The supramolecular structure of the respiratory chain of higher plants [Elektronische Ressource] / von Holger Eubel

Holger Eubel

Sujets

• Biologie

Informations

• Publié par: gottfried_wilhelm_leibniz_universitat_hannover
• Publié le: 01 janvier 2004
• Nombre de lectures: 37
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 4 Mo

Extrait

The Supramolecular Structure
of the
Respiratory Chain of Higher Plants
Vom Fachbereich Biologie der Universität Hannover
zur Erlangung eines Grades des
Doktors der Naturwissenschaften
Dr. rer. nat.
Genehmigte Dissertation
von
Dipl.-Biol. Holger Eubel
geboren am 7. April 1975 in Minden

The Supramolecular Structure
of the
Respiratory Chain of Higher Plants



Vom Fachbereich Biologie der Universität Hannover
zur Erlangung eines Grades des
Doktors der Naturwissenschaften

Dr. rer. nat.



Genehmigte Dissertation
von

Dipl.-Biol. Holger Eubel

geboren am 7. April 1975 in Minden




























Referent: Prof. Dr. Hans-Peter Braun
Koreferenten: PD Dr. Jutta Papenbrock
Prof. Dr. Hermann Schägger

Tag der Promotion: 07.12.2004 Zusammenfassung

Seit kurzem erlaubt eine neuartige experimentelle Strategie die weitergehende Erforschung
der supramolekularen Struktur der Atmungskette von Säugern, Hefe und Bakterien. Durch
vorsichtige Solubilisierung der mitochondrialen Proteinkomplexe mit dem milden Detergenz
Digitonin, gefolgt von einer Auftrennung der Proteinkomplexe durch Blau-native (BN)
Polyacrylamid Gelelektrophorese (PAGE), konnte die Existenz von supramolekularen
Strukturen gezeigt werden. Die vorliegende Dissertation hat eine Anwendung dieser Strategie
zur Untersuchung der supermolekularen Struktur der Atmungskette pflanzlicher
Mitochondrien zum Gegenstand. Solubilisierung isolierter Mitochondrien aus verschiedenen
höheren Pflanzen mittels Digitonin erlaubt die Visualisierung von zusätzlichen
hochmolekularen Banden auf BN-Gelen. Durch die Verwendung von Natrium-Dodecylsulfat-
(SDS) oder BN-PAGE als zweite Gel-Dimension konnte die Untereinheitenkomposition der
Superkomplexe aufgeklärt werden. In nicht-grünen Geweben von Arabidopsis, Bohne und
Gerste wurde ein dominanter Superkomplex gefunden, der aus monomerer NADH
Dehydrogenase (Komplex I) und dimerer Cytochrom c Reduktase (Komplex III) besteht.
„Substrate Channeling“ innerhalb dieses Superkomplexes könnte den Zugriff der alternativen
Oxidase (AOX) auf ihr Substrat Ubiquinol einschränken und in vivo die Aktivität dieses
Enzyms reduzieren. Elektronenmikroskopische Untersuchungen des Superkomplexes mit
anschließender Einzelpartikel-Analyse zeigen eine hoch definierte Struktur. Die Pflanzen-
spezifische Untereinheit At1g47260 scheint eine entscheidende Rolle bei der Stabilisierung
des I III Superkomplexes und des singulären Komplex I zu spielen. Eine Insertions-Mutante 1 2
des korrespondierenden Gens zeichnet sich durch eine deutlich verringerte Abundanz beider
Komplexe aus. Frisch geerntete Kartoffel-Knollen besitzen Superkomplexe, die neben dem
I III -Superkomplex noch ein, zwei oder vier Kopien von Komplex IV zusätzlich besitzen. In 1 2
ethiolierten Kartoffel-Sprossen finden sich außerdem noch Superkomplexe, die eine kleinere
Form von Komplex IV enthalten. In gel-Aktivitätsfärbungen zeigen eine höhere Aktivität für
die große Form des Komplexes IV. Umwandlung der einen Form in die andere könnte einen
Regulationsmechanismus für die Aktivität des Superkomplexes darstellen. Im Vergleich zum
Succinat Dehydrogenase Komplex aller bisher untersuchten Organismengruppen enthält
dieser Proteinkomplex in Pflanzenmitochondrien mindestens vier Zusatzuntereinheiten. Diese
Proteine integrieren wahrscheinlich Nebenaktivitäten in die pflanzliche Succinat
Dehydrogenase. Solche Zusatzaktivitäten sind bereits für die Komplexe I und III bekannt und
treffen möglicherweise auch für den Komplex IV pflanzlicher Mitochondrien zu.

Schlagwörter: Atmungskette, Superkomplexe, pflanzenspezifische Untereinheiten Abstract

Recently, a novel experimental procedure for the investigation of the supramolecular structure
of the respiratory chain of mammals, yeast and bacteria has been introduced. Gentle
solubilization of respiratory protein complexes by the non-ionic detergent digitonin followed
by Blue-native (BN) polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) revealed the presence of
several supramolecular structures formed by components of the respiratory chain. This thesis
is a systematic investigation of the organization of the respiratory chain in mitochondria of
higher plants. Solubilization of isolated plant mitochondria with digitonin resulted in several
additional bands in the high molecular range on BN gels. Second gel dimensions employing
sodium dodecylmaltoside (SDS)-PAGE or BN-PAGE in the presence of n-Dodecylmaltoside
(DDM) revealed the subunit compositions of these supercomplexes. In non-green tissue of
Arabidopsis, bean and potato, the dominant supercomplex was found to be composed of a
single copy of NADH dehydrogenase (complex I) and dimeric cytochrome c reductase
(complex III). Substrate channelling within the I III supercomplex might reduce access of the 1 2
alternative oxidase (AOX) to its substrate ubiquinone and therefore limit in vivo activity of
this oxido-reductase. Investigation of the I III supercomplex by electron micrography 1 2
followed by single particle analysis revealed a defined association of this structure. In
Arabidopsis, the plant specific subunit At1g47420 was found to be essential for the stability
of this supercomplex and singular complex I. Knockout of the corresponding gene leads to a
highly decreased abundance of both complexes. In freshly harvested potato tubers, low
abundant supercomplexes made of the I III supercomplex were found comprising 1 2
additionally one, two or four copies of complex IV. In etiolated potato stems, also
supercomplexes containing a smaller form of complex IV were present. In gel activity
staining of complex IV revealed a higher activity of the larger version of complex IV.
Conversion of one form of complex IV into the other might present a mechanism to regulate
electron flow through complex IV containing supercomplexes. Finally, the plant succinate
dehydrogenase (complex II) was found to contain twice as many subunits as known for all
other organisms investigated so far. These subunits are thought to exhibit side functions not
related to electron transport. Such subunits are known to be present in the plant respiratory
complexes I and III. Subunits with side activities are also predicted to be existent in complex
IV.

Keywords: plant respiratory chain, supercomplexes, plant specific subunits Contents




Abbreviations …………………………………………………………….. 1

Chapter 1 General Introduction………………………………………. 2

Chapter 2 New Insights into the Respiratory Chain of Plant
Mitochondria. Supercomplexes and a Unique Composition
of Complex II……………………………………………… 16
Plant Physiology 133: 274-286

Identification and Characterization of Respirasomes inChapter 3
Potato Mitochondria………………………………………. 29
Plant Physiology 134: 1450-1459

Chapter 4 Respiratory chain supercomplexes in plant
mitochondria………………………………………………. 39
Plant Physiology and Biochemistry 42: 937-942

Chapter 5 Mitochondrial cytochrome c oxidase and succinate
dehydrogenase complexes contain plant-specific subunits. 58
Plant Molecular Biology 2004, in press

Knockout of a gene encoding a plant specific subunit of Chapter 6
complex I (At1g47260) dramatically affects
mitochondrial respiration and physiology………………... 71
Accepted for publication by the Journal of Molecular Biology

Chapter 7 Supplementary Discussion and Outlock………………….. 111

Affix Publications 2001 – 2005..………………………………... 121

Curriculum Vitae………………………………………….. 122

Danksagung.......................................................................... 123

Abbreviations

1D one dimensional
2Dtwodimensional
AMPAdenosinmonophosphate
AOXalternativeoxidase
ATPAdenosintriphosphate
BNBluenative
CL Cardiolipin
CNColourlessnative
CO carbon dioxide 2
Complex I NADH dehydrogenase
Complex II succinate dehydrogenase
Complex III cytochrome c reductase
Complex IV e c oxidase
Complex V mitochondrial ATP-Synthase
DDM n-dodecylmaltoside
DNA desoxy ribonucleic acid
ETC electron transport chain
FAD Flavin adenine dinucleotide (oxidiced form)
FADH Flavin adenine dinucleotide (reduced form) 2
IMS inter membrane space
MPP mitochondrial processing peptidase
+NAD Nicotinamide adenine dinucleotide (oxidized form)
NADH ide adenine dinucleotide (reduced form)
+NADP Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
(oxydized form)
NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
(reduced form)
Nd (NADH) external NADH dehydrogenase ex
Nd (NADPH) external NADPH dehydrogenase ex
Nd (NADH) internal NADH dehydrogenase in
Nd (NADPH) internal NADPH dehydrogenase in
O molecular oxygen 2
OXPHOS oxidative phosphorylation
P inorganic orthophosphate i
PP inorganic pyrophosphate i
PAGE polyacrylamide gel electrophoresis