The role of p115RhoGEF/Lsc in G-alpha 12/13 protein-coupled receptor signaling in thymocytes and the generation of LARG knockout mice [Elektronische Ressource] / Anke Harenberg

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FAKULTÄT FÜR NATURWISSENSCHAFTENUNIVERSITÄT ULMThe Role of p115RhoGEF/Lsc in G Protein-coupled Receptor12/13Signaling in Thymocytesand the Generation of LARG Knockout MiceDISSERTATIONZur Erlangung des Doktorgrades (Dr. rer. nat.)an der Fakultät für Naturwissenschaftender Universität Ulmvorgelegt vonAnke HarenbergausFrankfurt/M, DeutschlandUlm, 20042Amtierender Dekan:Prof. Dr. R. J. BehmErstgutachter:Prof. Dr. Klaus-Dieter Spindler, Allgemeine Zoologie und Endokrinologie, UniversitätUlmZweitgutachter:Prof. Dr. Thomas Wirth, Physiologische Chemie, Universität UlmTag der Promotion:5. November 2004Die Arbeiten im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden am Institut fürMedizinische Strahlenkunde und Zellforschung der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg und in der Abteilung Physiologische Chemie der Universität Ulmdurchgeführt und von Herrn Prof. Dr. Klaus-Dieter Fischer betreut.3ERKLÄRUNGIch versichere hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig angefertig undkeine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt sowie wörtlichoder inhaltlich übernommene Textpassagen als solche gekennzeichnet habe.Anke HarenbergUlm, den.......................................TABLE OF CONTENTS 4TABLE OF CONTENTSTABLE OF CONTENTS .................................................................................................. 4ACKNOWLEDGEMENTS.............................................................................
Publié le : jeudi 1 janvier 2004
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FAKULTÄT FÜR NATURWISSENSCHAFTEN
UNIVERSITÄT ULM
The Role of p115RhoGEF/Lsc in G Protein-coupled Receptor12/13
Signaling in Thymocytes
and the Generation of LARG Knockout Mice
DISSERTATION
Zur Erlangung des Doktorgrades (Dr. rer. nat.)
an der Fakultät für Naturwissenschaften
der Universität Ulm
vorgelegt von
Anke Harenberg
aus
Frankfurt/M, Deutschland
Ulm, 2004
2
Amtierender Dekan:
Prof. Dr. R. J. Behm
Erstgutachter:
Prof. Dr. Klaus-Dieter Spindler, Allgemeine Zoologie und Endokrinologie, Universität
Ulm
Zweitgutachter:
Prof. Dr. Thomas Wirth, Physiologische Chemie, Universität Ulm
Tag der Promotion:
5. November 2004
Die Arbeiten im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden am Institut für
Medizinische Strahlenkunde und Zellforschung der Bayerischen Julius-Maximilians-
Universität Würzburg und in der Abteilung Physiologische Chemie der Universität Ulm
durchgeführt und von Herrn Prof. Dr. Klaus-Dieter Fischer betreut.3
ERKLÄRUNG
Ich versichere hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig angefertig und
keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt sowie wörtlich
oder inhaltlich übernommene Textpassagen als solche gekennzeichnet habe.
Anke Harenberg
Ulm, den.......................................TABLE OF CONTENTS 4
TABLE OF CONTENTS
TABLE OF CONTENTS .................................................................................................. 4
ACKNOWLEDGEMENTS................................................................................................ 7
SUMMARY ...................................................................................................................... 8
ZUSAMMENFASSUNG................................................................................................... 9
ABBREVIATIONS ......................................................................................................... 10
1 INTRODUCTION..................................................................................................... 13
1.1 Rho GTPases.............................................................................................. 13
1.1.1 Introduction............................................................................................... 13
1.1.2 Guanine exchange factors for Rho GTPases ........................................... 15
1.1.2.1 Introduction ........................................................................................... 15
1.1.2.2 RGS domain containing GEFs.............................................................. 16
1.1.3 Functions of RhoGTPases........................................................................ 22
1.1.3.1 Rho GTPases and the actin cytoskeleton ............................................. 22
1.1.3.2 RhoA and gene transcription................................................................. 25
1.2 G protein-coupled receptors..................................................................... 26
1.2.1 Signaling pathways downstream of GPCRs 26
1.3 Thromboxane A and its receptor ............................................................ 282
1.3.1 TXA metabolism ...................................................................................... 282
1.3.2 Thromboxane A and the immune system................................................ 302
1.4 Thymocytes ................................................................................................ 31
1.4.1 Thymocyte development .......................................................................... 31
1.4.1.1 Thymocyte development and RhoGTPases.......................................... 34
1.4.1.2 Apoptosis .............................................................................................. 35
1.5 Aims of the project..................................................................................... 40
2 RESULTS ............................................................................................................... 41
2.1 Lsc RhoGEF mediates signaling from thromboxane A to actin2
polymerization and apoptosis in thymocytes ........................................................ 41TABLE OF CONTENTS 5
-/-2.1.1 Defects in TXA -induced actin polymerization in Lsc thymocytes........... 412
2.1.2 Lsc is required for TXA -mediated RhoA activation ................................. 422
2.1.3 TXA activates multiple signaling intermediates in thymocytes................. 462
2.1.4 Lsc is involved in TXA induction of thymocyte apoptosis......................... 502
-/-2.1.5 Normal expression of FasL on Lsc thymocytes ...................................... 53
2.1.6 U46199 induction of apoptosis is independent of ROCK.......................... 53
-/-2.1.7 Increased number of thymocytes in Lsc mice......................................... 55
2.2 Generation of LARG-deficient mice.......................................................... 59
2.2.1 Overview................................................................................................... 59
2.2.2 Construction of an 129/Ola targeting vector ............................................. 60
2.2.2.1 Library screening .................................................................................. 61
2.2.2.2 Analysis of the cosmids......................................................................... 62
2.2.2.3 Cosmid mapping ................................................................................... 63
2.2.2.4 Construction of an 129/Ola targeting vector.......................................... 66
2.2.2.5 Screening for targeted events............................................................... 69
2.2.3 Construction of an 129/Sv targeting vector............................................... 71
2.2.3.1 Cloning of the 129/vector .................................................. 71
3 DISCUSSION.......................................................................................................... 74
3.1 TXA signals to thymocyte apoptosis and actin polymerization through2
Lsc ..................................................................................................................... 74
3.2 Generation of LARG deficient mice.......................................................... 82
3.3 Future perspective..................................................................................... 83
4 MATERIAL AND METHODS.................................................................................. 85
4.1 Materials ..................................................................................................... 85
4.1.1 Chemicals and reagents........................................................................... 85
4.1.2 Kits ........................................................................................................... 88
4.1.3 Cell lines................................................................................................... 88
4.1.4 Primers 88
4.1.5 Antibodies for Western Blotting ................................................................ 89
4.1.6 Antibodies for flow cytometry.................................................................... 90
4.2 Methods ...................................................................................................... 90TABLE OF CONTENTS 6
4.2.1 Mice.......................................................................................................... 90
4.2.2 Cellular biological Methods....................................................................... 90
4.2.2.1 Thymectomy and thymocyte preparation .............................................. 90
4.2.2.2 Flow cytometry...................................................................................... 91
4.2.2.3 Counting cells by microscope using a hemacytometer ......................... 91
4.2.2.4 Stimulation of thymocytes by crosslinking the TCR .............................. 92
4.2.2.5 Apoptosis assay.................................................................................... 93
4.2.3 Biochemistry............................................................................................. 95
4.2.3.1 Actin polymerization.............................................................................. 95
4.2.3.2 Rho/Rac GTP-“pull down”-Assay.......................................................... 96
4.2.3.3 Western blotting 98
4.2.4 Molecular Biology ................................................................................... 100
4.2.4.1 DNA methods...................................................................................... 100
4.2.4.2 Bacterial manipulation......................................................................... 109
4.2.4.3 Cloning strategies ............................................................................... 111
4.2.4.4 Genomic DNA library screening by PCR............................................. 114
4.2.4.5 Cosmids.............................................................................................. 115
4.2.4.6 Generation of the targeting vector....................................................... 121
4.2.5 ES cell culture......................................................................................... 124
4.2.5.1 Solutions ............................................................................................. 125
4.2.5.2 Preparation of feeders for ES cell culture............................................ 126
4.2.5.3 Growing of ES cells............................................................................. 126
4.2.5.4 Electroporation.................................................................................... 126
4.2.5.5 Isolation and growing of single clones ................................................ 127
4.2.5.6 ES cell freezing................................................................................... 128
4.2.5.7 ES cell thawing 128
4.2.5.8 ES cell DNA purification...................................................................... 129
REFERENCES ............................................................................................................ 130
CURRICULUM VITAE ................................................................................................. 142
PUBLICATIONS.......................................................................................................... 143ACKNOWLEDGEMENTS 7
ACKNOWLEDGEMENTS
I thank Prof. Klaus-Dieter Fischer for the opportunity to work in his lab and all the
rewarding experiences I have acquired during my Ph.D. thesis.
Specials thanks to Dr. Karine Missy for her expert experimental advice and critical
reading of this manuscript and for her patience in answering my endless questions. I am
grateful to Dr. Irute Girkontaite for her protocols and technical advice in experiments
described in this thesis and Dr. Klaudia Giehl from the Pharmacology Department for her
assistance with the GTPase activity assay. I am indebted to Vadim Sakk, Isabella
Soworka and Nina Ushmarov for their work in the mouse colony and technical support.
I would like to thank all the other present and former lab members and the group of Prof.
Thomas Wirth for helping me out whenever I needed it.
To my colleagues in the Institut für Medizinische Strahlenkunde und Zellforschung in
Würzburg and Abteilung Physiologische Chemie in Ulm I thank you for your kindness
and friendship.
Special thanks to my parents for supporting me during my whole studies making all this
possible.SUMMARY 8
SUMMARY
The Lsc RhoGEF (also known as p115-RhoGEF) is a member of the Dbl-homology
family of GTP exchange factors. Lsc has a RhoGEF domain specific for Rho GTPase
and an RGS domain specific for G subunits. One G protein-coupled receptor12/13
activating G subunits is the receptor for thromboxane A (TXA ) called TP, which is12/13 2 2
highly expressed in immature thymocytes. To study the role of Lsc downstream TXA2
signaling and TP activation, I analyzed TXA –dependent activation and development of2
thymocytes from Lsc knockout mice using the TXA analog U46199. We show that2
U46619 stimulated actin polymerization and cofilin phosphorylation in primary
thymocytes, and that these events required Rho, the Rho kinase ROCK and Lsc.
Moreover, in the absence of Lsc, U46619-induced stimulation of phosphorylation of the
survival kinase Akt was greatly enhanced and apoptosis of double positive thymocytes
in culture was decreased. Additionally, the phosphorylation of several protein kinase C
(PKC) isoforms were, like Akt, significantly enhanced in the absence of Lsc. Certain
PKC isoforms are also implicated in the regulation of survival and apoptosis. Supporting
-/-these findings, Lsc mice had significantly higher numbers of thymocytes that further
increased as mice aged. These results demonstrate that TXA induction of thymocyte2
apoptosis depends on the Rho exchange factor Lsc accompanied by signaling to Rho,
ROCK, cofilin and Akt, and that loss of Lsc results in thymic hyperplasia.
The Lsc homolog leukemia-associated Rho GEF (LARG) is more widely expressed than
Lsc, and similar as Lsc, is a GEF specific for Rho and is implicated in downstream
signaling of G subunits via its RGS domain. Many G -dependent functions are12/13 12/13
still working in Lsc deficient mice suggesting that other RGS-domain containing GEFs
could compensate for Lsc in vivo. Therefore we intended to examine the in vivo
functions of LARG by the generation of LARG deficient mice with the future perspective
to generate Lsc/LARG double knockout mice. I constructed a targeting vector, which will
be used to generate LARG knockout mice and compensation between LARG and Lsc
will be tested.
ZUSAMMENFASSUNG 9
ZUSAMMENFASSUNG
Lsc RhoGEF gehört zu der Familie der Dbl-Homologie (DH) Rho Austauschfaktoren
(RhoGEFs) und ist ausschließlich in Zellen des Immunsystems exprimiert. Lsc reguliert
GTPase abhängige Signalwege über die DH-Domäne und besitzt außerdem eine RGS
Domäne, welche spezifisch mit G Untereinheiten interagiert. Diese Interaktion führt12/13
zur Inaktivierung der -Untereinheiten durch GTP Hydrolyse, und außerdem führt die
Interaktion mit G zur Aktivierung der Austauschaktivität von Lsc. Einer der G13 12/13
Protein gekoppelten Rezeptoren ist der für Thromboxan A (TXA ), auch TP Rezeptor2 2
genannt. Der TP Rezeptor ist in unreifen Thymozyten hoch exprimiert. Um die Rolle von
Lsc in TP-abhängigen Signalwegen zu studieren, wurde die Entwicklung und TXA2
Stimulation in Thymozyten in Lsc defizienten Mäusen untersucht. TXA stimuliert Aktin2
Polymerisierung und Cofilin Phosphorylierung in Thymozyten via Rho Kinase und Lsc.
Ausserdem zeigen Lsc defiziente Thymozyten nach TXA Stimulierung eine erhöhte2
Aktivität der Kinasen Akt (auch Protein Kinase B) und einigen Isoformen der Familie der
Protein Kinasen C (PKC). Zusätzlich ist die TXA -induzierte Apoptose von unreifen2
doppelt negativen Thymozyten erniedrigt. In Übereinstimmung mit diesen Daten,
besitzen Lsc defiziente Mäuse einen grösseren Thymus, und der Unterschied in
Thymusgrösse zu Wildtyp-Mäusen nimmt mit dem Alter zu. Diese Daten zeigen, dass
die erniedrigte Apoptoserate von Lsc abhängig ist, in Zusammenarbeit mit Rho, Rho
Kinase, Cofilin und Akt/PKC. Der Verlust von Lsc führt zu Thymushyperplasie.
Leukemia-associated RhoGEF (LARG), ein Lsc-ähnliches Molekül, ist ubiquitär
exprimiert und könnte die Rolle von Lsc in vivo übernehmen, da viele der G 12/13
abhängigen Signalwege in Abwesenheit von Lsc noch funktionieren. Daher wollte ich die
Funktion von LARG in vivo untersuchen, indem ich LARG defiziente Mäuse herstelle,
um sie unter anderem mit Lsc zu kreuzen und Lsc/LARG-doppeldefiziente Tiere zu
erhalten. Ein targeting vector wurde hergestellt und wird benutzt werden, um LARG
knockout Mäuse zu erhalten, um die Kompensation zwischen LARG und Lsc zu testen.
ABBREVIATIONS 10
ABBREVIATIONS
AA arachidonic acid
Arp2/3 actin related protein 2 and 3
BSA bovine serum albumin
CD cluster of differentiation
CH calponin homology
COX cyclooxygenase
DAG diacylglycerol
DC dendritic cell
DH Dbl homology
DN double negative
DP double positive
ECL enhance chemilumescence
Edg endothelial cell differentiation gene
EF embryonic feeders
Egr-1 Early growth response gene
ERK extracellular signal-regulated kinase
ES embryonic stem cells
FACS fluorescein-activated cell sorter
FAK focal adhesion kinase
FCS fetal calf serum
FITC fluorescein isothiocynanate
GAP GTPase activating protein
GEF guanosine nucleotide exchange factor
GDI Guanine-nucleotide dissociation inhibitor
GDP guanosine diphosphate
GPCR G protein coupled receptors
GPI glycosyl-phoshatidyl-inositol
GTP guanosine triphosphate
Grb2 growth factor receptor-bound protein-2

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