The impact of SoxE transcription factors on the development of neural crest derivatives [Elektronische Ressource] = Die Bedeutung von SoxE-Transkriptionsfaktoren für die Entwicklung von Neuralleistenderivaten / vorgelegt von Simone Reiprich

The impact of SoxE transcription factorson the developmentof neural crest derivativesDie Bedeutung von SoxE-Transkriptionsfaktorenfür die Entwicklungvon NeuralleistenderivatenDen Naturwissenschaftlichen Fakultätender Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-NürnbergzurErlangung des Doktorgradsvorgelegt vonSimone Reiprichaus ErdingAls Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultätender Universität Erlangen-Nürnberg.Tag der mündlichen Prüfung: 14. Juli 2010Vorsitzender der Prüfungskommission: Prof. Dr. Eberhard BänschErstberichterstatter: Prof. Dr. Michael WegnerZweitberichterstatter: Prof. Dr. Manfred FraschL’hésitation est le propre de l’intelligence. –Das Charakteristikum der Intelligenz ist Ungewissheit,Tasten ihr Werkzeug.Henry de Montherland (1896-1972)ContentsContentsZusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . XISummary . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . XIII1 Introduction 11.1 The neural crest and its derivatives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11.1.1 The adrenal medulla . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21.1.1.1 Sympathoadrenal progenitors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31.1.1.2 Regulation of the differentiation of chromaffin cells . . . . . . . . . . . . . . . . . 51.1.2 Schwann cells of the PNS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Publié le : vendredi 1 janvier 2010
Lecture(s) : 34
Source : D-NB.INFO/1006636676/34
Nombre de pages : 133
Voir plus Voir moins

The impact of SoxE transcription factors
on the development
of neural crest derivatives
Die Bedeutung von SoxE-Transkriptionsfaktoren
für die Entwicklung
von Neuralleistenderivaten
Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrads
vorgelegt von
Simone Reiprich
aus ErdingAls Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Universität Erlangen-Nürnberg.
Tag der mündlichen Prüfung: 14. Juli 2010
Vorsitzender der Prüfungskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch
Erstberichterstatter: Prof. Dr. Michael Wegner
Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Manfred FraschL’hésitation est le propre de l’intelligence. –
Das Charakteristikum der Intelligenz ist Ungewissheit,
Tasten ihr Werkzeug.
Henry de Montherland (1896-1972)Contents
Contents
Zusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . XI
Summary . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . XIII
1 Introduction 1
1.1 The neural crest and its derivatives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.1.1 The adrenal medulla . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.1.1.1 Sympathoadrenal progenitors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.1.1.2 Regulation of the differentiation of chromaffin cells . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.1.2 Schwann cells of the PNS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.1.2.1 Schwann cell development . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.1.2.2 Regulation of Schwann cell myelination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.2 Sox proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.2.1 SoxE proteins in general . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
1.2.1.1 Sox10 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.2.1.2 Sox8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.2.2 SoxE proteins in neural crest cell development . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
1.2.2.1 SoxE in chromaffin cell dev . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
1.2.2.2 SoxE proteins in Schwann cell development . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2 Aim of the Study 21
3 Results 23
3.1 The impact of SoxE transcription factors on adrenal gland development . . . . . . 23
3.1.1 Expression pattern of SoxE proteins in the developing adrenal gland . . . . . . . . 23
3.1.2 The impact of Sox10 on adrenal gland development . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.1.3 The impact of Sox8 on adrenal gland dev . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.1.4 Functional redundancy between Sox10 and Sox8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
3.1.5 The importance of conserved SoxE protein domains . . . . . . . . . . . . . . . . 36
3.1.6 Conditional Sox10 deletion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
3.1.7 Analysis of sympathetic ganglia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.2 The impact of the Sox10 transcription factor on the Krox20 MSE . . . . . . . . . 43
3.2.1 Analysis of Sox10 binding sites in the Krox20 MSE . . . . . . . . . . . . . . . . 43
3.2.2 The importance of Sox10 binding sites for the activation of the Krox20 MSE . . . 47
VContents
3.2.3 Synergism of Sox and POU proteins during activation of the Krox20 MSE . . . . . 49
3.2.4 Specificity of the synergism of Sox and POU proteins . . . . . . . . . . . . . . . . 50
3.2.5 Domain requirements for synergistic activation of the Krox20 MSE . . . . . . . . 52
3.2.6 Interaction of Sox10 and Oct6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
3.2.7 Theinvivo importance of the K2 domain for Krox20 expression . . . . . . . . . . 56
3.2.8 The interdependence of Sox10 and Oct6 expression . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
4 Discussion 59
4.1 SoxE proteins in the adrenal gland . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
4.1.1 The theory of the common sympathoadrenal precursor . . . . . . . . . . . . . . . 59
4.1.1.1 The early heterogeneity of the population . . . . . . . . . . . . . 60
4.1.1.2 The role of Sox10 before lineage segregation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
4.1.2 The impact of Sox10 and its domains on adrenal chromaffin cell development . . . 62
4.1.3 Functional redundancy between SoxE proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
4.1.4 The importance of Sox10 for neural crest cell survival . . . . . . . . . . . . . . . 66
4.1.5 The rostro-caudal gradient of Sox10 importance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
4.1.6 The interplay of BMPs, Sox10 and Mash1/Phox2b . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
4.1.6.1 BMPs during early development . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
4.1.6.2 BMPs during late dev . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
4.2 Sox10 in myelinating Schwann cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
4.2.1 The role of Sox10 during myelination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
4.2.2 Synergistic activation of Krox20 expression . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
4.2.3 Sox10 and its DNA binding properties . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
4.2.4 The combined activity of several Sox10 binding sites . . . . . . . . . . . . . . . . 78
5 Material and Methods 81
5.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
5.1.1 Organisms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
5.1.1.1 Mouse lines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
5.1.1.2 Chicken line . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
5.1.1.3 Cell lines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
5.1.2 Chemicals and general reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
5.1.3 Buffers and solutions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
5.1.4 Oligonucleotides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
5.1.4.1 for genotyping . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
5.1.4.2 for mutagenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
5.1.4.3 Oligonucleotides for EMSA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
5.1.5 Antibodies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
5.1.5.1 Primary antibodies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
5.1.5.2 Secondary . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
VIContents
5.2 Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
5.2.1 Animal husbandry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
5.2.2 Standard methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
5.2.3 Site-directed mutagenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
5.2.4 Cell culture methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
5.2.4.1 Cultivation of eukaryotic cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
5.2.4.2 Transfection of HEK293 cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
5.2.4.3 Preparation of whole cell extracts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
5.2.4.4 Transfection of S16 cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
5.2.4.5 Luciferase reporter gene assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
5.2.5 Chickeninovo-electroporation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
5.2.6 Genotyping . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
5.2.6.1 Isolation of genomic DNA for genotyping . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
5.2.6.2 PCR for genotyping . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
5.2.7 Histological methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
5.2.7.1 Tissue preparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
5.2.7.2 Immunohistochemistry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
5.2.7.3 Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling (TUNEL) . . . . . 95
5.2.8 Protein-biochemical methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
5.2.8.1 SDS-PAGE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
5.2.8.2 Western blot and protein detection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
5.2.8.3 GST-Pulldown . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
5.2.8.4 Electromobility shift assay EMSA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
5.2.9 Image analysis and statistics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98
5.2.9.1 Quantification of immunohistochemistry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98
5.2.9.2 Image editing and statistical analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
Abbreviations 101
Bibliography 105
Publications & Presentations 115
VIIList of Figures
List of Figures
1.1 Derivatives of neural crest cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2 Migration of neural crest cells to sympathetic ganglia and adrenal glands . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.3 Schwann cells myelinating a peripheral nerve axon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.4 Regulation of Krox20 expression by the MSE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.5 Conserved SoxE protein domains . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
1.6 SoxE proteins in the terminal differentiation of neural crest deriatives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
3.1 SoxE expression in the early embryonic adrenal gland . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
3.2 SoxE e during embryonic adrenal development . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.3 Sox10 expression in the late embryonic adrenal gland . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.4 The late adrenal gland in Sox10-deficient mice I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.5 The late adrenal gland in mice II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.6 The early embryonic adrenal gland in Sox10-deficient mice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.7 Neural crest cells in the presumptive adrenal gland region . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
3.8 The late adrenal gland in mice with Sox8- and Sox10-deficiencies I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.9 The late adrenal gland in mice with Sox8- and II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.10 The early adrenal gland in mice with Sox8- and I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
3.11 The early adrenal gland in mice with Sox8- and Sox10-deficiencies II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
3.12 The late adrenal gland in mice with hypomorphic Sox10 alleles I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
3.13 The late adrenal gland in mice with h Sox10 alleles II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.14 The early adrenal gland in mice with hypomorphic Sox10 alleles I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
3.15 The early adrenal gland in mice with h Sox10 alleles II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.16 Relative contribution of cortex and medulla to the adrenal gland area . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.17 The late embryonic adrenal gland in mice with conditional Sox10 alleles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
3.18 The early adrenal gland in mice with conditional Sox10 alleles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.19 Development of sympathetic ganglia in the adrenal gland region . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
3.20 Identification of putative Sox10 binding regions within the Krox20 MSE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
3.21 Binding of Sox10 to putative binding regions within the Krox20 MSE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
3.22 Identification of exact Sox10 sites in high-affinity binding regions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
3.23 The impact of single Sox10 binding site mutations on MSE activation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
3.24 The impact of multiple Sox10 binding site on MSE activation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
3.25 The impact of Sox10 binding site mutations on synergistic MSE activation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
3.26 Specificity of the synergistic MSE activation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
3.27 POU protein domain requirements for synergistic MSE activation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
3.28 Sox protein domain requirements for synergistic MSE activation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
3.29 The impact of Sox10DK2 on MSE activation in combination with Brn2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
3.30 Binding of Oct6 to Sox10 protein domains . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
DK2/DK23.31 Krox20 expression along spinal nerves of Sox10 animals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
3.32 Overexpression of Sox10 or Oct6 in the chicken neural tube . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
4.1 BMPs and Sox10 inducing the catecholaminergic phenotype . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
4.2 Sox10 and the activation of Krox20 expression . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
IX

Soyez le premier à déposer un commentaire !

17/1000 caractères maximum.