Tumour cell induced leukocyte migration in Hodgkin Lymphoma (HL) [Elektronische Ressource] : prognostic impact of T-cell subsets, B-cells and Epstein-Barr virus (EBV) infection in HL / vorgelegt von Sabine Schreck

De
Tumour cell induced leukocyte migration in Hodgkin Lymphoma (HL): prognostic impact of T-cell subsets, B-cells and Epstein-Barr virus (EBV)-infection in HL Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander Universität Erlangen Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades vorgelegt von Sabine Schreck aus Nürnberg Als Dissertation genehmigt von der Naturwissen- schaftlichen Fakultät der Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 26.05.2008 Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch Erstberichterstatter: Prof. Dr. Thomas Winkler Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Gerald Niedobitek 1 Widmung Meinem Vater (1949-2007) 2 Danksagung: Ich möchte gerne Dank sagen für die Unterstützung, die mir viele Menschen während dieser Arbeit entgegen gebracht haben. An erster Stelle möchte ich mich bei meinem Betreuer und Arbeitsgruppenleiter Prof. Dr. med. Gerald Niedobitek ganz herzlich für die Möglichkeit bedanken, an diesem interessanten Themengebiet zu forschen. Ebenso danke ich ihm für das angenehme Arbeitsklima in seiner Arbeitsgruppe. Bei Prof. Dr. rer. nat. Thomas Winkler möchte ich mich für die Bereitschaft bedanken, diese Promotionsarbeit von Seiten der naturwissenschaftlichen Fakultät zu betreuen. Dem Graduiertenkolleg 1071 „Viren des Immunsystems“ und seinem Sprecher Prof. Dr. med.
Publié le : mardi 1 janvier 2008
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Tumour cell induced leukocyte migration in Hodgkin
Lymphoma (HL):
prognostic impact of T-cell subsets, B-cells and Epstein-Barr
virus (EBV)-infection in HL







Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander Universität Erlangen Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades


vorgelegt von
Sabine Schreck
aus Nürnberg






Als Dissertation genehmigt von der Naturwissen-
schaftlichen Fakultät der Universität Erlangen-Nürnberg






Tag der mündlichen Prüfung: 26.05.2008



Vorsitzender
der Promotionskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch

Erstberichterstatter: Prof. Dr. Thomas Winkler

Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Gerald Niedobitek
1
Widmung





Meinem Vater
(1949-2007)
2
Danksagung:

Ich möchte gerne Dank sagen für die Unterstützung, die mir viele Menschen während dieser
Arbeit entgegen gebracht haben.

An erster Stelle möchte ich mich bei meinem Betreuer und Arbeitsgruppenleiter Prof. Dr.
med. Gerald Niedobitek ganz herzlich für die Möglichkeit bedanken, an diesem interessanten
Themengebiet zu forschen. Ebenso danke ich ihm für das angenehme Arbeitsklima in seiner
Arbeitsgruppe.

Bei Prof. Dr. rer. nat. Thomas Winkler möchte ich mich für die Bereitschaft bedanken, diese
Promotionsarbeit von Seiten der naturwissenschaftlichen Fakultät zu betreuen.

Dem Graduiertenkolleg 1071 „Viren des Immunsystems“ und seinem Sprecher Prof. Dr. med.
Bernhard Fleckenstein, sowie der Deutschen Forschungsgesellschaft DFG möchte ich Dank
sagen für das 3jährige Stipendium, durch welches es mir ermöglicht wurde, meine Promotion
am Pathologischen Institut in Erlangen durchzuführen.

Bei PD. Dr. Brigitte Biesinger-Zwosta möchte ich mich für die Unterstützung im Vorfeld
dieser Promotionsarbeit bedanken.

Bei Prof. Dr. med. G. Grabenbauer und Dr. med. Luitpold Distel möchte ich mich für die
Unterstützung bei den statistischen Auswertungen und der Datenarchivierung aus dem TUZ
bedanken.

Besonderer Dank gilt allen momentanen und ehemaligen Mitarbeitern meiner Arbeitsgruppe
insbesondere Dr. med. Maike Buettner.

Meinen Eltern und Großeltern danke ich für die Unterstützung in den letzten 3 Jahren.

Ganz besonders möchte ich mich bei meinem Lebensgefährten Markus für den stetigen
Rückhalt bedanken. 3
Zitat









Leben ist das,

was passiert,

während wir

noch planen

(John Lennon)


Contents 4
Contents


1 Summary 13

1.1 Background 13

1.2 Hypothesis I 13

1.3 Experimental design I 13

1.4 Results I 14

1.5 Conclusions I 14

1.6 Background II 15

1.7 Hypothesis II 15

1.8 Experimental design II 15

1.9 Results I 16

1.10 Conclusions I 16

2 Introduction 22

2.1 The Epstein Barr virus (EBV) 22
2.1.1 History and biology 22
2.1.2 Structre 2
2.1.3 Primary infection 23

2.2 Hodgkin lymphoma (HL) 24
2.2.1 Epidemiology
2.2.2 Classification and histopathology of HL 24
2.2.3 Genotype and phenotype of neoplastic Hodgkin and Reed-Sternberg 26
(HRS) cells
2.2.4 EBV-associated Hodgkin lymphoma 26
2.2.4.1 EBV genes expressed in latency II and tumourigenesis 26
2.2.4.2 EBV-infection of HRS cells 27
2.2.5 Tumour-infiltrating lymphocytes (TIL) in HL 28

2.3 Imune cls 29
2.3.1 T-lymphocytes 30
2.3.2 B-lym
2.3.3 Activation of T-cells after contact with foreign antigen 31
2.3.4 Regulatory T-cells (Treg) 32
2.3.4.1 Characterisation of Treg 33
2.3.4.2 The forkhead transcription factor FoxP3 34
2.3.4.3 Suppression of effector T-cells by Treg 34
Contents 5
2.4 Tumour-infiltrating lymphocytes and their prognostic influence 35
2.4.1 T-lymphocytes in tumours 35
+2.4.1.1 CD8 cytotoxic T-lymphocytes (CTL) and Granzyme B 35
in the prognosis of tumours
+2.4.1.2 CD4 T-cells 36
+2.4.1.2.1 CD4 Th1-cells 37
+2.4.1.2.2. CD4Th2-ce
2.4.1.2.3 Treg in malignant diseases 38
2.4.1.2.4 Depletion of Treg 39
2.4.2 B-lymphocytes in tumours 40

2.5 Secondary malignancies after HL 41

2.6 Immunotherapeutic approaches in the treatment of HL using EBV- 41
specific CTL

2.7 Chemokines critical for the recruitment of lymphocytes 42
2.7.1 Structural classification 42
2.7.2 Functional 43
2.7.3 Examples of chemokines
2.7.3.1 RANTES/CL5 43
2.7.3.2 TARC/CCL17 44
2.7.3.3 MDC/L2 4

2.8 Hypothes 45
2.8.2 Hypothesis I 45
2.8.3 II

2.9 AID project 46
2.9.1 Activation induced cytidine deaminase (AID) 46
2.9.2 AID in the development of tumours 47
2.9.3 Testicular cancer 47
2.9.4 Spermatogenesis
2.9.5 Hypothesis 48

3 Results 49

3.1 Prognostic impact of tumour-infiltrating T-cells and EBV in HL 49
3.1.1 Validation of antibodies directed against FoxP3, c-Maf and T-bet 49
3.1.2 Expression of FoxP3, T-bet, c-Maf and Epstein-Barr viral transcripts 52
in Hodgkin lymphoma
+ +3.1.3 CD20 and CD21 lymphoid follicles in HL 54
3.1.4 Definition of cut-offs used for Kaplan Meier analyses 55
3.1.5 T-cell subsets, EBV-status and prognosis of HL 58
+ +3.1.6 CD20 and CD21 lymphoid follicles in HL and prognosis 61

3.2 Tumour cell induced leukocyte migration in HL 64
3.2.1 Recruitment of TIL through production of chemokines and cytokines 64
by HRS cells
3.2.1.1 Production of chemokines and cytokines in HRS cells of cHL 64
biopsies Contents 6
3.2.1.2 Detection of chemokines and cytokines in HL derived cell 66
lines with RNAse protection assay (RPA)
3.2.1.3 okines in HL derived cell lines with 68
Sandwich ELISA
3.2.2 Determination of EBV-status in EBV-infected KHM-2 cells 69
3.2.3 Chemotaxis assay with peripheral blood mononuclear cells (PBMC) 70
from healthy individuals and HL patients in comparison
3.2.4 Composition of PBMC from healthy individuals and HL patients 71
3.2.5 Analyses of PBMC composition after chemotaxis assay 73

3.3 AID project 75
3.3.1AID expression in normal spermatogenesis 75
3.3.2 AID expression in intratubular germ cell neoplasia unclassified 77
(IGCNU) and testicular germ cell tumours

4 Discussion 79

4.1 Prognostic impact of tumour-infiltrating T-cells and EBV in HL 79
4.1.1 Validation of antibodies directed against FoxP3, c-Maf and T-bet 80
4.1.2 Expression of GrB, T-bet, c-Maf and FoxP3 in Hodgkin lymphoma 82
4.1.3 T-cell subsets and prognosis of HL 82
4.1.4 EBV and prognosis of HL 84
4.1.5 Influence of B-lymphocytes on the prognosis of HL patients 85

4.2 Tumour cell induced leukocyte migration in HL 87
4.2.1 Detection of chemokines in HL derived cell lines and HL biopsies 87
4.2.2 Comparison of KMH-2 cells and KMH2-EBV cells 89
4.2.3 Migration of PBMC from healthy donors 90
4.2.4 HL patient PBMC 91

4.3 AID project 94

5 Material and Methods 96

5.1 Material 96
5.1.1 Reagents and devices 96
5.1.2 Tisue samples 96
5.1.3 Cell lin 7

5.2 Methods 98

5.2.1 Immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence 98
5.2.2 In situ hybridisation (IsH) 99
5.2.3 Computer assisted microscopic analysis and Kaplan Meier analysis 101
5.2.4 RNAse protection assay (RPA) 102
5.2.5 Chemoattractants
5.2.5.1 Generation of cell culture supernatants 102
5.2.5.2 Sandwich ELISA 103
5.2.6 Human PBMC Contents 7
5.2.7 Flow cytometry 104
5.2.8 Chemotaxis assay 105
5.2.9 Cytospins

5.3 AID project 106
5.3.1 Tissue samples
5.3.2 Immunohistochemistry and immunofluorescence 106
5.3.3 Cell lines 107
5.3.4 Intracellular staining and flow cytometry 107
5.3.5 Reverse transcriptase (RT-) polymerase chain reaction (PCR) 108

5 Bibliography 110

5.1 List of abbreviation 110

5.2 of tables 112

5.3 List of figures 113

5.4 of literature 114

6 Supplement to material and methods 126

6.1 Supplement to material 126
7.1.1 Reagents IHC
7.1.2 Antibodies 127
7.1.3 Mixtures for IHC 128
7.1.4 Probes, vectors, cloning and kits
7.1.5 Reagents IsH 128
7.1.6 Mixtures for 130
7.1.7 Primer AID RT-PCR
7.1.8 Reagents RT-PCR 130
7.1.9 Cell culture, flow cytometry, chemotaxis assay and buffy coat 131
7.1.10 Sandwich ELISA 132
7.1.11 Mixtures für 133
7.1.12 Antibodies for flow cytometry
7.1.13 for cytometry 134
7.1.14 Reagents RPA
7.1.15 Run Gel for 135
7.1.16 Equipment
7.1.17 Companies 136

7.2 Supplement to methods 137
7.2.1 IHC
7.2.1.1 Immunohistochemical staining 137
7.2.1.2 idouble staining 138
7.2.1.3 Immunufluorescent double 139
7.2.2 IsH 140
7.2.2.1 Probe synthesis
7.2.2.2 IsH with radioactive labelled probes 141
7.2.3 RNAse protection assay 142 Inhaltsübersicht 8
Inhaltsübersicht


1 Zusammenfassung 17

1.1 Hintergrund I 17

1.2 Hypothese I 17

1.3 Methoden I 18

1.4 Ergebnise I 18

1.5 Schlussfolgerung I 19

1.6 Hintergrund II 19

1.7 Hypothes I 19

1.8 Methoden II 20

1.9 Ergebnise I 20

1.10 Schlussfolgerung II 21

2 Einleitung 22

2.1 Das Epstein-Barr Virus (EBV) 22
2.1.1 Historie und Biologie
2.1.2 Struktur 22
2.1.3 Primärinfektion und Persistenz 23

2.2 Hodgkin lymphoma (HL) 24
2.2.1 Epidemiologie
2.2.2 Klassifikation und Histopathologie 24
2.2.3 Genotyp und Phänotyp neoplastischer Hodgkin und Reed-Sternberg 26
(HRS) Zellen
2.2.4 EBV-assoziiertes Hodgkin Lymphom 26
2.2.4.1 EBV-Gene während Latenzphase II und Tumorgenese 26
2.2.4.2 EBV-Infektion in HRS Zellen 27
2.2.5 Tumor-infiltrierende Lymphozyten (TIL) im HL 28

2.3 Immunzellen 29
2.3.1 T-Lymphozyten 30
2.3.2 B-Lymphozyten
2.3.3 Aktivierung von T-Zellen nach Antigenkontakt 31
2.3.4 Regulatorische T-Zellen (Treg) 32
2.3.4.1 Charakterisierung von Treg 33
2.3.4.2 Forkhead Transcriptionsfaktor FoxP3 34
2.3.5.3 Unterdrückung von Effektor Zellen durch Treg 34

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