Structural transitions and fibril formation of the prion protein in vitro [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Karl-Werner Leffers

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Structural transitions and fibril formation of the prion protein in vitro Inaugural - Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf vorgelegt von Karl-Werner Leffers aus Oldenburg Düsseldorf 2003 Gedruckt mit der Genehmigung der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Referent: Prof. Dr. D. Riesner Koreferent: Prof. Dr. J. H. Hegemann Tag der mündlichen Prüfung: 23.01.2004 „If you want to waste your life doing stuff like this, just go on!” Stanley B. Prusiner, 2000 Danksagung Mein besonderer Dank gilt Prof. Dr. Detlev Riesner, der mir die Durchführung dieser Doktorarbeit ermöglichte. Dabei ist nicht nur die stete kritische Diskussion hervorzuheben, sondern auch die Möglichkeit selbständigen, flexiblen Arbeitens sowohl im eigenen Institut als auch im Austausch mit anderen Forschungsgruppen. In this context I would like to thank Prof. Dr.
Publié le : jeudi 1 janvier 2004
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Structural transitions and fibril formation of the
prion protein in vitro





Inaugural - Dissertation

zur
Erlangung des Doktorgrades der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf





vorgelegt von


Karl-Werner Leffers


aus Oldenburg






Düsseldorf 2003
















































Gedruckt mit der Genehmigung der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf




Referent: Prof. Dr. D. Riesner

Koreferent: Prof. Dr. J. H. Hegemann

Tag der mündlichen Prüfung: 23.01.2004








„If you want to waste your life doing
stuff like this, just go on!”


Stanley B. Prusiner, 2000
























Danksagung


Mein besonderer Dank gilt Prof. Dr. Detlev Riesner, der mir die Durchführung dieser
Doktorarbeit ermöglichte. Dabei ist nicht nur die stete kritische Diskussion
hervorzuheben, sondern auch die Möglichkeit selbständigen, flexiblen Arbeitens
sowohl im eigenen Institut als auch im Austausch mit anderen Forschungsgruppen.

In this context I would like to thank Prof. Dr. Stanley Prusiner from the University of
California at San Francisco who gave me the possibility to carry out important
experiments of my project in his lab. Also I would like to thank Ana Serban and
Guiseppe Legname for the constant supply with protein material and antibodies. A
special thanks goes to everybody in the “lunch-crew” who created a great
atmosphere in the lab, especially Svetlana, Camille, Marcela, Holger, Sam, Gerold
and Patrick.

Ich danke Holger Wille für die geduldige Einführung in die Geheimnisse der
Elektronenmikroskopie, für die gehaltvollen Diskussionen über meine Arbeit, für das
noch geduldigere Ertragen der einen oder anderen Wissenslücke meinerseits und
natürlich für die Einführung in die „lunch-crew“, die erholsamen Campingtrips und
nicht zuletzt den Fernseher!

Frau Gruber danke ich für die Unterstützung in allen organisatorischen Fragen, vor
allem in Bezug auf meine Auslandsaufenthalte.

Der gesamten Prion-Gruppe danke ich für die nette Arbeitsatmosphäre,
insbesondere meinen beiden „Ex-Lehrlingen“ Andreas Schmidt und Jan Stöhr, die
mir mit ihrer täglichen Begrüßung („Tach Chef!“) das Gefühl gaben, dass die
akademische Ausbildung einen respektabel in der Gesellschaft positioniert… also
Jungs, ihr wisst, wofür ihr arbeitet!
Des Weiteren danke ich allen Mitgliedern des Instituts für viele nette Stunden bei der
Arbeit, auf Retreats, bei Betriebsausflügen und bei sonstigen Feiern.

Ich danke meiner Familie für den starken Rückhalt, der unabhängig macht und
komplette Freiheit im Denken und Handeln erlaubt; diese Dinge sind wertvoller als
alles andere.

Sandra, danke für alles vom ersten Tag bis heute!

Ich danke außerdem den Mitgliedern der Hero-Quest Runde für effektive
Freizeitgestaltung sowie Eva & Tom für perfekte Nachbarschaft.

Zuletzt möchte ich mich noch bei allen bedanken, die die Zeit im Institut, in
Düsseldorf und in San Francisco zu dem schönen Erlebnis gemacht haben, dass es
geworden ist.

Eine spezieller Dank natürlich auch an Hobbel und Beavis für, like, you know…















































Table of Contents I

Table of contents I
Abbreviations V

1. Introduction 1
1.1 Neurodegenerative diseases and amyloid deposits – cause or effect? 1
1.2 Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) 5
1.3 Identification of the agent causing TSEs 7
1.4 The prion protein 9
C Sc1.5 PrP vs. PrP 10
1.6 Prion-replication 13
1.6.1 Template assistance model 13
1.6.2 Cooperative Prusiner model 14
1.6.3 Seeded nucleation model 15
1.7 in vitro conversion 16
1.8 Aims of this thesis 19

2. Materials & Methods 21
2.1 Chemicals 21
2.2 Lipids 21
C2.3 Samples of sol PrP 27-30, rec PrP (90-231) and native, full length PrP 21
2.4 Commonly used solutions and buffers 22
2.5 Protein gel electrophoresis (SDS-PAGE) 23
2.6 Dot-blot 24
2.7 Semi-dry-blot 25 II Table of Contents
2.8 Immunologic protein detection 25
2.9 Differential ultra centrifugation 26
2.10 Gel-elution of prion proteins and dialysis 26
2.11 Circular dichroism 27
2.12 Measuring the binding of SDS to PrP using the Methylen Blue binding assay 28
2.13 Modified Hill plot 29
2.14 Proteinase K assays 30
2.15 Electron microscopy 31
2.16 Negative staining and immunolabeling 32
2.17 Bioassays 33

3. Results 35
3.1 SDS induced, structural transitions of PrP 35
3.1.1 Structural transition of rec PrP (90-231) from a predominantly α-helical to a β-
structured state induced by dilution of SDS 36
3.1.2 Structural transitions from native, α-helical PrP in aqueous solution induced by
addition of SDS 38
3.1.3 SDS binding to rec PrP (90-231) at very low concentrations of SDS 41
3.2 Formation of fibrils of PrP and its dependence on solution conditions 43
3.2.1 Solubility analysis of sol PrP 27-30 (before gel-elution) 45
3.2.2 Solubility analysis of elu PrP 27-30 (after gel-elution) 46
3.2.3 Fibril formation of PrP 27-30 before and after gel-elution 47
C 3.2.4 Solubility analysis and fibril formation of native, full length PrP 50
C3.3 Proteinase K resistance of in vitro generated amyloid fibrils of elu PrP 27-30 and PrP 51
C3.4 Bioassays of in vitro generated amyloid fibrils of elu PrP 27-30 and PrP 53

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