioassay for testing release of AKH is cumbersome, time-consuming and variable, I searched for an alternative neuroendocrine system to test the efficiency of an inhibitory RASSL in Drosophila. The recently discovered GPA2/GPB5 seemed particularly attractive, as it is likely an antidiuretic hormone. Transgenic flies expressing Gal4 in the GPA2/GPB5 were produced and genetic ablation of these cells severely compromised survival, suggesting that this might indeed be good model system. Attempts so demonstrate a physiological role of allatostatin A in the release of AKH yielded inconclusive results. In order to study the role of the neuropeptide SIFamide, which modulates sexual behavior in Drosophila, I generated transgenic flies expressing Gal4 under dependence of potential promoter of this neuropeptide receptor (SIFR) and showed that SIFamide controls courtship at least in part by acting directly on fruitless neurons.
-Drosophila
-Neuropeptide
-Gpcr
-Akh
-AstA
-SIFamide
-Sifr
-Fruitless
-Mor
Source: http://www.theses.fr/2010BOR14043/document
Publié le : dimanche 30 octobre 2011
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N° d’ordre : 4043



THESE

PRESENTEE A

L’UNIVERSITÉ BORDEAUX I

ECOLE DOCTORALE : SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE

PAR

Azza Sellami Chakroun

POUR L’OBTENTION DU GRADE DE

DOCTEUR

SPECIALITE : NEUROSCIENCES


ROLES FONCTIONNELS DE NEUROPEPTIDES CHEZ
Drosophila melanogaster :
DEVELOPPEMENT D'OUTILS GENETIQUES ET EXEMPLES
D'ETUDES PHYSIOLOGIQUE ET COMPORTEMENTALE





Soutenue le 25 juin 2010



M. F. Rouyer, D.R., Institut de Neurobiologie Alfred Fessard Rapporteur
M. A. Robichon, D.R., Université Nice-Sophia Antipolis Rapporteur
M. J. Simmers, D.R., Université Bordeaux 2 Président du jury
M. J. A. Veenstra, Pr. Université Bordeaux 1 Directeur de thèse




-2010-















2
ACP AKH/Corazonine-related Peptide
AKH AdipoKinétic Hormone
AKHR AdipoKinétic Hormone Receptor
Allatostatine A, B ou C Ast A, B ou C
CCAP Crustacean Cardioactive Peptide
CCAPR Crustacean Cardioactive Peptide Receptor
CCK CholeChysitoKinine
CI Courtship Index
CRF Corticotropine Releasing Factor

CRZ Corazonine
cis-Vaccenyl Acetate cVA
DAR Drosophila Allatostatine Receptor
DH31 Diuretic Hormone
Dilp Drosophila insulin-like peptide
Drosophila Leu-rich repeats-containing G protein-
DLGR
coupled Receptor
dsx doublesex
DTK Drosophila TachyKinine
DTKR Drosophila TachyKinine Receptor
EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein
Embryonic Lethal Abnormal Vision Elav
fru fruitless
FSH Follicle-Stimulating Hormone
GFP Green Fluorescent Protein
GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone
Glycoprotein A GPA
GPB Glycoprotein B
GPCR G Protein-Coupled Receptors
GRN Gustatory Receptor Neurons
IGF Insulin Growth Factor
Luteinizing Hormone LH
Lom-TK Locusta migratoria TachyKinine
LSDP Lipid Storage Droplet Protein 2
Lsp2 Larval Serum Protein 2
MIP MyoInhibitory Peptide
Mu Opioïd Receptor MOR
NPF NeuroPeptide F
NPFR NeuroPeptide F Receptor
OR Olfactory Receptor
ORN Olfactory Receptor Neuron
Polymerase Chain Reaction PCR
PDF Pigment-Dispersing Factor
PN Projection Neuron
ppk pickpocket
PTTH ProThoracicoTropic Hormone
Receptor Activated Solely by Synthetic Ligands RASSL
RPCH Red Pigment Concentrating Hormone
SIFR SIFamide Receptor
sNPF small NeuroPeptide F
SPR Sex Peptide Receptor
transformer tra
TRET TREhalose Transporter
TSH Thyroid Stimulating Hormone
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4
Dans le but d’étudier le rôle fonctionnel des neuropeptides chez la drosophile, nous avons
essayé d’utiliser le récepteur μ aux opioïdes (MOR) afin d’inhiber temporairement la
libération de neuropeptides. Cependant, quand nous l’avons exprimé dans les cellules
endocrines produisant l’hormone adipokinétique (AKH), le récepteur MOR a présenté une
activité constitutive empêchant tout contrôle dans le temps. Nous proposons d’utiliser les
récepteurs RASSL (Receptors Activated Solely by Synthetic Ligands) développés chez les
vertébrés. Ces récepteurs, activés uniquement par des ligands synthétiques, ont été modifiés
afin qu’ils soient dénués d’activité constitutive. Afin de tester rapidement l’efficacité d’un
récepteur RASSL inhibiteur chez la drosophile, nous avons cherché une alternative à la
mesure des taux de tréhalose et de glycogène (démontrant la libération d’AKH) qui en plus
d’être laborieuse produit des résultats variables. L’hormone GPA2/GPB5, récemment
découverte, est particulièrement intéressante, en effet, elle semble avoir un rôle antidiurétique.
Nous avons généré des lignées transgéniques exprimant la protéine Gal4 dans les cellules
GAP2/GPB5 et nous avons montré que l’ablation génétique de ces cellules compromet la
survie suggérant qu’elles pourraient représenter un bon système pour tester l’efficacité du
RASSL inhibiteur. Ensuite nous nous sommes intéressés au contrôle de la libération du
neuropeptide AKH qui a un rôle fonctionnel homologue à celui du glucagon des vertébrés.
Malgré quelques résultats encourageants, nous n’avons pas pu confirmer le rôle inhibiteur de
l’AstA sur la libération de l’AKH. Enfin nous nous sommes intéressés au réseau qui contrôle
le comportement de cour. Nous avons généré des lignées transgéniques exprimant la protéine
Gal4 sous la dépendance du promoteur potentiel du récepteur du neuropeptide SIFamide
(SIFR) et nous avons démontré que ce neuropeptide contrôle le comportement de cour via son
récepteur SIFR en agissant, du moins en partie, sur les neurones fruitless.
Mots clés: Drosophile, Neuropeptides, MOR, RCPG, GPA2/GPB5, AKH, AstA
SIFamide, SIFR, fruitless



In order to study the functional roles of neuropeptides in Drosophila, I attempted to use the μ
opioïd receptor (MOR) to temporarily inhibit liberation of neuropeptides. However, when
expressed in the AKH (adipokinetic hormone) endocrine cells of Drosophila, MOR turned
out to be constitutively active, making it impossible to use it as envisioned. Others have
encountered and subsequently solved similar problems for the so-called RASSL (Receptors
Activated Solely by Synthetic Ligands) in vertebrates. As the bioassay for testing release of
AKH is cumbersome, time-consuming and variable, I searched for an alternative
neuroendocrine system to test the efficiency of an inhibitory RASSL in Drosophila. The
recently discovered GPA2/GPB5 seemed particularly attractive, as it is likely an antidiuretic
hormone. Transgenic flies expressing Gal4 in the GPA2/GPB5 were produced and genetic
ablation of these cells severely compromised survival, suggesting that this might indeed be
good model system. Attempts so demonstrate a physiological role of allatostatin A in the
release of AKH yielded inconclusive results. In order to study the role of the neuropeptide
SIFamide, which modulates sexual behavior in Drosophila, I generated transgenic flies
expressing Gal4 under dependence of potential promoter of this neuropeptide receptor (SIFR)
and showed that SIFamide controls courtship at least in part by acting directly on fruitless
neurons.
Key words: Drosophila, Neuropeptides, MOR, RCPG, GPA2/GPB5, AKH, AstA,
SIFamide, SIFR, fruitless




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6

Ce travail a été effectué au sein du centre de neurosciences intégratives et cognitives
(CNIC) UMR5228, Université Bordeaux 1.

J’exprime ma gratitude à M. Georges Di Scala directeur du CNIC pour m’avoir
accueillie au sein de son laboratoire. Merci pour le soutien que vous m’avez témoigné en me
rédigeant une lettre de recommandation fort élogieuse.

Je remercie les membres du jury pour m’avoir fait l’honneur de juger ce travail.
M. Alain Robichon et M. François Rouyer qui ont accepté d’être les rapporteurs de
cette thèse. Je les remercie pour la disponibilité dont ils ont fait preuve dans l’examen
rigoureux de ce travail.
M. John Simmers qui a accepté de présider la commission d’examen de cette thèse, je
le remercie pour sa bienveillance, ses remarques pertinentes ainsi que pour le vif intérêt qu’il
a porté à ce travail.

Je tenais à exprimer toute ma reconnaissance à mon directeur de thèse le Professeur
Jan Veenstra. Grâce à lui, ces quelques années passées au laboratoire seront inoubliables,
elles ont été épanouissantes tant sur le plan scientifique que personnel. Il possède deux
qualités rares et précieuses qui font de lui un grand homme : il est sincère et il a la
FLAMME !!! Il a m’a fait partager sa passion et il y a maintenant 7 ans, il m’a donné envie de
faire de la recherche. Je te remercie Jan du plus profond de mon cœur, tu m’as enseigné la
recherche comme d’autres enseigneraient la vie à leurs enfants. Tu m’as montré les bénéfices
à être ouvert aux autres, libre, généreux, à partager ses connaissances et surtout tu m’as fait
confiance et tu m’as fait avancer.

Je tiens à remercier tous le « LNC student team power »
Edith, mon amoureuse, tu m’as tellement appris, qu’est ce que c’était bon toutes nos
discussions, nos rires !!!! Les marches ne seront plus les mêmes sans nous. Tu as ce petit plus
qui touche tout le monde, tu es brillante et merveilleuse, tu m’as irradié par ta générosité. Je
te jure le prochain lézard je le tue !
Sébastien, j’espère que les coréens sont aussi gentils avec toi que tu l’as été avec moi.
Merci pour toutes les séances de ciné, à nous deux on a donné au Gaumont de quoi vivre
pendant dix ans. Je te donne un bon magique pour que les prochaines années soient les plus
belles de ta vie.
7
Aurélie, François, Fred, Pierre, Aurore, Sylvain, Stéphane, Oli, Ludo, Guillaume,
Julie, Stéphanie… Grâce à vous le Master 2 et la thèse ont pris des allures de fête
permanente, le labo était Ibiza version boulot!! Je vous remercie du plus profond de mon cœur
et je n’oublierais jamais tous nos bons moments.

Je remercie aussi tous mes collègues qui, pour la plupart, sont maintenant des amis
Marianne et Nadine, je vous adore, rien que de penser à vous j’ai envie de rire !!!
Tous nos bons moments étaient extraordinaires. Mille mercis pour vos conseils, pour les
corrections et surtout pour votre soutien, vous avez un cœur en or. Merci aussi à Katia et
Maria, vous savez j’adore la mouche au chocolat !!
Je voudrais remercier aussi les nouveaux venus Delphine, Sébastien, Mathieu et
Mathias. On n’aura pas eu le temps de bien se connaître mais les quelques moments passés
ensemble ont été très agréables.
Je remercie vivement Marie-Laure et Dominique pour leur sourire permanent, vous
représentez la bonne humeur du labo Vive Dukan !!!, je joins aussi Angélique et Karine, je
vous remercie pour la table de fou pour mon pot de thèse, vous êtes adorables.
Je voudrais remercier Angélique Despelat qui a effectué un stage au sein du
laboratoire et qui m’a aidé dans la caractérisation de quelques lignées. Merci pour ta
gentillesse, je te souhaite une très bonne continuation.
Je voudrais aussi remercier Jean-Luc Morel pour son aide apportée lors de
l’utilisation du microscope confocal, je le remercie pour sa patience.

Je voudrais aussi remercier vivement de nombreux drosophilistes à travers le monde
qui n’ont jamais entendu parler de moi et qui m’ont envoyé des lignées de drosophiles et des
anticorps sur simple demande par mail.

Si cette thèse s’est aussi bien déroulée, c’est aussi grâce à d’autres personnes
irremplaçables.
Nabila, tu es une fille extraordinaire, belle, intelligente, généreuse, marrante, tu m’as
soutenue depuis quelques années déjà, je te remercie pour tout ce que tu m’as apporté. Je suis
sûre que tu va les éblouir, tiens bon !!
Mon frère, ma sœur, ma belle sœur, mes grands parents, ma tante, mes oncles,
mes cousins et cousines, je tiens à vous remercier, vous avez tous contribué à la réussite de
cette thèse grâce aux sorties, aux week-ends, aux rires que l’ont a partagé mais aussi à
8
l’écoute et au soutien que vous m’avez apporté. J’ai tellement de chance de vous avoir comme
famille.
Je voudrais remercier mon grand père. C’était un homme merveilleux, je n’oublierais
jamais son sourire. Sa bonté n’a eu d’égal que sa sincérité. Il sera pour toujours mon guide.
Mes beaux parents Samira et Abdelmajid qui m’on accueillie dans leur foyer comme
leur propre fille et qui m’ont soutenue tout au long de cette thèse, je tiens à vous remercier
pour votre sincérité et votre générosité qui ne connaissent pas de limites.
Maman et Papa, je ne sais pas par où commencer pour vous démontrer tout mon
amour. Merci de m’avoir fais autant confiance, d’avoir cru en moi et de m’avoir soutenue
depuis le début. Chaque jour je me rends compte un peu plus de la chance que j’ai de vous
avoir à mes côtés, vous êtes un exemple pour moi. Cette thèse c’est aussi la votre.

Aux amis de Dakar, merci d’avoir bien pris soin de lui !! Une nouvelle étape
commence pour moi et je suis tellement heureuse de la partager avec vous !!


Je dédie cette thèse à mon mari Mohamed, un homme d’exception. Tu as supporté ces
nombreuses années d’éloignement, mais bientôt j’effacerai à tout jamais ton nom de mon
compte Skype, oovoo, msn… Tu es merveilleux et tu as rendu ma vie merveilleuse.

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