MECANISMES DE REGULATION IMPLIQUES DANS LA PATHOGENICITE DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA : SYSTEME DE SECRETION DE TYPE III, EPIGENESE ET QUORUM SENSING

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Domaine: Sciences du Vivant
Pseudomonas aeruginosa est un bacille opportuniste responsable d'infections graves. Sa pathogénicité repose sur de nombreux facteurs de virulence dont le système de sécrétion de type III (SSTT). Ce système est activé par le contact de la bactérie avec une cellule ou une déplétion calcique et permet l'injection de toxines directement dans le cytosol de la cellule. Différents phénotypes sont observés lors d'une infection pulmonaire dans le cas de la mucoviscidose : un phénotype inductible par le contact cellulaire ou la déplétion calcique et un autre non inductible.
En l'absence de mutations, cette dualité de phénotype peut être envisagée sous un aspect épigénétique.
A l'aide d'un outil informatique, nous avons déterminé les dynamiques possibles d'un modèle du SSTT supportant l'hypothèse de bistabilité et mis en évidence l'existence possible d'épigénèse. Grâce à cette méthode nous avons également définit les expériences permettant de tester cette hypothèse. Nous avons démontré qu'une modification épigénétique pouvait être à l'origine d'une acquisition stable de l'inductibilité du SSTT in vitro. Ce changement héréditaire de phénotype a été confirmé, in vivo, à l'aide d'un modèle d'infection pulmonaire aiguë.
Dans un second temps, nous avons mis en évidence une répression du SSTT à densité cellulaire élevée. Celle-ci est induite par un signal produit et sécrété par la bactérie. L'utilisation de mutants a permis de montrer que les signaux connus du quorum sensing ne sont pas impliqués dans cette répression. Ainsi, l'expression du SSTT dépend de la densité bactérienne et la répression à densité cellulaire élevée est induite par un mécanisme de type quorum sensing non connu.

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Sciences et Géographie

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Soutenue publiquement par

Didier FILOPON
le 21 décembre 2005

pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE JOSEPH FOURIER – GRENOBLE I
Discipline : Virologie, Microbiologie, Immunologie


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Mécanismes de régulation impliqués dans la pathogénicité
de Pseudomonas aeruginosa : Système de Sécrétion de
Type III, Epigénèse et Quorum Sensing

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Composition du Jury

Professeur D. Schneider Président
Professeur B. Guery Rapporteur
Docteur A. Filloux Rapporteur
Professeur D. Haas Examinateur
Professeur J. Guespin-Michel Co-directeur de thèse
Professeur B Polack Co-directeur de thèse

Thèse préparée au Groupe de Recherche et d’Etude du Processus Inflammatoire - GREPI EA 2938 /
CHU Grenoble et au Laboratoire de Microbiologie Du Froid – LMDF EA 2123 / Evreux
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Composition du Jury

Professeur D. Schneider Président
Professeur B. Guery Rapporteur
Docteur A. Filloux Rapporteur
Professeur D. Haas Examinateur
Professeur J. Guespin-Michel Co-directeur de thèse
Professeur B Polack Co-directeur de thèse

Thèse préparée au Groupe de Recherche et d’Etude du Processus Inflammatoire - GREPI EA 2938 /
CHU Grenoble et au Laboratoire de Microbiologie Du Froid – LMDF EA 2123 / Evreux














à Andrée et Firmin




Je tiens tout d’abord à remercier Madame le professeur Françoise Morel et Madame
le professeur Nicole Orange qui ont accepté de m’accueillir au sein de leur
laboratoire respectif.

Un grand merci au professeur Benoît Polack pour son encadrement, sa patience et
pour l’ensemble du savoir pratique et théorique qu’il m’a transmis. J’espère qu’il
n’aura pas trop souffert de mon flegme légendaire et je n’oublierai pas « qu’à faire et
à refaire on n’est jamais sans rien faire »…

Un grand merci également au professeur Janine Guespin pour sa patience,
l’ensemble du savoir qu’elle m’a transmis et pour m’avoir fait découvrir et apprécier
un nouvel aspect de la microbiologie.

Merci au docteur Annabelle Mérieau pour son encadrement, sa gentillesse, le
partage de ses connaissances et pour m’avoir aidé à rapidement m’intégrer à
l’équipe du LMDF.

Je tiens aussi à remercier Monsieur le professeur Dominique Schneider pour avoir
accepté la présidence de ce jury de thèse.

J’adresse mes remerciements aux professeurs Dieter Haas et Benoît Guery ainsi
qu’au docteur Alain Filloux pour m’avoir fait l’honneur de juger ce travail.

Pour leurs conseils, leur soutien et les moments que nous avons partagés, j’adresse
un grand merci aux membres du GREPI et du LMDF, en particulier à Lauriane,
Danièle, Mariette, Nico, l’équipe Pet’Roll, Gaëlle R et surtout Gaëlle H.

Je remercie l’ensemble du personnel du laboratoire d’enzymologie et d’hématologie
de m’avoir si rapidement intégré au sein de leur équipe.

Enfin et surtout, je voudrais adresser plus qu’un grand merci à mes parents qui ont
toujours été là pour moi et sans qui tout cela n’aurait pas été possible.

Abréviations

ADN Acide désoxyribonucléique
ADP Adénosine diphosphate
ApR Résistance à l’ampicilline
ARN Acide ribonucléique
ATP Adénosine triphosphate
CatR Résistance au chloramphénicol
CbR Résistance à la Carbénicilline
CDO Catéchol Dioxygénase
DMSO Diméthylsulfoxyde
dNTP mélange de nucléotides triphosphates (ATP, GTP, CTP, TTP)
DO Densité Optique
DR Double Recombinant
EGTA Acide éthylène glycol-bis( -aminoéthy éther) N,N,N',N'-tétra-acétique
EHEC Escherichia coli entérohémoragique
EPEC Escherichia coli entéropathogène
GFP Green Fluorescent Protein
GmR Résistance à la Gentamicine
GTP Guanosine triphosphate
HBSm "Hepes Buffer Saline" modifié
Hepes Acide hydroxyéthyl-pipérazine-éthane-sulfonique
IPTG isopropyl-beta-D-thigalactopyranoside
kDa KiloDaltons
KmR Résistance à la kanamycine
LB Milieu Luria Bertani
LDH Lactate Déhydrogénase
MOI Multiplicity of infection
Pb Paires de bases
PBS Tampon phosphate isotonique "Phosphate Buffer Saline"
PCA Acide perchlorique
PCR "Polymérase chain reaction"
PIA Pseudomonas isolation agar

bPNN Polynucléaires neutrophiles
p/v Poids pour volume
qsp Quantité suffisante pour
RLU Unité de luminescence relative
rpm Rotations par minute
SDS Sodium dodécyl sulfate
SDS-PAGE Electrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de SDS
SR Simple Recombinant
SSTT Système de sécrétion de type III
TAE Tampon "Tris-acétate-EDTA"
TBE Tampon "Tris-borate-EDTA"
TCA Acide trichloroacétique
TcR Résistance à la Tétracycline
TE Tampon "Tris-EDTA"
Tris Tris(hydroxylméthyl)aminométhane
U Unité enzymatique
UV Ultraviolets
v/v Volume pour volume
VB Milieu Vogel Bonner
Table des matières
INTRODUCTION ....................................................................................................... 1
I. Pseudomonas aeruginosa ............................................................................... 3
I-A. Caractéristiques........................................................................................ 3
I-B. Un pathogène opportuniste....................................................................... 3
I-C. Les facteurs de virulence de Pseudomonas aeruginosa .......................... 5
II. Le système de sécrétion de type III ............................................................... 12
II-A. Le système de sécrétion de Type III de P. aeruginosa........................... 13
II-B. La régulation du SSTT chez les autres bacilles pathogènes à Gram
négatif................................................................................................................ 27
III. Le Quorum Sensing ................................................................................... 35
III-A. Généralités.......................................................................................... 35
III-B. Le quorum sensing chez P. aeruginosa .............................................. 41
IV. Epigenèse .................................................................................................. 48
IV-A. L’épigenèse chez les bactéries : L’exemple de l’opéron lactose chez E.
coli 49
IV-B. Pré requis pour l’épigénèse et utilité de la modélisation ..................... 51
MATERIELS ET METHODES .................................................................................. 53
I. Plasmides et Souches bactériennes.............................................................. 55
I-A. La souche de référence du laboratoire : CHA......................................... 56
I-B. Culture bactérienne ................................................................................ 57
I-C. Antibiotiques utilisés ............................................................................... 58
I-D. Suivi de croissance et densité bactérienne............................................. 58
I-E. Conservation des souches...................................................................... 58
II. Techniques de biologie moléculaire............................................................... 59
II-A. Purification des acides nucléiques.......................................................... 59
II-B. Préparation d’ADN plasmidique d’E. coli ................................................ 60
II-C. Préparation d’ADN chromosomique de P. aeruginosa ........................... 60
II-D. Préparation d’ARN de P. aeruginosa...................................................... 61
II-E. Electrophorèse d’ADN ............................................................................ 61
II-F. Manipulation des fragments d’ADN ........................................................ 62
II-G. Technique de retard sur gel (Electrophoretic Mobility Shift Assay - EMSA)
64
II-H. Clonage .................................................................................................. 66

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