Synthèse de triglycérides structurés ou fluorescents pour l' étude du métabolisme lipidique

De
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Sous la direction de Maud Cansell, Sandra Pinet
Thèse soutenue le 04 décembre 2009: Bordeaux 1
L’utilisation de molécules issues d’une synthèse maîtrisée est une approche très intéressante pour les biologistes car elle met à leur disposition des molécules bien caractérisées et d’une grande pureté. Dans un premier temps, nous avons synthétisé des triglycérides structurés. Ce sont des molécules lipidiques dans lesquelles les acides gras d’intérêt sont estérifiés sur le squelette glycérol en position connue. Les acides gras introduits appartiennent à la série oméga 3 (acides linolénique (ALA), eicosapentaènoique (EPA) et docosahexaènoique (DHA). Ils sont estérifiés spécifiquement en position interne ou externes car la biodisponibilité des lipides alimentaires, apportés sous forme de triglycérides, varie en fonction de la position de l’acide gras sur le squelette glycérol. L’utilisation de ces lipides structurés a été validée par des études de biodisponibilité, in vivo, chez le rat, qui ont montré que l’ALA était très bien assimilé quelle que soit sa position sur le glycérol. Dans un deuxième temps, nous avons synthétisé un acide a-linolénique fluorescent, sous forme d’ester méthylique, pour obtenir in fine un TG fluorescent. Celui-ci nous permettra suivre, par imagerie, le devenir de l’ALA dans des cellules en culture, modèles de la barrière intestinale. Les différentes molécules synthétisées sont apparues comme un outil fondamental permettant de mieux connaître le devenir métabolique des triglycérides dans l’organisme.
-Acide gras série oméga 3
-Biodisponibilité
-Triglycérides structurés
-Rmn 1h 13c
-ALA fluorescent
-UV-Visible
-Molécules d’intérêt
-Fluorescence
Biologists are very interested in the use of molecules obtained by a well-controlled synthesis because such molecules are well characterized and of high purity. First, we synthesized pure structured triglycerides in other words lipid molecules in which fatty acids are esterified onto a known position of the glycerol backbone. The introduced polyunsaturated fatty acids belong to the omega 3 series (linolenic (LNA),eicosapentaenoic (EPA) and docosahexaenoic (DHA acids). As the bioavailability of lipids depends upon their position on the glycerol skeleton , we prepared triglycerides esterified with omega 3 fatty acids either qt one of the external positions or at the internal one. The use of these structured lipids was validated byr in vivo studies on rats that showed a good assimilation of LNA whatever its position was. Secondly, we synthesized an ? linolenic acid as methyl ester labeled with a fluorophore To obtain in fine a fluorescent triglyceride. This last one will be use for the spatio-temporal follow-up, in culture cell, of the LNA. The synthesized molecules are a promising tool to better understand the triglycerides’ metabolism in the human being.
-Omega 3 fatty acids
-Structured triglyceride
-Fluorescent LNA
-Relevant molecules
-Bioavailability
-1H and 13CNMR
-UV-Visible
-Fluorescence
Source: http://www.theses.fr/2009BOR13917/document
Publié le : lundi 31 octobre 2011
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THÈSE

PRÉSENTÉE A

L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 1
ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES CHIMIQUES
Par
Emilie VAIQUE

POUR OBTENIR LE GRADE DE

DOCTEUR
SPÉCIALITÉ : Chimie organique



Synthèse de triglycérides structurés ou
fluorescents pour l'étude du métabolisme
lipidique



Soutenue le 4 Décembre 2009


Devant la commission d’examen formée de :

M. BENNETAU Bernard Directeur de recherche, CNRS Bordeaux Président
M. DURAND Thierry Directeur de recherche, CNRS Montpellier Rapporteur
M. SEBEDIO Jean-Louis Directeur de recherche, INRA Clermont-Ferrand Rapporteur
Mme. COMBE Nicole Ingénieur Institut des Corps Gras (ITEG), Pessac Examinateur
Mme. CANSELL Maud Professeur, IPB Directrice de thèse
Mlle. PINET Sandra Maître de Conférences, IPB Co-directrice de thèse
REMERCIEMENTS

Le présent mémoire est l’aboutissement de trois années de Doctorat qui se sont déroulées au
sein de l’Institut des Science Moléculaire (ISM) dans le groupe Nanosystème Analytiques
(NsysA) de l’université Bordeaux I.

Je souhaite donc remercier chaleureusement Monsieur Philippe Garrigues, le Directeur de
l’ISM, ainsi que le Professeur Alexander Kuhn (Directeur du groupe NsysA), pour m’avoir
accueillie au sein du laboratoire où j’ai pu mener à bien cette thèse dans d‘excellentes
conditions.
Je souhaite remercier Sandra Pinet (co-directrice de thèse), maître de conférences, qui m’a
encadré avec compétence, disponibilité et efficacité pendant ces trois années de thèse. Elle a
toujours su m’aiguiller judicieusement tout en me laissant une grande autonomie à la
paillasse. Je la remercie également pour m’avoir donné l’opportunité de faire de
l’enseignement en Chimie Organique au sein de l’Ecole National Supérieure de Chimie et
Physique de Bordeaux. Merci également à Maud Cansell, directrice de thèse pour nos
discussions et son enthousiasme.
Pour avoir accepter de présider cette thèse, j’adresse ma gratitude à Monsieur Bernard
Bennetau, Directeur de recherche CNRS à l’Université de Bordeaux I.
Je tiens également à remercier Monsieur Thierry Durand, Directeur de Recherche CNRS à
Montpellier et Monsieur Jean-Louis Sebedio, directeur de Recherche INRA à Nantes pour
avoir accepté de juger mon travail. Encore merci à l’ensemble des membres du jury pour le
soin avec lequel ils ont examiné ce manuscrit.

Je souhaite maintenant dire un très grand merci à tous les membres permanents du groupe
NsysA et à Noël Pinaud pour toutes les études RMN au CESAMO et Leslie COUEDELO à
l’ITERG pour les tests biologiques chez le rat. Leurs efficacités et leurs disponibilités ont été
exceptionnelles.

Mes pensées se tournent enfin vers tous mes amis étudiant(e)s, thésard(e)s et post docs qui ont
su me soutenir et me supporter pendant mes trois années. Les anciens, Emanuela, Emeline,
Marie-Laurence, Martina, Matthias, Valérie, Veronika, puis tous les contemporains, Aurélien,
Christophe, Frédérique, Matthias, Yémima,…
2

Un grand merci à Olivier, pour avoir toujours été là et pour m'avoir soutenue et encouragée.
Pour finir je voudrais dédier cette thèse à ma Mère sans qui je n’en serai pas arrivé là, elle a
ainsi contribué de façon non négligeable à la réalisation de cette thèse.


3Sommaire

Liste des abréviations.......................................................................................... 5

INTRODUCTION GENERALE ....................................................................... 7

CHAPITRE 1 : RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES

I) Acides gras w-3................................................................................................. 15

II) Quelques données sur le métabolisme des lipides ........................................... 17
II-1) Digestion et absorption intestinale des lipides ............................................................ 17
II-2) Paramètres influençant la biodisponibilité des lipides............................................... 19
II-3) Conversion des acides gras polyinsaturés ................................................................... 20

III) Méthodes de synthèse de triglycérides .......................................................... 22
III-1) Interestérification......................................................................................................... 23
III-1.1) Interestérification par catalyse chimique ........................................................................ 23
III-1.2) Interestérification par catalyse enzymatique .................................................................. 27
III-1.3) Comparaison de l’interestérification par catalyse chimique et par voie enzymatique 33
III-2) Migration d’acyle ........................................................................................................... 35
III-3) Réaction d’estérification................................................................................................. 37
III-3.1) Obtention d’un triglycéride par estérification enzymatique ......................................... 37
III-3.2) Obtention de TG hétérogènes par estérification par catalyse chimique....................... 39
III-3.2.1) Synthèse de triglycérides mixtes de type ABA............................................................... 40
IV.3.2.2) Synthèse de triglycérides mixtes de type AAB ............................................................... 43

CHAPITRE 2 : SYNTHESE DE TRIGLYCERIDES
STRCTURES PURS

I) Synthèse de TG symétriques à partir du glycidol ............................................ 47

II) Synthèse de triglycérides à partir de glycérols protégés sous forme d’acétals 51
II-1) Synthèse de triglycérides symétriques à partir du 1,3-O-benzylidène glycérol............... 52
II-1.1) Acylation du 1,3-O-benzylidène glycérol par l’acide stéarique....................................... 53
II-1.2) Déprotection du glycérol et double estérification one-pot ............................................... 53
II-1.3) Estérification du dioxane par l’acide a-linolénique ......................................................... 58
II-1.4) Influence de l’ALA sur le rendement de la réaction d’estérification à partir du 1,3-O-
benzylidèneglycérol......................................................................................................................... 58
1Sommaire
II-1.4.a) Mise au point des conditions de l’estérification de 5 par l’acide stéarique et l’acide a-
linolénique .................................................................................................................................... 58
II-1.4.b) Identification des isoméres cis et trans des composés 8a et 8b par RMN à deux
dimensions .................................................................................................................................... 61
1II.1.4.c) Etude cinétique de la réaction d’acylation du 1,3-O-benzylidèneglycérol par RMN H 64
II-2) Synthèse de TG structurés symétriques et dissymétriques à partir d’un mélange de
dioxane et de dioxolane............................................................................................................ 67
II-2-1) Synthèse et caractérisation du mélange de 1,3-O-benzylidèneglycérol 5 et de 1,2-O-
benzylidèneglycérol 6...................................................................................................................... 68
II-2-2) Estérification du mélange de dioxane et de dioxolane et application de notre stratégie
pour accéder rapidement à des TG structurés purs .................................................................... 69
II-2-3) Estérification par des acides gras polyinsaturés des composés 5 et 6 en mélange ........ 70
II-2.3a) Estérification des composés 5 et 6 en mélange par des acides gras polyinsaturés n-3 .. 70
II-2.3b) Identification, par RMN, des isoméres cis et trans du composé 14................................. 71
II-2.3c) Cinétique de l’acylation du mélange de 5 et 6 : étude RMN ........................................... 73
II-2-3d) Synthèse de TG estérifiés par des AGPI en position interne ou externe......................... 75

III) Analyse de la structure des triglycérides par la méthode enzymatique......... 80

IV) Conclusion..................................................................................................... 82

CHAPITRE 3 : VERS LA SYNTHESE DE TRIGLYCERIDES
FLUORESCENTS

I) Stratégie générale de synthèse d’un acide a-linolénique fluorescent ............... 87
I-1) Critères de choix du fluorophore....................................................................................... 88
I-2) Choix de la méthode synthèse de la chaîne acyle ............................................................. 91
I-2.1) Chimie basée sur la réaction de Wittig ............................................................................... 92
I-2.2) Synthèse d’AGPI via des alcynes non conjugués ............................................................... 93
I-2.2.a) Utilisation du réactif de Grignard................................................................................... 93
I-2.2.b) Synthèse d’acides gras naturels par réaction entre un alcyne halogéné et un alcyne vrai.
...................................................................................................................................................... 94
I-3) Rétrosynthèse de l’ALA fluorescent................................................................................. 96

II) Synthèse de l’acide a-linolénique couplé à la coumarine................................ 97
II-1) Synthèse du synthon A..................................................................................................... 97
II-1.1) Optimisation et oxydation de la fonction alcool du composé 16 par le réactif de Jones99
II-1.1.a) Optimisation des conditions réactionnelles de l’oxydation à partir de l’hexan-1-ol..... 99
II-1.1.b) Application des conditions optimisées à l’oxydation de l’alcool 15 ............................ 101
II-1.2) Oxydation du composé 15 en composé 16 en utilisant l’IBX ............................................. 102
II-1.3) Oxydation de l’alcool 15 en acide carboxylique 16 via un aldéhyde .................................. 103
II-1.4) Protection de la fonction acide carboxylique....................................................................... 104
II-1.5) Allongement de la chaîne carbonée..................................................................................... 104
2Sommaire
II-1.6) Bromation de 20 : accès au synthon A ................................................................................ 106
II-2) Synthèse des synthons B................................................................................................ 106
II-2.1) Fonctionnalisation du but-3-yn-2-ol par la 4-hydroxycoumarine................................. 106
II-2.2) Fonctionnalisation du but-3-yn-2-ol par un anthracène................................................ 110
II-3) Différents accès à l’ALA fluorenecent .......................................................................... 111
II-3.1) Second allongement de la chaîne carbonée ......................................................................... 111
II-3.1a) Substitution nucléophile par le but-3-yn-2-ol non protégé......................................... 111
II-3.1b) Substitution nucléophile après protection sous forme d’acétate du but-3-yn-2-ol.... 113
II-3.1c) Substitution nucléophile par le synthon A fluorescent............................................... 114
II-3.1.d) Accès au composé 30 par réaction entre le synthon D et l’alcyne 19 ....................... 115
II-3.2) Hydrogénation stéréosélective des alcynes.......................................................................... 117
II-3.3) Hydrolyse simultanée des fonctions esters. ......................................................................... 118
II-3.4) Marquage de l’ALA hydroxylée par la coumarine.............................................................. 119
II-3.5) Changement de la nature du lien entre la chaîne grasse et le fluorophore........................... 120
II-3.5.a) Tentatives pour obtenir une amine propargylique à partir du but-3-yn-2-ol............ 120
II-3.5.b) Obtention d’alcyne substitué par un espaceur carboné............................................. 123

III Conclusion....................................................................................................132

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES ..................135

PARTIE EXPERIMENTALE.......................................................141

ANNEXES.......................................................................................209

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES .....................................219


3Liste des abréviations
4Liste des abréviations
Liste des abréviations

Dans un souci d’allègement du texte et des schémas, diverses abréviations ont été utilisées

Abréviations et symboles

DHA Acide docosahexaénoïque
EPA Acide eicosapentaénoïque
AG Acide gras
AGPI Acide gras polyinsaturé
AH Acide heptanoïque
AHD Acide heptadécanoïque
ALA Acide a-linolénique
AO Acide oléique
DE Degré d’estérification
éq équivalent
l Longueur d’onde d’émission ém
l Longueur d’onde d’excitation ex
nm Nanomètre
ppm Partie par million
u.a. Unité arbitraire
Rdt Rendement
SN Substitution Nucléophile
TG Triglycéride
t.a Température ambiante
Tps Temps


Solvants

AcOEt Acétate d’éthyle
DCM Dichlorométhane
DMF Diméthylformamide
DMSO Diméthylsulfoxide
THF Tétrahydrofurane


Termes des techniques d’analyse

CCM Chromatographie sur couche mince
CPG Chromatographie phase gazeuse
HPLC Chromatographie Liquide Haute Performance
COSY COrrelation SpectroscopY
ESI Electrospray injection
HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Correlation
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation
5Liste des abréviations
HRMS High Resolution Mass Spectroscopy
NOESY Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy
RMN Résonnance Magnétique Nucléaire
SM Spectroscopie de Masse



Composés chimiques

TFA Acide trifluoroacétique
TFAA Anhydride trifluoroacétique
IBX Acide 2-iodobenzoïque
DIAD Azidicarboxylate de diisopropyle
DEAD Azodicarboxylate de diéthyle
BOP Benzotriazol 1 yloxytris(dimethylamino)phosphonium Hexafluorophosphate
PCC Chlorochromate de pyridinium
MsCl Chlorure de mesyle
TsCl Chlorure de tosyle
NBD-Cl 1-chloro-7 nitrobenzofurazane
Ni-P2 Diacétate de nickel
PDC Dichromate de pyridinium
DCC Dicyclohexylcarbodiimide
1,3-DAP 1,3 diaminopropane
EDCI 1-(3-diméthylaminopropyl)-3éthyle carbodiimide
DMAP 4-diméthylaminopyridine
DIBALH Diisobutylaluminium
Fmoc 9-Fluorenylméthyl carbamate
TBAF Fluorure de tétrabutyl ammonium
HMPA Hexaméthylphosphoramide
NBD 7 nitrobenzofurazane
Boc tert-Butyl carbamate
TEA Triéthyle éthyle amine
TBATFA Trifluoroacétate de tetrabutylammonium
TIPS Triispropylsilyle












6Introduction générale









INTRODUCTION GENERALE



7

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