Synthèse et étude physico-chimique de nouveaux tensioactifs utilisables pour la cristallisation 2D sur film lipidique et l’étude des protéines membranaires, Synthesis and physico-chemical study of new surfactants used as tools for the cristallisation 2D on lipidic film and manipulation of membrane proteins

De
Publié par

Sous la direction de Bernard Pucci, Ange Polidori
Thèse soutenue le 19 mai 2010: Avignon
Ce manuscrit décrit la synthèse et l’étude physico-chimique de tensioactifs innovants utilisés comme outils biochimiques pour le maintien et la cristallisation de protéines membranaires en solution aqueuse. Un premier chapitre présente les moyens techniques actuels à disposition pour la manipulation et l’étude des protéines membranaires ainsi que les problèmes rencontrés concernant leur inactivation et les alternatives actuelles. Une seconde partie décrit la synthèse d’un lipide hémifluoré possédant un ligand métallique spécifique, qui a été utilisé pour la formation d’un film de Langmuir. Les propriétés du film lipidique (stabilité et fluidité) ont été étudiées et des essais de cristallisation 2D suivant le concept interfacial ont été réalisés sur une protéine recombinante SUR1 « his tag » solubilisée dans des micelles de détergents hydrocarbonés. Le troisième chapitre aborde la notion d’amphiphilie faciale et décrit la synthèse de tensioactifs glucosidiques par « click chemistry » basés sur corps aromatique central. La persubsitution sélective de têtes hydrophiles sur les positions 1,3,5 et de parties hydrophobes sur les positions 2,4,6 apporte une amphiphilie aux molécules via une ségrégation faciale. Enfin, le dernier chapitre est dédié à l’étude du comportement et des propriétés physico-chimiques des tripodes amphiphiles faciaux en solution aqueuse grâce à différentes techniques : tensiométrie, diffusion de la lumière, CPLH,...
-Protéine membranaire
-Tensioactif hémifluoré
-Amphiphile facial
-Click chemistry
-Cristallisation 2D
-Tensiométrie
-Aromatique persubstitué
This thesis deals with the synthesis and the physico-chemical study of new surfactants used as tools for holding membrane proteins in aqueous media. A first part presents the existing methods that allow the manipulation of the membrane proteins and describes the current issues encountered which lead to its denaturation. In a second chapter, the synthesis of a hemifluorinated lipid with a specific ligand is presented in order to form a film of Langmuir. The stability and fluidity of the monolayer lipid is monitored and used in experiments of cristallisation 2D following the interfacial concept on the recombinant membrane protein SUR1 « his tag » keep soluble in water with hydrocarbonated detergents. The third part defines the term associated to facial amphiphile and presents a synthesis by « click chemistry » of glucosidic surfactants with an aromatic core persubstitued. The alternated and selective substitution on 1,3,5 and 2,4,6 positions of the aromatic ring by respectively hydrophilic heads and hydrophobic tails induces a facial segregation. The last chapter concerns the study of facial amphiphiles behavior and its physico-chemical properties in aqueous solution by using several methods : tensiometry, dynamic diffusion light scattering, HPLC,...
-Membrane protein
-Hemifluorinated surfactant
-Facial amphiphile
-Click chemistry
-Crystallisation 2D
-Tensiometry
-Aromatic persubstitued
Source: http://www.theses.fr/2010AVIG0233/document
Publié le : jeudi 27 octobre 2011
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Académie d’Aix-Marseille
Université d’Avignon et des Pays de Vaucluse



THESE

présentée à l’Université d’Avignon et des Pays du Vaucluse
pour obtenir le diplôme de DOCTORAT



SPECIALITE : CHIMIE ORGANIQUE

Ecole Doctorale 250 « Sciences chimiques »
Laboratoire de Chimie Bio-Organique et des Systèmes Moléculaires Vectoriels (EA 932)


Synthèse et étude physico-chimique de nouveaux tensioactifs
utilisables pour la cristallisation 2D sur film lipidique et l’étude
des protéines membranaires.

par

DAUVERGNE Julien


soutenue le 19 mai 2010 devant le jury composé de :



Chantal LARPENT Professeur, Université de Versailles, ECHO Rapporteur

Jean MARTINEZ Directeur de recherche CNRS, Université Rapporteur
de Montpellier 2, IBMM

Françoise BONNETE Chargée de recherche CNRS, CINAM Examinateur
Université de la Méditérrannée

Jean-Jacques BENATTAR Ingénieur CEA Saclay,DSM-DRECAM Examinateur

Ange POLIDORI Professeur, Université d’Avignon Co-Directeur de Thèse
et des Pays du Vaucluse

Bernard PUCCI Professeur, Université d’Avignon Directeur de Thèse
et des Pays du Vaucluse
tel-00496704, version 1 - 1 Jul 2010












































A mes parents,

à Olivia d’être à mes côtés, pour son amour et son
soutien de tous les jours,

tel-00496704, version 1 - 1 Jul 2010
REMERCIEMENTS



Ce travail a été réalisé au laboratoire de Chimie Bio-Organique et des Systèmes
moléculaires vectoriels de l’Université d’Avignon et des Pays de Vaucluse dirigé par le
Professeur Bernard PUCCI.

Tout d’abord, je tiens à remercier très sincèrement les membres du jury :
Madame Chantal LARPENT, Professeur à l’université de Versailles, Monsieur Jean
MARTINEZ, Directeur de recherche CNRS de l’IBMM à l’université de Montpellier 2,
Françoise BONNETE, Chargée de recherche au CINAM-CNRS à l’université de la
Méditérrannée, Jean-Jacques Benattar, ingénieur au CEA Saclay de m’avoir fait l’honneur de
juger mon travail.

Je tiens à exprimer ma plus profonde gratitude à Monsieur le professeur Bernard
PUCCI de m’avoir donné l’opportunité de faire cette thèse dans son laboratoire et d’y avoir
acquis une formation pluridisciplinaire solide sur ce sujet passionnant dédié à l’étude des
protéines membranaires. Je le remercie également de m’avoir fait partager sa longue
expérience dans ce domaine et son savoir scientifique. Je lui suis reconnaissant aussi pour sa
disponibilité et ses précieux conseils durant mes trois années de thèse.

Je tiens à remercier Monsieur le professeur Ange POLIDORI de m’avoir encadré
durant ces trois années de thèse. Je le remercie particulièrement pour toute l’étendue de son
savoir qu’il a su me transmettre durant cette période ainsi que d’avoir initié un nouveau projet
durant ma thèse. Je lui suis reconnaissant de son soutien et de sa présence dans les moments
difficiles. Je le remercie également pour son investissement et ses précieux conseils lors de la
rédaction de ce manuscrit.

Je souhaite également remercier Catherine Vénien-Bryan du laboratoire de
Biophysique Moléculaire à l’Université d’Oxford pour sa collaboration et l’intérêt qu’elle a
porté à ce travail pour les essais de cristallisation 2D et les analyses par microscopie
éléctronique.


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Je tiens à remercier également :
Madame Christine CONTINO-PEPIN, pour sa gentillesse et son attention touchante
qu’elle m’a faite lorsque je me suis blessé au doigt durant ma première année.
Monsieur Grégory DURAND, pour son écoute et ses encouragements dans les
moments difficiles mais surtout pour sa bonne humeur et les discussions agréables que j’ai pu
partager avec lui.
Madame Anne-Sylvie FABIANO-TIXIER, pour son aide et ses conseils sur les
appareils de la salle analytique, sa gentillesse, sans oublier évidemment ses bons gâteaux.
Monsieur Frédéric LEGRAND, un post-doctorant de passage devenu un pote, pour
son amitié, sa sympathie et ses encouragements, sans qui ce manuscrit n’existerait peut être
pas.
Mademoiselle Audrey PARAT, une voisine de paillasse agréable et délirante, pour sa
joie de vivre, ses conseils et son amitié.
Monsieur Simon RAYNAL, un technicien fort sympathique (quoiqu’un peu raleur!),
pour son ouverture d’esprit et les matchs de tennis joués ensemble.
Monsieur Shivaji SHARMA, un grand homme très attachant, pour sa gentillesse et sa
disponibilité mais aussi pour m’avoir fait progresser mon anglais.
Madame Carole MATHE et Monsieur Guillaume CUOCO, les chimistes de l’équipe
de l’art, pour leur sympathie et leur gentillesse.
Fanny CHOTEAU et Cindy PATINOTE, les pipelettes du labo, pour les moments
sympas partagés avec elles.
Enfin, je remercie l’ensemble du personnel du LCBOSMV (anciens et présents) et
toutes les personnes que j’ai pu oublier pour les bons moments passés avec eux.
Bien sur, je n’oublie pas ma famille, mon frère et mes parents, de leur soutien mais
aussi Olivia d’être toujours là et de m’avoir supporté!








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ABREVATIONS UTILISEES



PGCR : Protéine G Couplé à un Récepteur
CMC : Concentration Micellaire Critique
PEG : PolyEthylène Glycol
CCS : Concentration Critique de Solubilisation
SDS : Sodium DodécylSulfate
OG : OctylGlucoside
DDM : DoDécylMaltoside
RMN : Résonnance Magnétique Nucléaire
THAM : TrisHydroxyméthyl AminoMéthane
CHAPS : 3-[(3-CHolAmidopropyl)dimethylammonio]-1-PropaneSulfonate
CHAPSO : 3-[(3-CHolAmidopropyl)dimethylammonio]-2-hydrOxy-1-PropaneSulfonate
MET : Microscopie Electronique à Transmission
Cryo-MET : CryoMicroscopie Electronique à Transmission
DNP : 2,4-DiNitroPhényle
PE : PhosphatidylEthanolamine
PC : PhosphatidylCholine
ARN : Acide RiboNucléique
ADN : Acide DésoxyriboNucléique
ATP : Adénosine TriPhosphate
IMAC : Chromatographie d’Immobilisation par Affinité Métallique
NTA : acide NitriloTriAcétique
EDTA : acide Ethylène Diamine Tétra Acétique
THF : TétraHydroFurane
TBAI : Tetra-n-ButylAmmonium Iodide
CDI : CarboDiImidazole
Glu : acide Glutamique
Lys : Lysine
Z ou Cbz : Carbobenzyloxy
Ts : Tosyl
TEA : TriEthylAmine
TBAB : Tetra-n-ButylAmmonium Bromide
TA : Température Ambiante
AIBN : 2,2’-AzodIisoButyroNitrile
AIVN : 2,2’-Azobis-(2,4-dIméthyl)-ValéroNitrile
Nu : Nucléophile
DMF : DiMéthylFormamide
CCM : Chromatographie sur Couche Mince
DCC : N,N'-DicyClohexyl-Carbodiimide
HOBt : 1-HydrOxy-Benzotriazole
DIEA : N,N-DiIsopropylEthylAmine
Boc : tert-Butyloxycarbonyl
Bn : Benzyl
TFA : acide TriFluoroAcétique
DABCO : 1,4-DiAzaBiCyclo[2,2,2]Octane
DBU : 1,8-DiazaBicyclo-[5.4.0]-Undéc-7-ène
DMAP : N,N-DiMéthylAminoPyridine
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ppm : partie par million
TRIS : Tris(hydroxyméthyl)aminométhane
COSY : COrrelated SpectroscopY
DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
DMSO : DiMéthylSulfOxide
HMQC : Heteronuclear Multiple Quantum Coherence
ESI : Ionisation par ElectroSpray
HRMS : Spectrométrie de Masse Haute Résolution
AAS : Spéctoscopie d’Absorption Atomique
SUR : Sulphonylurea Receptor
TCEP : TriChloroEthanol-1-Phosphate
DOPC : DiOleoyl-sn-glycero-3-PhosphoCholine
HEB : HexaEthylBenzène
SE : Substitution Electrophile Aromatique Ar
SN : Substitution Nucléophile de type 2 2
SN : Substitution Nucléophile Aromatique Ar
AL : Acide de Lewis
APTS : Acide Para-ToluèneSulfonique
NMP : N-Méthyl-2-Pyrrolidinone
HMPT : HexaMéthylPhosphoramide
DMI : 1,3-DiMéthyl-2-Imidazolidinone
HMPA : HéxaMéthylPhosphorotriAmine
Tf : Triflate
Ac : Acétyl
dppe : 1,2- bis-(diphénylphosphino)-éthane
dppp : 1,3-bis-(diphénylphosphino)-propane
dppf : 1,1’-bis-(dipheny1phosphino)-ferrocène
TBDMS : tert-ButylDiMéthylSilyl
TMS : TriMéthylSilyl
MM : Masse Molaire
R : Rapport frontal f
T : Tempéreture d’ébullition éb
P : Point de fusion f
DEAD : DiEthyl AzoDicarboxylate
Ms : Mésyl
EEDQ : N-(Ethoxycarbonyl)-2-Ethoxy- 1,2-DihydroQuinoline
Tr : Trityl
CuAAC : Cycloaddition 1,3-dipolaire entre un Azoture et un Alcyne catalysée par Cu(I)
DLS : Dynamic Light Scattering
CLHP : Chromatographie Liquide Haute Performance
CAC : Concentration d’Agrégation Critique
UV : Ultra-Violet
SANS : Small Angle Neutron Scattering
SAXS : Small Angle X-ray Scattering
HTAC : Télomère du THAM à chaîne carbonée
HFTAC : Télomère du THAM à chaîne fluorée
Lac : Lactobionamide
Malt : Maltoside


tel-00496704, version 1 - 1 Jul 2010
SOMMAIRE

Chapitre 1 : Introduction Générale..................................................................... 1

I. Introduction......................................................................................................................... 2
II. La membrane cellulaire ..................................................................................................... 3
A. Les lipides...................................................................................................................... 4
B. Les protéines membranaires .......................................................................................... 6
III. Les détergents membranaires ........................................................................................... 9
A. Généralités..................................................................................................................... 9
B. Différentes classes de tensioactifs ............................................................................... 12
IV. Extraction et manipulation in vitro des protéines membranaires................................... 14
A. Interactions détergent-lipide........................................................................................ 14
B. Interactions détergent-protéine .................................................................................... 16
C. Inactivation des protéines membranaires par les détergents ....................................... 17
D. Maintien des protéines membranaires en solution aqueuse ........................................ 18
1. Retrait et échange des détergents ............................................................................. 19
2. Reconstitution d’un modèle membranaire autour de la protéine ............................. 19
V. Nouvelles alternatives aux détergents usuels .................................................................. 21
VI. Cristallisation des protéines membranaires.................................................................... 28
VII. Cristallisation 2D de protéines isolées dans des micelles de détergent ........................ 30
VIII. Objectif de la thèse ...................................................................................................... 32

Chapitre 2 : Synthèse d’un lipide hémifluoré et étude de cristallisation 2D de
la protéine membranaire SUR1 sur un film lipidique ......................................34

I. La Cristallisation 2D sur un film lipidique fonctionnalisé................................................ 35
A. Principe et vue d’ensemble de la technique pour les protéines solubles..................... 35
B. Différentes approches utilisées pour concentrer et orienter les protéines à la surface du
film lipidique.................................................................................................................... 37
1. Adsorption électrostatique........................................................................................ 37
2. Interactions spécifiques ligand-protéine................................................................... 38
3. Interactions d’un ligand métallique avec une séquence polyhistidine ..................... 39
C. Lipides NTA existants utilisés pour la cristallisation 2D sur film lipidique ............... 41
D. Cristallisation 2D des protéines membranaires sur film lipidique .............................. 45
1. Limitations expérimentales de la technique de cristallisation 2D des protéines
membranaires solubilisées en détergent....................................................................... 45
2. Reconstitution des protéines dans une bicouche lipidique....................................... 49
3. Travaux et résultats antérieurs sur la cristallisation 2D des protéines membranaires
sur film lipidique .......................................................................................................... 49
II. Objectif du travail............................................................................................................ 50
III. Synthèse du lipide hémifluoré........................................................................................ 53
A. Analyse rétrosynthétique............................................................................................. 53
B. Préparation du synthon A ............................................................................................ 55
C. Préparation du synthon B ............................................................................................ 57
D. Condensation des synthons A et B.............................................................................. 67
2+E. Caractérisation du lipide hémifluoré PhHFNTA-Ni ................................................. 70
2+IV. Etude de cristallisation 2D sur un film de PhHFNTA-Ni ........................................... 73
V. Conclusion....................................................................................................................... 82
tel-00496704, version 1 - 1 Jul 2010b
a

Chapitre 3 : Synthèse d’une nouvelle classe de tripodes amphiphiles faciaux84

I. Introduction....................................................................................................................... 85
A. Les premières générations d’amphiphiles « linéaires »............................................... 85
B. Les amphiphiles faciaux .............................................................................................. 87
1. Les amphiphiles faciaux dérivés de l’acide cholique............................................... 88
2. Les amphiphiles faciaux non stéroïdiens ................................................................. 90
3. Les amphiphiles faciaux en forme de pince ............................................................. 91
4. Les architectures portant plusieurs motifs d’amphiphiles faciaux ........................... 92
5. Les dendrimères possédant une amphiphilie faciale ................................................ 94
6. Les amphiphiles faciaux basés sur des molécules hôtes utilisées en chimie
supramoléculaire .......................................................................................................... 95
II. Objectif du travail............................................................................................................ 96
III. Synthèse des tripodes amphiphiles faciaux.................................................................... 99
A. Stratégie de synthèse basée sur le phloroglucinol....................................................... 99
1. Alkylation du phloroglucinol ................................................................................. 101
2. Alkylation de Friedel-Crafts................................................................................... 103
3. Addition conjuguée sur un composé carbonylé , -insaturé................................. 104
4. Réaction de diméthylaminométhylation................................................................ 111
5. Réaction de halométhylation.................................................................................. 114
6. Réarrangement de dérivés du phloroglucinol......................................................... 119
a. Réarrangement de Fries...................................................................................... 119
b. Réarrangement de Claisen.................................................................................. 122
7. Réaction de dérivés organométalliques du phloroglucinol .................................... 125
B. Stratégie de synthèse basée sur des précurseurs aromatiques polyhalogénés ........... 129
1. Réaction de substitution nucléophile aromatique................................................... 130
2. Couplage de Sonogashira sur des dérivés aromatiques polyhalogénés.................. 134
C. Stratégie de synthèse basée sur le mésitylène ........................................................... 142
1. Préparation du précurseur clé et introduction des chaînes alkyles hydrophobes par
SN ............................................................................................................................ 142 Ar
2. Introduction des têtes polaires et création de la ségrégation faciale sur le noyau
aromatique.................................................................................................................. 147
a. Essais de fonctionnalisation à partir du triol 36 ................................................. 147
b. L’intérêt inattendu d’une simple réaction de mésylation ................................... 150
c. Préparation des dérivés tripodes faciaux de type tricarboxylate ........................ 152
d. Préparation de tripodes amphiphiles faciaux dérivés de résidus TRIS .............. 157
e. Synthèse des composés tripodes amphiphiles faciaux à têtes glycosylés .......... 160
i) Réaction de « click chemistry »...................................................................... 160
ii) Préparation du premier tripode amphiphile facial constitué de trois résidus
glucosidiques...................................................................................................... 164
iii) Préparation des glycodendrimères amphiphiles faciaux .............................. 167
iv) Deuxième série de tripodes amphiphiles faciaux ......................................... 176
IV. Conclusion ................................................................................................................... 177

Chapitre 4 : Etude physico-chimique du comportement en solution aqueuse
des tripodes amphiphiles faciaux.....................................................................183

I. Etude préliminaire de solubilisation des tripodes amphiphiles faciaux.......................... 184
II. Propriétés physico-chimiques........................................................................................ 185
A. Notion de surface et définition de la tension superficielle ........................................ 185
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B. Adsorption d’un tensioactif à la surface d’un liquide................................................ 187
C. Phénomène de micellisation ...................................................................................... 189
1. Définition ............................................................................................................... 189
2. Les facteurs influençant la CMC............................................................................ 190
D. Détermination de la CMC des tensioactifs................................................................ 191
1. Méthodes existantes ............................................................................................... 191
2. Principe de la méthode de Wilhelmy ..................................................................... 192
3. Procédure des mesures de tension superficielle des tripodes amphiphiles faciaux 194
4. Interprétations des résultats.................................................................................... 195
III. Mesures du coefficient de partition Log k’W .............................................................. 203
A. Définition................................................................................................................... 203
B. Principe de la méthode de détermination par HPLC ................................................. 204
C. Procédure et interprétation des résultats.................................................................... 204
IV. Mesures de la taille des auto-assemblages en solution aqueuse .................................. 208
A. Principe de la technique ............................................................................................ 208
B. Fluctuations de l’intensité diffusée et diffusion quasi-élastique de la lumière (DQEL)
........................................................................................................................................ 209
1. Macromolécules monodispersées sans interactions en solution ............................ 210
2. Macromolécules polydispersées sans interactions en solution .............................. 211
3. Macromolécules polydispersées avec interactions en solution.............................. 212
C. Procédure et interprétation des résultats.................................................................... 214
V. Essais de préparation de liposomes............................................................................... 220
VI. Conclusion ................................................................................................................... 224

Partie expérimentale.........................................................................................227

Annexes.............................................................................................................299


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Chapitre 1 : Introduction Générale


























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