The GlnR-dependent nitrogen regulatory network of Mycobacterium smegmatis [Elektronische Ressource] / Nadja Jeßberger. Betreuer: Andreas Burkovski

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The GlnR-dependent nitrogen regulatory network of Mycobacterium smegmatis Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Nadja Jeßberger aus Werneck Das GlnR-abhängige Netzwerk zur Stickstoffregulation in Mycobacterium smegmatis Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Nadja Jeßberger aus Werneck Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 28.07.2011 Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Rainer Fink Erstberichterstatter: Prof. Dr. Andreas Burkovski Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Yves Muller Danksagung Die vorliegende Arbeit wurde am Lehrstuhl für Mikrobiologie der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg durchgeführt. Mein besonderer Dank gilt Herrn Professor Andreas Burkovski für die Bereitstellung des interessanten Arbeitsthemas und die kompetente Betreuung. Weiterhin bedanke ich mich bei der Universität Bayern e.V. für die Finanzierung der Arbeit.
Publié le : samedi 1 janvier 2011
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The GlnR-dependent
nitrogen regulatory network
of
Mycobacterium smegmatis









Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.








vorgelegt von
Nadja Jeßberger

aus Werneck

Das GlnR-abhängige
Netzwerk zur Stickstoffregulation
in
Mycobacterium smegmatis









Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.








vorgelegt von
Nadja Jeßberger

aus Werneck







Als Dissertation genehmigt
von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Universität Erlangen-Nürnberg




















Tag der mündlichen Prüfung: 28.07.2011

Vorsitzender der
Promotionskommission: Prof. Dr. Rainer Fink

Erstberichterstatter: Prof. Dr. Andreas Burkovski

Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Yves Muller




Danksagung
Die vorliegende Arbeit wurde am Lehrstuhl für Mikrobiologie der Friedrich-Alexander
Universität Erlangen-Nürnberg durchgeführt.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Professor Andreas Burkovski für die Bereitstellung des
interessanten Arbeitsthemas und die kompetente Betreuung. Weiterhin bedanke ich mich bei
der Universität Bayern e.V. für die Finanzierung der Arbeit.
Herrn Professor Yves Muller möchte ich für die freundliche Übernahme des Zweitgutachtens
danken.
Ein ganz herzlicher Dank gilt Frau Doktor Sophia Sonnewald und vor allem Stephen Reid
vom Lehrstuhl für Biochemie für die Durchführung der microarray Experimente. Ich möchte
mich auch besonders bei Amon für die vielen Ratschläge und Diskussionen bedanken.
Ein riesengroßens Dankeschön geht natürlich an die Mädels aus dem Labor: Kristin, die wir
alle sehr vermissen, Lisl, die kleine Eva und Naddel für eine unglaublich tolle 4-∞
Arbeitsatmosphäre und das gemeinsame Erledigen von jeder Menge „Unikram“. Eva, ein
ganz besonderer Dank für deine Tapferkeit und dein Durchhalten beim Thema
Sensorhistidinkinasen.
Meinen Eltern danke ich für die große Unterstützung während des Biologiestudiums und der
gesamten Doktorandenzeit.
Mein größter Dank gilt Mikko, der vor allem in der letzten Zeit sämtliche Anfälle von mir
ertragen musste und sich dann auch noch durch die gesamte Arbeit gequält hat. Paljon
kiitoksia!!! Content

Content

1 Zusammenfassung/Summary ............................................................................... 1
2 Introduction ............................................ 3
2.1 The genus Mycobacterium ........................... 3
2.1.1 Taxonomy and characteristics .............................................................................. 3
2.1.2 Mycobacterium smegmatis ................... 6
2.2 Nitrogen metabolism and regulation ............ 8
2.2.1 Uptake and assimilation of nitrogen sources ......................................................... 8
2.2.2 Nitrogen control in Escherichia coli ....................................... 9
2.2.3 Nitrogen control in actinomycetes ........................................11
2.3 Aims of this study .......................................16
3 Materials and methods ........................ 17
3.1 Bacterial strains and plasmids ....................................................................................17
3.2 Cultivation of bacteria .................................21
3.2.1 Culture media for E. coli, C. glutamicum and M. smegmatis 21
3.2.2 Antibiotics ............................................................................22
3.2.3 Growth conditions ................................23
3.3 Procedures in molecular biology .................................................24
3.3.1 Procedures to work with DNA ..............................................24
3.3.1.1 Isolation of plasmid DNA from E. coli ............................24
3.3.1.2 Isolation of plasmid DNA from M. smegmatis ................................................24
3.3.1.3 Gel electrophoresis and extraction of DNA from agarose gels ......................24
3.3.1.4 Preparation of chromosomal DNA from M. smegmatis ..................................25
3.3.1.5 Polymerase chain reaction (PCR) .................................26
3.3.1.6 Two-step PCR ...............................................................27
3.3.1.7 Purification and enrichment of DNA ..............................27
3.3.1.8 Restriction of DNA.........................................................27
3.3.1.9 Ligation of DNA fragments ............................................28
3.3.1.10 Sequencing of DNA .....................28
3.3.1.11 Gel retardation and competition assays ......................................................29
3.3.1.12 Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) ................31
3.3.1.13 Southern blot analysis .................................................32
3.3.2 Procedures to work with RNA ..............................................34
3.3.2.1 Isolation of total RNA from M. smegmatis .....................34
3.3.2.2 RNA gel electrophoresis ...............................................35
3.3.2.3 Synthesis of digoxigenin-labeled RNA probes ................................35
3.3.2.4 RNA hybridization analysis (Dot blot) ............................36
3.3.2.5 Quantitative real time RT PCR ......................................37
3.3.2.6 cDNA microarrays .........................................................39 Content

3.3.3 Procedures to work with proteins .........................................................................39
3.3.3.1 Preparation of total cell extract ......39
3.3.3.2 Protein purification via affinity chromatography .............40
3.3.3.3 Quantification and enrichment of proteins .....................................................41
3.3.3.4 SDS polyacrylamide gel electrophoresis .......................42
3.3.3.5 Native polyacrylamide gel electrophoresis ....................43
3.3.3.6 Staining with Coomassie Brilliant Blue ..........................................................44
3.3.3.7 Western blot analysis ....................................................44
3.3.3.8 Pull down assays 45
3.3.3.9 Radioactive phosphorylation of proteins ........................................................46
3.4 Genetic manipulation of bacteria.................................................47
3.4.1 Preparation of competent E. coli cells ..................................47
3.4.2 Transformation of competent E. coli cells .............................................................47
3.4.3 Preparation of competent E. coli Rosetta2 cells and TSS transformation .............48
3.4.4 Preparation of electrocompetent M. smegmatis cells ...........................................48
3.4.5 Transformation of electrocompetent M. smegmatis cells ......49
3.4.6 Generation of genomic insertion and deletion mutants of M. smegmatis ..............49
3.4.7 Fluorescence measurements ...............................................................................50
3.4.8 Fluorescence microscopy ....................50
3.4.9 β-galactosidase assays ........................51
3.4.10 Determination of urease activity .........................................................................52
4 Results .................................................................................. 53
4.1 General analyses of nitrogen metabolism and control in M. smegmatis ......................53
4.1.1 Utilization of different nitrogen sources ................................................................53
4.1.2 Relation between growth behavior and initiation of nitrogen response .................61
4.1.3 Uptake and assimilation of urea ...........64
4.1.4 Generation of an in vivo reporter system for nitrogen response ...........................65
4.1.5 Purification of GlnR ..............................................................................................68
4.1.6 Generation of a GlnR-specific antibody ................................71
4.1.7 DNA binding ability of purified GlnR .....72
4.2 Characterization of the GlnR regulon ..........................................73
4.2.1 Global approach using DNA microarray analyses ................................................73
4.2.2 Verification of the microarray data ........83
4.2.3 Binding of GlnR to promoter sequences of its target genes ..................................89
4.2.4 Determination of binding properties of GlnR ........................................................91
4.2.5 Autoregulation of GlnR .........................................................96
4.3 Activation of GlnR .......................................................................97
4.3.1 Search for GlnR interaction partner ......98
4.3.1.1 Global pull down analysis ..............98
4.3.1.2 Analyses of deletion and insertion mutants ...................................................99 Content

4.3.1.3 Correlation between phosphate and nitrogen metabolism ........................... 104
4.3.1.4 Analyses of protein-protein interactions and phosphorylation of GlnR ......... 105
4.3.2 Investigation of phosphorylation residues .......................................................... 112
4.4 Nitrate and nitrite metabolism in M. smegmatis ......................... 118
4.5 Investigation of a conserved mode of action of GlnR in mycobacteria ...................... 124
5 Discussion ......................................................................................................... 128
5.1 GlnR as the global regulator of nitrogen metabolism in M. smegmatis ...................... 128
5.1.1 GlnR-dependent utilization of different nitrogen sources .... 128
5.1.2 Characterization of the GlnR regulon ................................................................. 131
5.2 GlnR as OmpR-type transcriptional regulator............................ 138
5.3 Activation of nitrogen response ................................................................................. 142
5.4 Ammonium assimilation in M. smegmatis ................................................................. 146
5.5 Nitrate and nitrite metabolism in M. smegmatis ......................... 149
5.6 Role of AmtR in M. smegmatis.................................................................................. 152
5.7 Nitrogen response in M. smegmatis as a possible model for M. tuberculosis ............ 154
6 References ......................................... 157
7 Appendix ............................................................................ 173
7.1 Plasmid constructions ............................... 173
7.2 Complete data obtained from DNA microarray analyses ......... 1800
7.3 Putative sensor histidine kinases activating GlnR ..................................................... 193
7.4 Abbreviations and units ............................................................ 195
7.5 Publications .............................................. 199 Zusammenfassung 1

1 Zusammenfassung
Mycobacterium smegmatis ist ein saprophytisch lebender und schnell wachsender Vertreter
der Gattung Mycobacterium und wird oft als Modellorganismus für verwandte pathogene
Spezies wie Mycobacterium tuberculosis verwendet. Zentrales Thema dieser Arbeit war der
Stickstoffmetabolismus in M. smegmatis, insbesondere die Antwort auf Stickstoffmangel auf
transkriptioneller Ebene, wobei der Regulator GlnR im Mittelpunkt der Betrachtungen stand.
Es wurde gezeigt, dass das Bakterium verschiedenste Substrate (Aminosäuren, Basen und
anorganische Stickstoffverbindungen) als Stickstoffquellen nutzen kann. Analysen eines
glnR Deletionsstammes verdeutlichten, dass GlnR maßgeblich an der Verwertung einiger
dieser Substrate beteiligt ist. Darüber hinaus wurden durch Transkriptomanalysen 125 neue
putative GlnR-Zielgene identifiziert. In darauffolgenden Experimenten wurde für 32 dieser
Gene eine GlnR-abhängige Steigerung der Transkriptmenge bestätigt, darunter Gene, die an
der Aufnahme sowie Assimilation von Aminosäuren, Peptiden und anorganischen
Stickstoffverbindungen beteiligt sind. Dies verdeutlicht die Rolle von GlnR als globalen
Stickstoffregulator in M. smegmatis. Weiterhin standen auch Gene, die nicht dem
Stickstoffmetabolismus angehören, unter GlnR-Kontrolle, was auf eine umfassendere
Funktion des Regulators hindeutet. Außerdem wurde eine untergeordnete Rolle von AmtR in
der Regulation einiger stickstoffrelevanter Gene beobachtet.
Zusätzlich wurden verschiedene Methoden zur Reinigung von GlnR etabliert und in vitro
Untersuchungen zum DNA-Bindeverhalten des gereinigten Proteins durchgeführt, wobei eine
direkte Bindung an Promotorfragmente der Hälfte aller identifizierten Zielgene beobachtet
wurde. Dies führte zu dem Schluss, dass auch indirekte GlnR-Kontrolle über weitere
Transkriptionsregulatoren oder bisher unbekannte Mechanismen eine Rolle für die
Expression einiger Gene spielt. Außerdem wurden in der Promotorregion von amtB
wenigstens drei GlnR-Bindestellen ausgemacht, was das Modell der „galoppierenden“ DNA-
Bindung von OmpR aus E. coli unterstützt. Als ein Vertreter der OmpR-Familie von
Transkriptionsregulatoren soll GlnR durch eine zugehörige Sensorhistidinkinase
phosphoryliert werden. Obwohl diese im Rahmen dieser Arbeit nicht ermittelt werden konnte,
wurden hochkonservierte Aspartatreste als Phosphorylierungsstellen von GlnR identifiziert.
Erste Experimente mit M. smegmatis und M. tuberculosis GlnR deuteten trotz der
identischen C-terminalen DNA-Bindedomänen und N-terminalen Phosphorylierungsdomänen
der beiden Proteine auf klare Unterschiede in der DNA-Bindung und der Aktivierung der
Stickstoffantwort hin. Dennoch kann das in dieser Arbeit entwickelte Modell der
Stickstoffkontrolle in M. smegmatis durchaus als ein erstes Schema für M. tuberculosis
verwendet werden. . Summary 2

1 Summary
Mycobacterium smegmatis is a saprophytic and fast-growing member of the genus
Mycobacterium and is often used as a model organism for related pathogenic species such
as Mycobacterium tuberculosis. Focus of interest in this study was nitrogen metabolism and
especially transcriptional response to nitrogen limitation in M. smegmatis, while the
regulatory protein GlnR was the focus of attention.
It was shown that the bacterium is able to use different substrates (amino acids, bases and
inorganic nitrogen compounds) as nitrogen sources. Analyses of a glnR deletion strain
revealed that GlnR is substantially involved in the utilization of several of these substrates.
Moreover, 125 new putative GlnR target genes were identified in transcriptome analyses. In
subsequent experiments, a GlnR-dependent increase of transcripts of 32 of these genes was
verified, including genes involved in uptake and assimilation of amino acids, peptides and
inorganic nitrogen sources. This confirms the role of GlnR as global nitrogen regulator in
M. smegmatis. Moreover, also genes not involved in nitrogen metabolism were identified as
GlnR targets, suggesting a more global regulatory function of GlnR. A GlnR subordinate role
in regulation of some genes involved in nitrogen metabolism was also monitored for AmtR.
In addition to that, different methods for purification of GlnR were established and in vitro
analyses of DNA-binding behavior of the purified protein were carried out. Direct binding to
promoter regions of half of the identified target genes was monitored, leading to the
conclusion that indirect GlnR-control via further transcriptional regulators or so far unknown
mechanisms is also involved in gene expression. At least three GlnR binding sites were
identified in the promoter region of amtB, supporting the idea of a “galloping” DNA binding
model which is described for E. coli regulator OmpR. As a member of the OmpR-family of
transcriptional regulators, GlnR is supposed to be phosphorylated by a corresponding sensor
histidine kinase. Although this kinase could not be identified within this study, highly
conserved aspartate residues were distinguished as phosphorylation sites of GlnR.
First experiments with M. smegmatis and M. tuberculosis GlnR pointed to distinct differences
in DNA binding and activation of nitrogen response, although the two GlnR proteins share
identical C-terminal DNA binding and N-terminal phosphorylation domains. Nevertheless, the
model of nitrogen control in M. smegmatis developed in this study can indeed be used as a
first pattern for similar processes in M. tuberculosis.

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