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Aus der Klinik für Augenheilkunde mit Poliklinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. F. E. Kruse Tumor-associated lymphangiogenesis in conjunctival malignant melanoma Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnbergvorgelegt von Paul Zimmermann aus Münchberg
Gedruckt mit Erlaubnis derMedizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Dekan:Prof. Dr. J. Schüttler Referent:Priv.-Doz. Dr. Claus Cursiefen Korreferent:Prof. Dr. F. E.Kruse Tag der mündlichen Prüfung: 27. Januar 2010   
Meine Dissertation widme ich meiner Tochter Paula-Greta.
Tumor-associated lymphangiogenesis in conjunctival malignant melanoma - Inhaltsverzeichnis:
Zusammenfassung in Englisch (abstract) Zusammenfassung Einleitung in Englisch (Introduction) Einleitung Titelblatt Zusammenfassung/ Abstract Einleitung Material und Methoden
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Seite 8 (Seite 1 Artikel)Seite 9 (Seite 2 Artikel) Seite 10-11 (Seite 3-4 Artikel) Seite 12-14 (Seite 5-7 Artikel) Patienten und BindegewebsschnitteSeite 12 (Seite 5 Artikel)  (LYVE-1 and podoplanin) LymphgefäßfärbungSeite 12-13 (Seite 5-6 Artikel)  Färbung Ki67Seite 13 (Seite 6 Artikel)  Mitomycin C BehandlungSeite 13 (Seite 6 Artikel)  und Computer-gestützte Lymphgefäßanalyse MikroskopischeSeite 13-14 (Seite 6-7 Artikel)  und statistische Analyse FunktionelleSeite 14 (Seite 7 Artikel) Resultate/ErgebnisseSeite 15-17 (Seite 8-10 Artikel) Seite 15
 Patienten und histopathologische Charakteristika
 Melanome der Bindehaut bilden intra- und Maligne peritumoral Lymphgefäße aus  Melanome der Bindehaut sind Maligne assoziiert mit intra-und peritumoraler Lymphangiogenese  des Tumordurchmessers auf die Lymphgefäße Einfluss
 der Mitomycin C Therapie auf die Lymphgefäße Effekt
 Analyse der Lymphgefäße in Abhängigkeit der Tumorlokalisation Diskussion Resümee/ Schlussfolgerung
Competing interests
LiteraturverzeichnisAbbildungsverzeichnis mit Legenden
 Abbildung 1: Tumor-assozierte Lymphgefäße des Malignen Melanoms der Bindehaut  Abbildung 2: Tumor induzierte Lymphangiogenese: Signifikant mehr proliferierende Lymphgefäße wurden im Tumor und in der direkten Umgebung als in der weiter entfernten Bindehaut (> 300μm) gefunden  Abbildung 3: Einfluss des Tumordurchmessers auf die Lymphgefäße Abbildung 4: Einfluss des topischen Mitomycin C auf die Lymphgefäße Abbildung 5: Analyse der Lymphgefäße in Abhängigkeit der Tumorlokalisation
(Seite 8 Artikel) Seite 15 (Seite 8 Artikel) Seite 16 (Seite 9 Artikel) Seite 16 (Seite 9 Artikel) Seite 17 (Seite 10 Artikel) Seite 17 (Seite 10 Artikel) Seite 18-20 (Seite 11-13 Artikel) Seite 20 (Seite 13 Artikel) Seite 20 (Seite 13 Artikel) Seite 21-22 (Seite 14-15 Artikel) Seite 23-25 (Seite 16-18 Artikel) Seite 23 (Seite 16 Artikel) Seite 23-24 (Seite 16-17 Artikel) Seite 24 (Seite 17 Artikel) Seite 24 (Seite 17 Artikel) Seite 24-25 (Seite 17-18 Artikel)
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Abbildungen:  Abbildung 1  Abbildung 2  3 Abbildung  4 Abbildung  Abbildung 5 LiteraturverzeichnisAbkürzungsverzeichnisVerzeichnis der Vorveröffentlichungen Anhang Danksagung Lebenslauf     P.S.: Die Seitenzahlen in Klammern beziehen sich auf die Seitenzahlen der Veröffentlichung des Orginalartikels im BJO (British Journal of Ophthalmology).    
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  Abstract:Background: To evaluate whether tumor-associated lymphangiogenesis, i.e. the formation of new lymphatic vessels (LVs) induced by a tumor, occurs in and around conjunctival malignant melanoma (MM). Methods: Clinical files and conjunctival specimens of 20 patients with histologically diagnosed conjunctival MM were analyzed. Sections were stained with LYVE-1 and podoplanin antibodies as specific lymphatic endothelial markers and Ki67 as proliferation marker. The tumor area and the area covered by LV (LVA), the LV number (LVN), and the LV density (LVD) were measured within the tumor and in the peritumoral area in digital images of the specimen. The LV results were correlated with the histopathological characteristics, tumor location, recurrence rate, mitomycin C therapy and presence of metastases. Results: LVs were detected in all specimens within the tumor and peritumorally. Significantly more Ki67+ proliferating lymphatic endothelial cells were detected in the tumor and in the peritumoral tissue up to 300μm compared to the surrounding normal conjunctiva (>300μm distance). There was a slightly positive correlation between the tumor size and the LVN and LVA in the 50μm zone adjacent to the tumor. We did not find significant correlations between LVs and histopathological and clinical characteristics (location, shape, relapses, metastases), possibly due to small sample sizes. Non-limbal tumors with involvement of tarsus or fornix showed a tendency of higher LVD compared to limbal tumors. Conclusion: Conjunctival MMs display tumor-associated LV within and around the tumor. The MM seems to induce lymphangiogenesis not only in the tumor, but also in its proximity.
 Zusammenfassung:Hintergrund und Ziele: Maligne Melanome der Bindehaut sind mit Lymphangiogenese, i.e. die Ausbildung neuer Lymphgefäße, assoziiert. Ziel der Studie war es, herauszufinden, ob Tumor- assoziierte Lymphangiogenese im Tumor, als auch in der peritumoralen Region auftritt. Methoden (Patienten, Material und Untersuchungsmethoden): Der klinische Casus als auch die histologischen Schnitte der Bindehaut von 20 Patientinnen/-en der Augenklinik Nürnberg-Erlangen wurden analysiert. Die histologischen Schnitte wurden mit LYVE-1 und Podoplanin Antikörper als spezifische Lymphendothelmarker und mit Ki67 als Proliferationsmarker gefärbt. Die Tumorfläche, die Lymphgefäßfläche (LVA= Lymphatic Vessel Area), die Anzahl der Lymphgefäße (LVN= Lymphatic Vessel Number) und die Lymphgefäßdichte (LVD= Lymphatic Vessel Density) wurden im Tumor und in der Tumorumgebung anhand von digitalen Bildern ausgemessen. Die Ergebnisse wurden mit den histopathologischen Eigenschaften, der Tumorlokalisation, der Rezidivrate, der Mitomycin C Therapie und dem Auftreten von Metastasen korreliert. Ergebnisse: Lymphgefäße konnten in allen histologischen Schnitten sowohl im Tumor als auch in der Umgebung des Tumors nachgewiesen werden. Signifikant mehr Ki67 positive proliferierende Lymphendothelzellen konnten im Tumor und in der Tumornähe (<300µm) als in der normalen Bindehaut (>300μm) nachgewiesen werden. Es zeigte sich eine tendenzielle positive Korrelation zwischen der Tumorgröße und der Fläche als auch der Anzahl der Lymphgefäße in der 50µm peritumoralen Zone. Wir konnten keine signifikanten Korrelationen zwischen den histopathologischen und den klinischen Charakteristika (Lokalisation, Wachstum, Rezidive und Metastasen) verifizieren, möglicherweise auch
 3 aufgrund der geringen Patientenanzahl. Nicht am Limbus lokalisierte Tumoren, die in den Tarsus oder Fornix vordrangen, zeigten eine tendenziell höhere Lymphgefäßdichte als Tumoren am Limbus. Praktische Schlussfolgerung:
Maligne Melanome der Bindehaut zeigten Tumor-assozierte Lymphangiogenese innerhalb und in der Umgebung des Tumors. Das Maligne Melanom der Bindehaut scheint nicht nur im Tumor, sondern auch in der näheren Umgebung Lymphangiogenese, i.e. die Lymphgefäßneubildung, zu induzieren.
 Introduction:Malignant melanomas (MMs) of the conjunctiva are associated with significant morbidity and mortality due to high rates of recurrence and metastasis. The dissemination of the tumor is linked to regional lymph nodes with subsequent distant metastasis.to cutaneous MM, conjunctival MM is rare. TheCompared annual age adjusted incidence rates (per million) vary from 0.15 in Asians to 0.5 in non-Hispanic Whites. Up to date, there are only few features recognized as prognostic factors for conjunctival MM: Tumor location, expansion, relapse, multifocal location, involvement of the surgical margins and tumor depth are known prognostic factors for metastatic disease. Histopathological characteristics seem not to be consistently associated with the clinical outcome. The primary treatment of conjunctival MM is surgical: Complete excision with tumor-cell free margins represents the therapy of choice, but can not be sufficiently performed in cases of diffuse growth. Topical mitomycin C as adjunct therapy has been established; cryotherapy, laser ablation, radiation treatment, and chemotherapy in case of metastasis represent additional treatment options for conjunctival MM. Conjunctival MMs are rich in blood vessels, which play a role in systemic hematogenous metastasis. However, the main route of metastasis of conjunctival MM is lymphogenic: Ultrasonic examination of the draining lymph nodes or even surgical removal of the sentinel lymph nodes has been recommended. Up to now, it was not known, whether conjunctival MMs also display significant tumor-associated lymphangiogenesis, i.e. whether the tumor induces formation of new lymphatic vessels. The extent of lymph node metastasis is supposed to be a major determinant for prognosis and staging of tumors and it has been shown that tumor-induced lymphangiogenesis is a strong risk factor for tumor metastasis in different human cancers. The importance of tumor-induced lymphangiogenesis for lymphogenic metastasis in cutaneous MM has been shown recently.
 5 Purpose of this study was to analyze whether conjunctival MMs also display tumor-induced lymphangiogenesis, which may represent a possible new prognostic factor. We used specific lymphatic endothelial markers to analyze the presence of LVs in the tumor itself and in the adjacent tissue and correlated these data with the clinical outcome and histopathological characteristics of the tumors.