The role of the matrix regulator Fra-1 in arthritis and liver fibrosis [Elektronische Ressource] = Die Rolle des Matrixregulators Fra-1 in Arthritis and Leberfibrose / Trayana Kireva. Betreuer: Falk Nimmerjahn

De
The role of the matrix regulator Fra-1 in arthritis and liver fibrosis Die Rolle des Matrixregulators Fra-1 in Arthritis und Leberfibrose Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr.rer.nat. vorgelegt von Trayana Kireva aus Kazanlak, Bulgarien Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 03.06.2011 Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Rainer Fink Erstberichterstatter: Prof. Dr. Falk Nimmerjahn Zweitberichterstatter: PD. Dr. Jochen Zwerina This work was performed at the Department of Internal Medicine III, Rheumatology and Immunology, Erlangen For my parents Table of contents Table of contents ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................. 1 SUMMARY................................................................................................................. 3 1 INTRODUCTION................................................................................................. 5 1.1 The AP-1 complex..............................................................................................................
Publié le : samedi 1 janvier 2011
Lecture(s) : 34
Tags :
Source : D-NB.INFO/1018309004/34
Nombre de pages : 99
Voir plus Voir moins




The role of the matrix regulator Fra-1 in arthritis
and liver fibrosis
Die Rolle des Matrixregulators Fra-1 in Arthritis und Leberfibrose

Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr.rer.nat.















vorgelegt von
Trayana Kireva
aus Kazanlak, Bulgarien



Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der
Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg




















Tag der mündlichen Prüfung: 03.06.2011


Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Rainer Fink

Erstberichterstatter: Prof. Dr. Falk Nimmerjahn

Zweitberichterstatter: PD. Dr. Jochen Zwerina


This work was performed at the Department of Internal Medicine III,
Rheumatology and Immunology, Erlangen


































For my parents
Table of contents
Table of contents
ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................. 1
SUMMARY................................................................................................................. 3
1 INTRODUCTION................................................................................................. 5
1.1 The AP-1 complex................................................................................................................................... 5
1.2 Bone development ................................................................................................................................... 7
1.3 Bone destruction during arthritis........................................................................................................ 10
1.4 Liver development ................................................................................................................................ 12
1.5 Liver injury ........................................................................................................................................... 13
1.6 Liver fibrosis ......................................................................................................................................... 14
1.7 Cholestatic liver diseases ...................................................................................................................... 16
2 AIM OF THE STUDY......................................................................................... 18
3 MATERIAL........................................................................................................ 20
3.1 Biological material:............................................................................................................................... 20
3.1.1 Animals.............................................................................................................................................. 20
3.1.2 Primary cells ...................................................................................................................................... 20
3.1.3 Human Tissue .................................................................................................................................... 20
3.2 Non-biological material:....................................................................................................................... 21
3.2.1 Chemicals, media and buffer.............................................................................................................. 21
3.2.2 Cytokines and Enzymes ..................................................................................................................... 22
3.2.3 Primers ............................................................................................................................................... 22
3.2.4 Antibodies.......................................................................................................................................... 22
3.2.5 Kits..................................................................................................................................................... 22
3.2.6 Software ............................................................................................................................................. 22
3.2.7 Instruments......................................................................................................................................... 23
4 METHODS ........................................................................................................ 24
4.1 Methods performed to study the bone phenotype of Fra-1tg x hTNFtg mice.................................. 24
4.1.1 Clinical assessment ............................................................................................................................ 24
4.1.2 Bone histomorphometry..................................................................................................................... 24
4.1.3 Bone histology ................................................................................................................................... 24
4.1.4 In situ hybridisation ........................................................................................................................... 25
4.1.5 Elisa ................................................................................................................................................... 25
4.1.6 Isolation and culture of osteoclast precursors .................................................................................... 26
4.1.7 Isolation and culture of chondrocytes ................................................................................................ 26

i Table of contents
4.2 Methods performed to study liver pathology of Fra-1tg mice........................................................... 26
4.2.1 Liver histology ................................................................................................................................... 26
4.2.2 Sirius red staining............................................................................................................................... 27
4.2.3 Alkaline phosphatase activity ............................................................................................................ 27
4.2.4 Hydroxyproline assay ........................................................................................................................ 27
4.2.5 Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) .......................................................................................... 27
24.2.6 RT Profiler PCR array ...................................................................................................................... 28
4.2.7 Isolation of non-parenchymal liver cells and blood cells................................................................... 28
4.2.8 FACS Analysis................................................................................................................................... 29
4.3 General methods ................................................................................................................................... 29
4.3.1 Genotyping of animals ....................................................................................................................... 29
4.3.2 RT-PCR ............................................................................................................................................. 29
4.3.3 Immunohistochemistry....................................................................................................................... 30
4.4 Statistical analysis................................................................................................................................. 30
5 RESULTS.......................................................................................................... 31
5.1 The role of Fra-1 in bone and cartilage homeostasis during chronic arthritis................................ 31
5.1.1 Clinical features of Fra-1tg x hTNFtg mice....................................................................................... 31
5.1.2 Synovial inflammation in Fra-1tg x hTNFtg mice ............................................................................ 33
5.1.3 Fra-1 prevents local bone damage in hTNFtg mice ........................................................................... 35
5.1.4 Fra-1tg x hTNFtg mice develop systemic osteosclerosis................................................................... 37
5.1.5 Fra-1 protects from TNF-induced cartilage degradation.................................................................... 40
5.1.6 Increased proliferation of primary chondrocytes overexpressing Fra-1............................................. 43
5.2 Fra-1tg mice develop liver fibrosis ...................................................................................................... 45
5.2.1 Fra-1tg mice develop progressive hepatic portal inflammation and ductular reaction...................... 45
5.2.2 Hepatic up-regulation of chemokines in Fra-1tg mice ...................................................................... 48
5.2.3 Hepatic infiltration of activated T cells and neutrophils in Fra-1tg mice .......................................... 50
5.2.4 Fra-1tg mice develop progressive biliary cirrhosis............................................................................ 54
5.2.5 Upregulation of pro-fibrotic genes in livers of Fra-1tg mice............................................................. 56
5.2.6 Co-localization of Fra-1 and pro-fibrotic proteins is confined to cholangiocytes in Fra-1tg mice.... 58
5.2.7 Fra-1 expression in human samples of liver fibrosis.......................................................................... 60
5.2.8 Involvement of T- cells in the progression of liver fibrosis in Fra-1tg mice ..................................... 62
6 DISCUSSION .................................................................................................... 64
REFERENCES ......................................................................................................... 73
APPENDIX ............................................................................................................... 83
ABBREVATIONS..................................................................................................... 88
ACKNOWLEDGEMENT........................................................................................... 90
CURRICULUM VITAE.............................................................................................. 91




ii Zusammenfassug
Zusammenfassung

Ziel dieser Doktorarbeit war es, den Effekt einer Matrixüberproduktion durch fra-1
Überexpression auf Knochen- und Leberhomoöstase zu untersuchen. Die erzielten
Daten zeigten, dass eine erhöhte Matrixproduktion einen dualen Effekt hat, indem sie
1) die Knochenneubildung in entzündlichen Knochenerkrankungen wie der
rheumatoiden Arthritis begünstigt, aber 2) die Bildung von fibrotischem Gewebe in
der Leber induziert und damit Leberstruktur und –funktionen beeinträchtigt.
Um den Fragestellungen nachgehen zu können wurden zwei Mausmodelle
verwendet: die Fra-1 transgene Maus, welche vermehrt Knochen bildet und eine
Osteosklerose entwickelt und die hTNF transgene Maus, welche eine erosive
Arthritis entwickelt und ein murines Modell der rheumatoiden Arthritis darstellt.
In dem ersten Teil der Studie konnte gezeigt werden, dass eine Überexpression des
Transkriptionsfaktors fra-1 den Knochen- und Knorpelverlust in den arthritischen
hTNFtg Mäusen vorbeugt. Dazu wurden Fra-1tg Mäuse mit den hTNFtg Mäusen
gekreuzt und untersucht. Die Fra-1tg x hTNFtg Mäuse zeigten, wie die hTNFtg
Mäuse, klinische Symptome der Arthritis. Des Weiteren wiesen die Fra-1tg x hTNFtg
Mäuse auch histologisch eine synoviale Entzündung auf. Allerdings war der Abbau
von subchondralem Knochen in den Fra-1tg x hTNFtg Mäusen reduziert und die
Anzahl der Osteoklasten stark vermindert. Weiteres entwickelten die Fra-1tg x
hTNFtg Mäuse Osteosklerose aufgrund erhöhter Knochensynthese. Zudem wiesen
die Fra-1tg x hTNFtg Mäuse eine starke Reduktion des Proteoglykanverlustes und
damit geringere Knorpelschädigung auf, was möglicherweise mit der erhöhten
Proliferationsaktivität der fra-1tg Knorpelzellen erklärt werden kann.
Die Überexpression von fra-1 führt auch in der Leber zur verstärkten
Matrixneusynthese und damit einhergehend einer Leberfibrose. Die Fra-1
transgenen Mäuse wiesen eine erhöhte Anzahl an sklerosierenden intrahepatischen
Gallengänge auf, begleitet von einer lokalen Entzündung, welche durch eine
Mischung aus T-Zellen, überwiegend CD4+ T-Zellen und weniger B-, NK- und NKT-
Zellen verursacht wurde. Im Verlauf der Erkrankung entwickelten die Fra-1tg Mäuse
eine biliäre Fibrose, basierend auf einer Überexpression collagener und
profibrogener Gene. Die pathologischen Veränderungen in der Leber waren nur

1 Zusammenfassug
-/-teilweise eine Folge der Entzündungsaktivität, da Fra-1tg x Rag2 Mäuse kaum
Entzündung, aber weiterhin eine Leberfibrose entwickelten. Die Entstehung von
Leberfibrose in den Fra-1tg Mäusen scheint ein cholangiozyten-abhängiger Prozess
zu sein, da fibrose-induzierende Moleküle wie PDGFs und TGFß1 in den
Cholangiozyten von Fra-1tg Mäuse detektiert werden konnten. Zudem identifizierten
wir die Cholangiozyten und inflammatorischen Zellen als Hauptsyntheseort des Fra-1
Proteins in der Leber der Fra-1tg Maus. Untersuchungen zur Fra-1 Produktion an
humanen Proben von Patienten mit fortgeschrittener Leberfibrose unterstützten die
experimentellen Ergebnisse.
Unsere Untersuchungen zeigen, dass eine vermehrte Matrixproduktion durch fra-1
Überexpression die knöcherne Destruktion durch arthritische Vorgänge vermindern
kann. Dieser Prozess sollte allerdings therapeutisch nur lokal stattfinden, da bei
systemischer Anwendung auch in anderen Organen fibrotische Prozesse zu erwarten
sind.



2 Summary
Summary

Herein we investigated the effect of matrix overproduction on bone and liver
homeostasis. Our data show that overproduction of matrixproteins due to fra-1
overexpression have a dual effect since they 1) benefit new matrix synthesis in bones
during inflammatory arthritis, but 2) induce liver fibrosis.
We used two mouse models: the Fra-1 transgenic mouse, which shows increased
bone synthesis and develops osteosclerosis and the hTNF transgenic mouse, which
develops erosive arthritis and represents a mouse model of rheumatoid arthritis.
In the first part of the study we could show that overexpression of the transcription
factor fra-1 reduces bone and cartilage damage in the arthritic hTNFtg mouse. The
Fra-1tg x hTNFtg mice show strong arthritic signs, similar to the hTNFtg mice.
Arthritis development in Fra-1tg x hTNFtg mice was associated with strong
inflammatory cell influx, but less bone erosions and decreased osteoclast number,
whereas bone mass was strongly increased and osteosclerosis was evident. In
addition, overexpression of fra-1 protected arthritic hTNFtg mice from cartilage
destruction, which may be in part caused by increased chondrocytes proliferation due
to fra-1 overexpression.
In contrast to its benefical effects on bone metabolism, overexpression of fra-1 in liver
tissue leads to development of liver fibrosis. Mice overexpressing fra-1 develop
chronic hepatitis characterized by strong portal tract inflammation and increased bile
duct number. Inflammatory infiltrates are composed of increased number of T cells,
particularly of CD4+ cells, and decreased number of NK-, NKT- and B cells. Hepatitis
development in Fra-1tg mice is accompanied by biliary fibrosis based on the
upregulated expression of collagens and profibrogenic genes. Liver pathology is not
-/-
directly triggered by the immune system as Fra-1tg x Rag2 mice showed no evident
inflammation, but obvious fibrotic tissue. Fibrosis development in the Fra-1tg mice
seems to be accomplished by activated biliary epithelial cells, which express the
profibrotic proteins PDGF and TGFß1. In addition, biliary epithelial cells and
inflammatory cells synthesize the Fra-1 protein in the Fra-1tg mice, but not in
wildtype mice. These findings were replicated in human liver samples of advanced
liver fibrosis.

3

Soyez le premier à déposer un commentaire !

17/1000 caractères maximum.