Thérapie photodynamique ciblant la vascularisation tumorale par l'adressage du co-récepteur neuropiline-1 : vers l'élaboration de peptides biologiquement plus stables

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Sous la direction de Muriel Barberi-Heyob
Thèse soutenue le 30 janvier 2009: Nancy 1
La thérapie photodynamique (PDT) est une modalité de traitement des petites tumeurs localisées, reposant sur l’action conjuguée d’un photosensibilisateur (PS), de la lumière et de l’oxygène. Dans le cadre d’un nouveau mode de PDT, la VTP (vascular targeted photodynamic therapy), notre stratégie a consisté à favoriser l’effet anti-vasculaire du traitement par ciblage de la néo-vascularisation tumorale. Pour cela, nous avons étudié in vitro et in vivo un PS de type chlorine (TPC) couplé, via le bras espaceur (Ahx), à un heptapeptide (ATWLPPR) spécifique d’un co-récepteur du VEGF, la neuropiline-1 (NRP-1). Une étude comparative de la TPC versus le PS conjugué (TPC-Ahx-ATWLPPR), a permis de mettre en évidence in vitro, grâce à une technique d’ARN interférence visant à éteindre l’expression de NRP-1, une incorporation cellulaire récepteur-dépendante du conjugué. In vivo, l’accumulation préférentielle de la TPC-Ahx-ATWLPPR au niveau de l’endothélium vasculaire de la tumeur ainsi que son effet anti-vasculaire après PDT ont été mises en évidence. Une étude de stabilité in vitro et in vivo du conjugué a été réalisée. In vivo, la séquence peptidique est dégradée 4 h après injection par voie intra-veineuse. Des études de pharmacocinétique et de biodistribution tissulaire de la TPC-Ahx-ATWLPPR et de son principal produit de dégradation, TPC-Ahx-A ont été réalisées chez la souris nude xénogreffée. La dégradation de la partie peptidique est majoritaire dans les organes du système réticulo-endothélial où l’accumulation du conjugué est la plus importante. Dans le but d’augmenter la stabilité in vivo du peptide adresseur, de nouveaux peptides ont été synthétisés, puis couplés à la TPC et testés. Le pseudopeptide A?[CH2NH]TWLPPR est prometteur car il reste affin vis-à-vis de NRP-1 et après couplage au PS, il ne subit aucune dégradation dans le 8plasma in vivo 4 h après injection par voie intra-veineuse.
-Thérapie photodynamique
-ARN interférence
-Adressage vasculaire
-Neuropiline-1
-Pseudopeptides
Photodynamic therapy (PDT) is a treatment modality against small localized tumors, based on the combined action of a photosensitizer (PS), light and oxygen. A new method of PDT, the VTP (vascular targeted photodynamic therapy) was studied. The purpose of our strategy is to promote the anti-vascular effect of PDT by targeting the tumor vasculature. We studied the behaviour of the tetraphenylchlorine (TPC) conjugated, via the Ahx spacer, to a VEGF co-receptor (neuropilin-1) specific heptapeptide (ATWLPPR), in vitro and in vivo. A comparative study of TPC versus the conjugated PS, TPC-Ahx-ATWLPPR, allowed us to identify in vitro, using a technique of RNA interference-mediated silencing of NRP-1, a receptor-dependent uptake of the conjugate. In vivo, a preferential accumulation of TPC-Ahx-ATWLPPR in endothelial cells and its anti-vascular effect were demonstrated. A study of stability in vitro and in vivo of the conjugate was conducted. In vivo, the peptide sequence was degraded 4 h after intra-venous injection. Pharmacokinetics and tissue biodistribution studies of TPC-Ahx-ATWLPPR and its main degradation product, TPC-Ahx-A, was performed in bearing nude mice. The degradation process of the peptide is important in the organs of the reticulo-endothelial system, where the accumulation of the conjugate is majority. In order to improve in vivo stability of the targeting-peptide, new peptides were design and tested. The pseudopeptide A?[CH2NH] TWLPPR bound NRP-1, and after coupling with the PS, no degradation is observed in plasma in vivo 4 h after intra-venous injection.
Source: http://www.theses.fr/2009NAN10019/document
Publié le : vendredi 28 octobre 2011
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Ecole doctorale « Biologie Santé environnement »

THESE


Pour obtenir le titre de
Docteur de l’Université Henri Poincaré – Nancy I
Discipline : Ingénierie Cellulaire et Tissulaire


Noémie THOMAS

Thérapie photodynamique ciblant la vascularisation tumorale par l’adressage du
co-récepteur neuropiline-1 :
Vers l'élaboration de peptides biologiquement plus stables



Thèse présentée et soutenue publiquement le 30 janvier 2009


Rapporteurs
Serge MORDON Directeur de Recherche INSERM, Lille
Vincent SOL Maître de Conférences (HdR), Limoges Non examinateur

Examinateurs
Muriel BARBERI-HEYOB Chargée de Recherche CAV (HdR), Nancy Directeur de thèse
Céline FROCHOT de Recherche CNRS (HdR), Nancy Co-directeur de thèse
Stéphanie BONNEAU Maître de Conférences, Paris 6
Pierre LEROY Professeur, Nancy
Olivier TILLEMENT Professeur, Lyon 1

Invité
Régis VANDERESSE Chargé de Recherche CNRS, Nancy
CENTRE DE RECHERCHE EN AUTOMATIQUE DE NANCY
CNRS – CENTRE ALEXIS VAUTRIN – NANCY UNIVERSITE
Remerciements

Ce travail a été réalisé au Centre de Recherche en Automatique de Nancy (Directeur Alain
Richard), sur le site du Centre Alexis Vautrin (Directeur François Guillemin) et a été soutenu
financièrement par la Ligue Nationale Contre le Cancer.

Madame le Docteur Muriel Barberi-Heyob, je vous remercie pour m’avoir encadré, soutenu
et aiguillé tout au long cette thèse. Un grand merci pour votre patience et votre grande
disponibilité ainsi que vos qualités humaines et scientifiques.

Madame le Docteur Céline Frochot, je te remercie de m’avoir guidé dans cette voie et fait
partager ta passion pour la recherche. Un grand merci pour ton soutien et ton encadrement
tout au long de cette thèse jusqu’au stade de la rédaction.

Monsieur le Professeur Serge Mordon et monsieur le docteur Vincent Sol, je vous adresse
mes sincères remerciements pour l’honneur que vous me faites en acceptant de juger ce
travail en tant que rapporteurs. Je vous prie de croire en ma haute considération.

Messieurs les Professeurs Pierre Leroy et Olivier Tillement, madame le docteur Stéphanie
Bonneau, je vous suis profondément reconnaissante pour l’enthousiasme avec lequel vous
avez accepté de participer à ce jury de thèse.

Monsieur le Docteur Régis Vanderesse, un très grand merci pour ton accueil chaleureux au
LCPM et le temps que tu m’as consacré depuis mon initiation à la synthèse peptidique
jusqu’à l’analyse des spectres RMN et les corrections de ce manuscrits. C’est un plaisir de
travailler avec toi.
Je remercie également tous les membres du LCPM pour leur chaleureux accueil, en
particulier Mathilde et Ezatul.

Madame le Docteur Marie-Laure Viriot, je vous remercie pour avoir soutenu et suivi ce
travail avec beaucoup d’attention.

Mademoiselle le Docteur Loraine Tirand, tes connaissances et ta rigueur scientifique ont été
un modèle pour moi. Merci pour la qualité de ton travail dont une partie est présentée dans
ce mémoire. Grâce à toi, cette thèse a pu se déroulée dans les meilleures conditions. Un
grand merci aussi pour ton soutien tout au long de cette thèse.

Mademoiselle Denise Béchet, un grand merci pour la qualité du travail que tu as fourni
durant ton master 2 (et après), les résultats d’efficacité photodynamique in vivo
t’appartiennent. Je te remercie amicalement pour ton soutien moral surtout durant cette
dernière année de thèse, j’ai été ravie de pouvoir travailler avec toi. Bon courage pour la
suite de ta thèse !

Monsieur le Professeur Philippe Bécuwe, je vous suis sincèrement reconnaissante de
m’avoir transmis vos connaissances en biologie moléculaire. Je vous remercie
chaleureusement pour votre disponibilité et votre enthousiasme, grâce à vous le projet de
modèle cellulaire à pu voir le jour.
Je remercie également Vanessa et Emilie pour leur aide technique et leur sympathie.

Monsieur le Professeur François Plénat, je vous suis profondément reconnaissante de
m’avoir permis de travailler au sein de votre laboratoire. Je vous remercie pour votre
expertise et le temps conséquent consacré à l’analyse de mes tumeurs.
Je tiens également à adresser mes remerciements à Madame Corinne Bonnet pour m’avoir
initiée aux techniques d’immunohistochimie.

Monsieur le Professeur Etienne Chatelut, je vous remercie chaleureusement pour votre
expertise en pharmacocinétique.

L’équipe du Laboratoire de Spectrométrie de Masse et de Chimie Laser de Metz, je vous
remercie pour cette collaboration efficace. Mes remerciements s’adressent en particulier au
Docteur Marc Dodeller et à David Dasilva. Merci pour le temps que vous avez consacré à
l’analyse de nos produits.

Mademoiselle le Docteur Sophie Pinel, je te remercie chaleureusement pour m’avoir fait
partager tes connaissances avec sympathie et pédagogie. Mademoiselle le docteur Marianne
Labussière, merci pour ton aide précieuse et ton soutien.


Un grand merci également à toute l’équipe « adressage de molécules photoactivable » pour
les agréables moments d’échanges scientifiques et pour votre sympathie.

Merci à toute l’équipe, du CAV pour votre accueil chaleureux, vous avez tous participé à mon
enrichissement scientifique et personnel.
Un merci particulier à Aurélie, Carole, les Maries et Dominique pour avoir été toujours
disponible et pour m’avoir aidé dans divers domaines.

Le comité de Meuse de la Ligue Nationale Contre le Cancer, Je vous remercie sincèrement
de m’avoir attribué successivement trois bourses de recherche. Ce soutien financier m’a
permis de mener sereinement mon travail de thèse.




Une dédicace à mes amis qui se reconnaîtront aux quatre coins de la France et parfois même
plus loin. Grâce à vous j’ai pu m’évader et les moments de détentes que j’ai pu partager avec
et grâce à vous ont été des bouffées d’oxygène.

J’embrasse tendrement Jordane pour m’avoir soutenue et supportée durant ce parcours
commun et simplement pour l’amour qu’il me porte. Je tiens également à remercier sa
famille, Jacky, Nicole et Cédric pour votre chaleureux accueil et votre gentillesse.

Un grand merci à toute ma famille et plus particulièrement à mes parents, merci pour
m’avoir toujours soutenue dans mes choix, merci pour votre confiance. Merci à mes petites
sœur Emeline et Mélanie, merci de m’avoir soutenue et surtout de m’avoir supporté (pas que
durant ma thèse d’ailleurs). Merci à ma grand mère Simone pour son amour et un clin d’œil
aux mini miss (Zoé et Ana) que j’ai vu grandir avec plaisir durant cette thèse.



A Emile, Huguette et René mes regréttés grands-parents,



Production scientifique


Publications

Thomas N., Bechet D., Tirand L., Becuwe P., Vanderesse R., Frochot C., Guillemin F.,
Barberi-Heyob M. Peptide-conjugated chlorine-type photosensitizer binds neuropilin-1 in
vitro and in vivo. J Photochem Photobiol B, 2009. Sous presse. IF 2007 = 1,92

Tirand L., Bastogne T., Bechet D., Linder M., Thomas N., Frochot C., Guillemin F., Barberi-
Heyob M. Response Surface Methodology: an extensive Potential to Optimize in vivo
Photodynamic Therapy Conditions. Int J Rad Oncol Biol Phys, 2009. Sous presse. IF 2007 =
4,29

Thomas N., Tirand L., Chatelut E., Plenat F., Frochot C., Dodeller M., Guillemin F., Barberi-
Heyob M. Tissue distribution and pharmacokinetics of an ATWLPPR-conjugated chlorin-type
photosensitizer targeting neuropilin-1 in glioma-bearing nude mice. Photochem Photobiol
Sci, 2008, 7(4):433-41. IF 2007 = 2,21

Tirand L., Thomas N., Dodeller M., Dumas D., Frochot C., Maunit B., Guillemin F., Barberi-
Heyob M. Metabolic profile of a peptide-conjugated chlorin-type photosensitizer targeting
neuropilin-1 : an in vivo and in vitro study. Drug Metab Dispos, 2007, 35(5):806-13. IF
2007 = 3,91

Schneider R., Tirand L., Frochot C., Vanderesse R., Thomas N., Gravier J., Guillemin F.,
Barberi-Heyob M. Recent improvements in the use of synthetic peptides for a selective
photodynamic therapy. Anticancer Agents Med Chem, 2006, 6(5):469-88. IF. Publication
sur invitation.

Tirand L., Frochot C., Vanderesse R., Thomas N., Trinquet E., Pinel S., Viriot M.L.,
Guillemin F., Barberi-Heyob M. A peptide competing with VEGF165 binding on neuropilin-1
mediates targeting of a chlorin-type photosensitizer and potentiates its photodynamic activity
in human endothelial cells. J Control Release, 2006, 111(1-2):153-64. IF 2007 = 4,76


Communications orales et par affiche

Thomas N., Tirand L., Chatelut E., Plénat F., Frochot C., Dodeller M., Guillemin F., Barberi-
Heyob M. Tissue distribution and pharmacokinetics of an ATWLPPR-conjugated chlorin-type
thphotosensitizer targeting neuropilin-1 in glioma-bearing nude mice. 5-8 Juil 2008. 20
Meeting European Association for Cancer Research. Lyon (France). Elsevier, Eur J
Cancer. Suppl. p 25. Communication par affiche

Thomas N. Ciblage de la neuropiline-1 pour potentialiser l’effet anti-vasculaire de la PDT.
29 mai 2008. GDR 3049 PHOTOMED. Médicaments photoactivables –
photochimiothérapie. Vandœuvre-lès-Nancy. Communication orale



Thomas N., Tirand L., Bechet D., Vanderesse R., Frochot C., Guillemin F., Barberi-Heyob
M. Profil métabolique et stabilité d'un peptide ciblant la neuropiline-1 conjugué à un
photosensibilisateur : étude in vitro et in vivo. Nov 2007. Journée Claude Huriet de la
Recherche Médicale. Vandœuvre-lès-Nancy. Communication orale

Thomas N., Tirand L., Bechet D., Vanderesse R., Plénat F., Frochot C., Guillemin F.,
Barberi-Heyob M. Metabolic profile and in vivo stability of a peptide-conjugated chlorin-type
th photosensitiser targeting neuropilin-1: Interest of pseudopeptides. 1-6 Sept 2007. 12
Congress of ESP. Bath (Grande Bretagne). Communication par affiche

Thomas N., Tirand L., Vanderesse R., Frochot C., Guillemin F., Barberi-Heyob M. Etude de
l’affinité de pseudopeptides vis-à-vis des récepteurs au VEGF : Vers l’élaboration de
médicaments photo-activables conjugués plus stables pour des applications en thérapie
photodynamique anticancéreuse. 20-25 Mai 2007. 15°Congrès Peptides et Protéines. Dinard
(France). Communication par affiche

Thomas N., Tirand L., Chatelut E., Dodeller M., Frochot C., Guillemin F., Barberi-Heyob M.
A chlorin-ATWLPPR conjugate as new neuropilin-1-targeting photosensitizer designed to
potentiate the vascular effect of PDT : pharmacokinetic and biodistribution analysis. 10-14
Oct 2006. 6th International Symposium on Photodynamic Diagnosis and Therapy in
Clinical Practice. Brixen (Italie). Communication par affiche



Table des matières
Liste des tableaux ..................................................................................................................... 1
Liste des figures ........................................................................................................................ 2
Liste des abréviations............................................................................................................... 4
Introduction .............................................................................................................................. 7
Chapitre I : Synthèse bibliographique ................................................................................. 11
I. Thérapie photodynamique.............................................................................................11
I.1 Rappel historique et principe................................................................................
I.2 Réactions photochimiques....................................................................................12
I.3 Le photosensibilisateur idéal16
I.4 Mécanismes de l’éradication tumorale après thérapie photodynamique ............. 20
II. L’angiogenèse tumorale.................................................................................................24
II.1 Définition et mécanismes de l’angiogenèse tumorale.......................................... 24
II.2 Facteurs pro- et anti-angiogéniques ..................................................................... 27
II.3 Caractéristiques des vaisseaux tumoraux............................................................. 31
III. Le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF)............................................... 33
III.1 Le VEGF et la famille du VEGF.......................................................................... 33
III.2 Les récepteurs au VEGF ...................................................................................... 38
IV. Ciblage des photosensibilisateurs..................................................................................47
IV.1 Ciblage passif.......................................................................................................47
IV.2 Ciblage actif.........................................................................................................54
IV.3 Intérêt des ligands peptidiques dans les stratégies de ciblage en thérapie
photodynamique............................................................................................................... 66
V. Stratégies pour améliorer la stabilité peptidique............................................................ 87
V.1 Introduction..........................................................................................................87
V.2 Peptides modifiés.................................................................................................88
V.3 Pseudopeptides.....................................................................................................93
V.4 Peptidomimétiques...............................................................................................97
Chapitre II : Etude comparative de la TPC versus TPC-Ahx-ATWLPPR in vitro et in
vivo ........................................................................................................................................... 99
I. Résumé........................................................................................................................... 99
II. “Peptide-conjugated chlorine-type photosensitizer binds neuropilin-1 in vitro and in
vivo” 99
Chapitre III : Stabilité in vitro et in vivo de la TPC-Ahx-ATWLPPR ............................ 121
I. Résumé... 121
II. “Metabolic Profile of a Peptide-Conjugated Chlorin-Type Photosensitizer Targeting
Neuropilin-1: An in Vivo and in Vitro Study”...................................................................... 122


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