Signal transduction pathways modulated by the PD-causative gene LRRK2 [Elektronische Ressource] / Iria Carballo-Carbajal

Signal Transduction Pathways Modulated by the PD-causative Gene LRRK2 Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie und der Medizinischen Fakultät der Eberhard-Karls-Universität Tübingen Iria Carballo-Carbajal aus Oviedo, Spanien October 7th, 2009 Tag der mündlichen Prüfung: October 7th, 2009 Dekan der Fakultät für Biologie: Prof. Dr. H. A. Mallot Dekan der Medizinischen Fakultät: Prof. Dr. I. B. Autenrieth 1. Berichterstatter: Prof. Dr. T. Gasser 2. Berichterstatter: Prof. Dr. O. Riess Prüfungskommission: Prof. Dr. T. Gasser Prof. Dr. O. Riess Prof. Dr. M. Jucker Prof. Dr. P. Kahle Prof. Dr. A. Nordheim Erklärungen Ich erkläre hiermit, 1. dass ich bisher keine Promotions- oder entsprechende Prüfungsverfahren abgebrochen oder abgeschlossen habe. 2. dass die vorgelegte Dissertation noch nie ganz oder teilweise als Dissertation oder sonstige Prüfungsarbeit eingereicht worden ist … … und auch nicht ganz oder teilweise veröffentlicht worden ist. … oder bereits teilweise in den angegebenen Zeitschriften veröffentlicht wurde. 3.
Publié le : jeudi 1 janvier 2009
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Signal Transduction Pathways Modulated
by the PD-causative Gene LRRK2






Dissertation


zur Erlangung des Grades eines Doktors
der Naturwissenschaften



der Fakultät für Biologie
und
der Medizinischen Fakultät
der Eberhard-Karls-Universität Tübingen





Iria Carballo-Carbajal
aus Oviedo, Spanien


October 7th, 2009













































































Tag der mündlichen Prüfung: October 7th, 2009

Dekan der Fakultät für Biologie: Prof. Dr. H. A. Mallot
Dekan der Medizinischen Fakultät: Prof. Dr. I. B. Autenrieth

1. Berichterstatter: Prof. Dr. T. Gasser
2. Berichterstatter: Prof. Dr. O. Riess

Prüfungskommission: Prof. Dr. T. Gasser
Prof. Dr. O. Riess
Prof. Dr. M. Jucker
Prof. Dr. P. Kahle
Prof. Dr. A. Nordheim














































Erklärungen


Ich erkläre hiermit,

1. dass ich bisher keine Promotions- oder entsprechende Prüfungsverfahren abgebrochen
oder abgeschlossen habe.

2. dass die vorgelegte Dissertation noch nie ganz oder teilweise als Dissertation oder
sonstige Prüfungsarbeit eingereicht worden ist …
… und auch nicht ganz oder teilweise veröffentlicht worden ist.
… oder bereits teilweise in den angegebenen Zeitschriften veröffentlicht wurde.

3. dass ich die zur Promotion eingereichte Arbeit mit dem Titel: »Signal Transduction
Pathways Modulated by the PD-causative gene LRRK2« selbstständig verfasst, nur die
angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt und wörtlich oder inhaltlich übernommene
Stellen als solche gekennzeichnet habe. Ich versichere an Eides statt, dass diese
Angaben wahr sind und dass ich nichts verschwiegen habe. Mir ist bekannt, dass die
falsche Abgabe einer Versicherung an Eides statt mit Freiheitsstrafe bis zu drei Jahren
oder mit Geldstrafe bestraft wird.

4. dass ich bisher weder strafrechtlich verurteilt, noch Disziplinarmaßnahmen und
anhängigen Straf- und Disziplinarverfahren unterzogen worden bin.



Tübingen, den 5 May 2009

























TABLE OF CONTENTS


1 SUMMARY ________________________________________________ 1

2 INTRODUCTION___________ 3
2.1 DEFINITION OF PD_____________ 3
2.2 ETIOLOGY OF PD ______________________________________________ 5
2.2.1 PARK1, PARK4: α-synuclein (SNCA) ___________________________ 6
2.2.2 PARK2: Parkin (PRKN)______ 8
2.2.3 PARK6: PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1) _________________ 8
2.2.4 PARK7: DJ-1 ______________________________________________ 9
2.2.5 PARK8: Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2)___________________ 10
2.2.6 Other PD-associated genes__ 11
2.3 PATHOGENESIS OF PD_________ 12
2.3.1 Mitochondrial dysfunction/oxidative stress ______________________ 14
2.3.2 Proteotoxic stress _________________________________________ 15
2.3.3 Aberrant kinase activity_____ 17
2.4 PARK8: LEUCINE-RICH REPEAT KINASE 2 (LRRK2) ____________________ 18
2.4.1 Structure of LRRK2________ 18
2.4.2 Expression and localization of LRRK2__________________________ 19
2.4.3 Functional activity of LRRK2 _________________________________ 20
2.4.4 Biological effects of LRRK2__ 23
2.4.5 LRRK2 substrates and interactors_____________________________ 24
2.4.6 Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) _____________________ 26
2.5 SPECIFIC AIMS _______________________________________________ 28
I

3 RESULTS ________________________________________________ 29
3.1 PRIMARY FIBROBLAST CELL CULTURES FROM PD PATIENTS TO STUDY THE EFFECT
OF PD-ASSOCIATED MUTATIONS_______ 29
3.2 IDENTIFICATION OF PUTATIVE PHOSPHORYLATION SITES IN THE KINASE DOMAIN OF
LRRK2 AND GENERATION OF A PHOSPHO-SPECIFIC LRRK2 ANTIBODY __________ 30
3.3 EXPRESSION OF LRRK2 ________________________________________ 33
3.4 LRRK2 SELECTIVELY ACTIVATES THE ERK PATHWAY IN A KINASE-DEPENDENT
MANNER ________________________________________________________ 33
3.5 PD-ASSOCIATED LRRK2 MUTATIONS DELAY ERK ACTIVATION ____________ 35
3.6 PD-LINKED MUTATIONS ALSO DELAY PHOSPHORYLATION OF MEK, UPSTREAM
ACTIVATOR OF ERK________________ 38
3.7 LRRK2 OVER-EXPRESSION STIMULATES SNCA TRANSCRIPTION IN A KINASE
DEPENDENT MANNER _______________________________________________ 40
3.8 ERK ACTIVATION MEDIATES LRRK2-INDUCED TRANSCRIPTIONAL UP-REGULATION
OF SNCA_______________________ 42


4 DISCUSSION _____________________________________________ 45
4.1 FUNCTIONAL LINK BETWEEN THE DOMINANT PD-ASSOCIATED GENES LRRK2 AND
SNCA__________________________ 45
4.2 MAPKS-MEDIATED SIGNALING FROM LRRK2 TO SNCA _________________ 46
4.3 THE POTENTIAL ROLE OF LRRK2 IN NEURITE OUTGROWTH _______________ 48
4.4 CONCLUSION ________________________________________________ 49






II

5 EXPERIMENTAL PROCEDURES _____________________________ 51
5.1 MICROBIOLOGY TECHNIQUES_____________________________________ 51
5.2 DNA TECHNIQUES_____________ 51
5.2.1 Vectors and constructs_____ 51
5.2.2 Sequencing______________ 51
5.2.3 DNA preparation and purification______________________________ 52
5.3 RNA TECHNIQUES_____________________________________________ 52
5.3.1 Preparation of RNA from cell cultures __________________________ 52
5.3.2 Real Time RT-PCR________ 52
5.4 CELL CULTURE_______________ 53
5.4.1 Primary fibroblasts culture ___________________________________ 53
5.5 PROTEIN TECHNIQUES__________ 54
5.5.1 Protein extraction from cell culture ____________________________ 54
5.5.2 Production of antiserum_____ 54
5.5.3 Inhibitors ________________________________________________ 55
5.5.4 Western blotting___________ 55
5.5.5 ELISA assays____________ 55
5.5.6 Inmunoprecipitación________ 56
5.5.7 Multiple sequence alignment _________________________________ 56


6 MATERIALS______________________________________________ 57
6.1 ANTIBODIES_________________ 57
6.2 VECTORS AND CONSTRUCTS_____ 58
6.3 OLIGONUCLEOTIDES AND HYBRIDIZATION PROBES _____________________ 58


III

7 APPENDIX _______________________________________________ 59
7.1 LIST OF FIGURES_____________ 59
7.2 LIST OF TABLES______________ 59
7.3 ABBREVIATIONS 60


8 REFERENCES ____________________________________________ 63
9 LIST OF PUBLICATIONS____ 75


IV

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