Validation d'outils moléculaires pour la cancérologie clinique : Etude de l'expression des récepteurs aux rétinoïdes dans les cancers bronchiques, Signalling with Retinoids in the Human Lung : Validation of New Tools for the Expression Study of Retinoids Receptors

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Sous la direction de Nadine Martinet
Thèse soutenue le 12 juin 2009: Nancy 1
Les Récepteurs aux Rétinoïdes sont impliqués dans le développement et dans l’homéostasie cellulaire. Des altérations de leurs expressions ont été observées dans les cancers bronchiques. Cependant, les essais de chimioprévention utilisant les rétinoïdes dans des populations à risques ont échoué. Par conséquent, avant de procéder à de nouveaux essais cliniques utilisant des rétinoïdes de seconde génération, il apparaît nécessaire de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la signalisation des rétinoïdes. Tel est ici notre objectif en présentant la validation d’outils de recherches destinés à l’étude de ces récepteurs, et en particulier à celle du Récepteur à l’Acide Rétinoïque ß, dont le rôle majeur dans le cancer du poumon est documenté. Des outils bioinformatiques ont été utilisés afin de reconstituer in silico l’organisation génomique de RARß. Les caractéristiques d’un promoteur potentiel P1’-RARß ont été étudiées expérimentalement. Des mesures spécifiques, réalisées dans des essais de qRT-PCR Syber Green et avec un triplex de sondes Taqman, ont été validées extensivement afin d’établir des valeurs de référence de l’expression ARNm des Récepteurs aux Rétinoïdes dans les cellules épithéliales bronchiques humaines normales. Les expressions relatives des différentes isoformes ARNm RRs ont ensuite été quantifiées dans des échantillons de tumeurs bronchiques ainsi que dans plusieurs lignées de cellules cancéreuses. Enfin, un anticorps reconnaissant toutes les isoformes protéiques RARß, a été conçu et validé extensivement par western-blot et immunoprécipitation. Aucune activité promotrice n’a pu être démontrée pour P1’-RARß. Une augmentation des quantités d’ARNm P2-RARß signe la différenciation normale de l’épithélium bronchique, alors qu’une diminution significative de ces ARNm est observée dans la plupart des lignées de cellules cancéreuses bronchiques. Une sous-régulation concomitante de RARß et RXRß a également été mise en évidence dans les tumeurs bronchiques. En utilisant des extraits nucléaires de cellules BEAS-2B et de cellules bronchiques normales, seule l’isoforme protéique longue RARß2 a été reconnue par notre anticorps. Un traitement rigoureux des échantillons ainsi qu’une analyse bioinformatique exhaustive sont les points clés de cette étude. Des valeurs ARNm de référence ainsi que des outils validés sont maintenant disponibles pour faire progresser la recherche sur le signal rétinoïde dans les cellules bronchiques.
-Récepteurs aux rétinoïdes
Retinoid Receptors are involved in development and cell homeostasis. Alterations of their expressions have been observed in lung cancer. However, retinoid chemoprevention trials in populations at risk to develop such tumours have failed. Therefore, the pertinence of new clinical trials using second generation retinoids requires prior better understanding of the molecular mechanisms involved in the retinoid signalling. This is our aim when validating extensively research tools, focused on the Retinoic Acid Receptor ß, whose major role in lung cancer is documented. Biocomputing was used to draw in silico an updated RARß genomic organisation. Features of a putative P1'-RARß promoter were investigated experimentally. Specific measures realised, with qRT-PCR Syber Green assays and a triplex of Taqman probes, were extensively validated to establish Retinoid Receptors mRNAs reference values for normal human bronchial epithelial cells. Relative expressions of the different RRs mRNA isoforms were further quantified in lung tumour samples and in several cancer cell lines. Finally, an antibody recognising all the RARß protein isoforms, was generated and extensively validated by western-blot and immunoprecipitation. No promoter-like activity was found for P1'-RARß. P2-RARß mRNA increase signs the normal differentiation of the human bronchial epithelium while a significant decrease is observed in most lung cancer cell lines. Accordingly, it is also, along with RXRß, down-regulated in lung tumours. When using nuclear extracts of BEAS-2B and normal lung cells, only the P2-long RARß2 protein isoform was recognised by our antibody. Rigorous samples processing and extensive biocomputing, were the key factors for this study. mRNA reference values and validated tools are now available to advance researches on retinoid signalling in the lung.
Source: http://www.theses.fr/2009NAN10038/document
Publié le : vendredi 28 octobre 2011
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http://www.culture.gouv.fr/culture/infos-pratiques/droits/protection.htm École Doctorale Biologie, Santé, et Environnement (BioSE)
___________________________________________________________________________
Thèse
présentée pour l’obtention du
Doctorat de l’Université Henri Poincaré
Mention Biologie Cellulaire et Nutrition
par Stéphane Poulain
Validation d’outils moléculaires pour la cancérologie clinique
Étude de l’expression des récepteurs aux rétinoïdes dans les
cancers bronchiques
Soutenue publiquement le 12 Juin 2009
Membres du j ury :
Rapporteurs :
Dr. Caroline Leroux, Directrice de Recherches INRA (HDR), Lyon
Dr. Christian Bronner, Chargé de Recherches INSERM (HDR), Strasbourg
Examinateurs :
Dr. Nadine Martinet, Directrice de Recherches INSERM, Paris - Nancy (Directrice de thèse)
Dr. Marie-Christiane Carré, Chargée de Recherches INSERM, Nancy
Dr. Stanislas du Manoir, Chargé de Recherches INSERM, Strasbourg
Pr. Jean-Michel Vignaud, Responsable du Centre de Ressources Biologiques, C HU de Nancy
et Représentant de l’Unité 724 INSERM, Faculté de Médecine de Nancy (Président du jury)
___________________________________________________________________________
Centre de Ressources Biologiques du Centre Hospitalier Universitaire de Nancy
Laboratoire de Pathologie Cellulaire et Moléculaire en Nutrition, INSERM U724
Faculté de Médecine – 54505 Vandoeuvre-lès-NancyREMERCIEMENTS
Je tiens tout d’abord à remercier la Région Lorraine et l’INSERM qui m’ont soutenu
financièrement ainsi que le CHU de Nancy et la Faculté de Médecine de Nancy qui m’ont
employé durant mes études doctorales, ils ont ainsi rendu ce travail possible.
Mes remerciements vont tout particulièrement au Dr. Nadine Martinet, qui m’a donné
la chance de procéder à ce travail de thèse, pour tout ce qu’elle m’a appris d’un point de vue
professionnel et d’un point de vue personnel, pour m’avoir toujours sout enu, aidé, et surtout
pour m’avoir toujours poussé vers l’avant afin de progresser. Son travai l de Recherches ainsi
que la vision du Métier qu’elle m’a inculqué sont et seront toujours pour m oi un exemple à
suivre.
Je remercie également le Pr. Jean-Louis Guéant, directeur de l’Unité 724 INSERM et
le Pr. Jean-Michel Vignaud, responsable du Centre de Ressources Biologique s du CHU de
Nancy, ainsi que tous les membres de leurs équipes qui m’ont accueilli dans le urs laboratoires
et avec qui j’ai beaucoup apprécié travailler.
Je remercie les membres du jury pour avoir accepté de jeuget pourr ce l teraurvail
patience : le Dr. Caroline Leroux, le Dr. Christian Bronner ainsi que le Dr. Stanislas du
Manoir.
Je remercie le Dr. Marie-Christiane Carré et les équipes du DCPR de l’ENSIC de
Nancy qui m’ont accueilli en stage dans leur laboratoire, ainsi que le Dr. Catheri ne Gouyette
qui nous a reçu à la plate-forme de synthèse d’oligonucléotides de l’Institut Pasteur de Paris.
Je remercie le Dr. Bon-Chu Chung de l’Institut de Biologie Molé culaire de
l’Academia Sinica de Taipei ainsi que le Dr. Pan-Chyr Yang du Centre de M édecine
Génomique de l’Université Nationale de Taiwan et le Dr. Tsu-Chung Chang du Labora toire
de Biochimie du National Defence Medical Center de Taipei, ainsi que tous les membres de
leurs équipes de recherches pour m’avoir accueilli chaleureusement.
Je remercie également les stagiaires que j’ai :e ncAahmdréed, Charlotte, Nicol as,
Imad et Maoussi, ainsi que les personnels d’Eurogentec, Labgene, Stratage ne, Qiagen et
Applied Biosystems pour m’avoir aidé dans mon travail.
Je remercie mes a m: isMick&Patricia, Vincent, Raymond, Cyril, Darya et tous les
autres, ainsi que tous mes collègues de fac avec qui j’ai partagé beaucoup d’instants
mémorables au cours de mes années d’études.
Je remercie enfin mes parents, mes grands-parents ainsi que toute m a famille, pour
avoir toujours cru en moi et pour avoir toujours été là pour moi quand j ’avais besoin d’eux.
Ce travail est également pour vous.

2Sommaire
INTRODUCTION.......................................................................... p.17
A. PRÉAMBULE........................................................................................... p.18
B. LE CANCER DU POUMON.................................................................... p.22
1. ANATOMIE, HISTOLOGIE ET FONCTIONS PRINCIPALES DU POUMON
NORMAL…………………………………………………………………………………. p.22
2. ÉPIDÉMIOLOGIE DU CANCER BRONCHIQUE NON-À PETITES
CELLULES .......................................................................................................................... p.24
2.1. Incidence et mortalité du cancer du poumon............................................................. p.24
2.2. Les facteurs de risques………………………………………………………………. p.26
2.2.1. Le tabagisme…………………………………………………………………p.27
2.2.1.1. Tabagisme actif……………………………………………………. p.27
2.2.1.2. Tabagisme passif……………………………………………...........p.32
2.2.2. L’amiante…………………………………………………………………..... p.33
2.2.3. Le radon……………………………………………………………………....p.33
2.2.4. Les facteurs de risque professionnels………………………………………... p.34
2.2.5. Le régime alimentaire………………………………………........................... p.34
2.2.6. Les susceptibilités génétiques……………………………………………...... p.36
2.2.7. Autres facteurs de risque…………………………………………………….. p.37
3. TYPES HISTOLOGIQUES…………………………………………………………… p.37
3.1. Les cancers bronchiques non-à petites cellules…………………………………….. p.38
3.1.1. Adénocarcinomes……………………………………………………………. p.38
3.1.2. Carcinomes épidermoïdes………………………………………………........ p.40
3.1.3. Carcinomes à grandes cellules………………………………………………. p.41
3.2. Les cancers bronchiques à petites cellules………………………………………….. p.42
4. PROCESSUS DE CARCINOGÉNÈSE BRONCHIQUE............................................ p.43
4.1. Les différentes étapes de l’oncogénèse……………………………………………… p.44
4.2 Altérations génétiques………………………………………………………………... p.46
4.2.1. Oncogènes…………………………………………………………………… p.48
4.2.1.1. Gènes de la famille myc.................................................................... p.48
4.2.1.2. Gènes de la famille ras...................................................................... p.48
4.2.1.3. ErbB………………………………………………………………...p.49
34.2.1.4. Cyclooxygénases 1 et 2 (COX-1 et COX-2)……………………….p.49
4.2.1.5. Bombésine/gastrin releasing peptide (GRP)………………………. p.50
4.2.1.6. Bcl-2………………………………………………………………..p.50
4.2.2. Gènes suppresseurs de tumeurs……………………………………………… p.50
4.2.2.1. p53………………………………………………………………….p.51
4.2.2.2. Voie p16-Cycline D1-Rétinoblastome (Rb)………………………..p.51
4.3. Cascade métastatique………………………………………………………………...p.52
5. DIAGNOSTIC ET TRAITEMENT…………………………………………………... p.56
5.1. Stades de cancérisation selon la classification TNM……………………………….. p.57
5.2. Traitements……………………………………………………………………………p.59
5.2.1. Chirurgie……………………………………………………………………... p.59
5.2.2. Chimiothérapie………………………………………………………………. p.60
5.2.3. Radiothérapie………………………………………………………………... p.63
5.2.4. Autres traitements…………………………………………………………… p.64
C. LA VITAMINE A ET LES RÉTINOÏDES……………………………. p.66
1. GÉNÉRALITÉS………………………………………………………………………... p.66
1.1. Historique……………………………………………………………………………..p.66
1.2. Définitions et descriptionsp.67
1.3. Sources de Vit.A……………………………………………………………………… p.68
1.4. Rôles de la Vit.A/Rétinoïdes…………………………………………………………. p.73
2. MÉTABOLISME DE LA VIT.A/RÉTINOÏDES......................................................... p.75
D. LES RÉCEPTEURS AUX RÉTINOÏDES…………………………….. p.81
E. RÉTINOÏDES ET DÉVELOPPEMENT DU SYSTÈME
RESPIRATOIRE…………………………………………………………... p.88
F. MODÈLES DE SOURIS KNOCK-OUT POUR LES R ÉCEPTEURS
AUX RÉTINOÏDES ……………………………………………………….. p.92
G. R ÉCEPTEURS AUX RÉTINOÏDES ET CANCER DU
POUMON........................................................................................................p.94
H. R ÉCEPTEURS AUX RÉTINOÏDES ET LÉSIONS PRÉCURSEURSDE
L’ÉPITHÉLIUM BRONCHIQUE…………………………………........... p.96
4I. RÉTINOÏDES ET CHIMIOPRÉVENTION DES CANCERS
BRONCHIQUES……………………………………………………............ p.98
J. OBJECTIFS DU TRAVAIL…………………………………………... p.101
MATÉRIEL ET MÉTHODES………………………………... p.103
A. ORIGINE DES ÉCHANTILLONS BIOLOGIQUES ET CULTURE
CELLULAIRE............................................................................................. p.104
1. ÉCHANTILLONS DE TUMEURS BRONCHIQUES……………………………... p.104
2. ÉCHANTILLONS DE TRACHÉES HUMAINES NORMALES…………………. p.105
3. CELLULES ÉPITHÉLIALES BRONCHIQUES HUMAINES
DIFFÉRENCIÉES………………………………………………………………………. p.106
4. CELLULES ÉPITHÉLIALES BRONCHIQUES HUMAINES NON
DIFFÉRENCIÉES………………………………………………………….…………… p.107
5. CELLULES MUSCULAIRES LISSES……………………………………………... p.108
6. CELLULES DE L’ÉPIDERME……………………………………………………... p.108
7. LIGNÉES CELLULAIRES………………………………………………………….. p.108
B. ANALYSE DE L’EXPRESSION GÉNIQUE DES RÉCEPTEURS AUX
RÉTINOÏDES............................................................................................... p.110
1. EXTRACTION D’ARN TOTAL……………………………………………………. p.110
1.1. Principes…………………………………………………………………………….. p.110
1.2. Méthode……………………………………………………………………………...p.110
2. TRANSCRIPTION INVERSE DE L’ARN…………………………………………. p.113
2.1. Principes…………………………………………………………………………….. p.113
2.2. Méthode……………………………………………………………………………...p.113
3. AMPLIFICATION EN CHAÎNE DES ADNc……………………………………… p.114
3.1. Principes…………………………………………………………………………….. p.114
3.1.1. La Réaction de Polymérisation en Chaîne conventionnelle………………... p.114
3.1.2. La PCR quantitative en temps réel…………………………………………. p.118
3.1.3. Les systèmes de détection utilisés en qRT-PCR……..…….………………. p.119
3.1.3.1. Les agents intercalants……………………………………………. p.119
3.1.3.2. Les sondes fluorogéniques……………………………………….. p.121
3.1.3.2.1. Un principe de base : le quenching par effet FREp.121T……..
3.1.3.2.2. Les sondes d’hydrolyse ou sondes Taqman…………….. p.122
53.1.4. Les appareils de qRT-PCR…………………………………………………. p.125
3.1.4.1. Le thermocycleur…………………………………………………. p.127
3.1.4.2. Le module de détection fluorimétrique…………………………... p.129
3.1.4.3. La station de travail informatique………………………………… p.132
3.2. Méthode……………………………………………………………………………...p.133
3.2.1. Dessin des amorces de qRT-PCR et des sondes Taqman………………….. p.133
3.2.2. Synthèse des oligonucléotides……………………………………………… p.134
3.2.3. Essais de qRT-PCR Syber Green…………………………………………... p.135
3.2.4. Essais de qRT-PCR utilisant le triplex de sondes Taqman………………… p.136
4. QUANTIFICATION DE L’EXPRESSION DES RÉCEPTEURS AUX
RÉTINOÏDES…………………………………………………………………………… p.137
4.1. Principes…………………………………………………………………………….. p.137
4.1.1. Exploitation des courbes cinétiques………………………………………... p.137
4.1.1.1. Normalisation des mesures de fluorescence et ligne de basp.137e……..
4.1.1.2. Définition d’un seuil de fluorescence…………….………………. p.139
4.1.1.3. Détermination du cycle seuil……………………………………... p.139
4.1.2. Les bases mathématiques de la réaction de qRT-PCR……………………... p.140
4.1.2.1. Nature exponentielle de la réaction………………………………. p.140
4.1.2.2. Efficacité d’amplification………………………………………… p.140
4.1.3. Stratégies de quantification des acides nucléiques par qRT-PCRp.143…………..
4.1.3.1. Quantification « absolue » par étalonnage avec un standard……..p.143
4.1.3.1.1. Principes………………………………………………...p.143
4.1.3.1.2. Le standard……………………………………………... p.144
4.1.3.2. Quantification relative……………………………………………. p.145
4.1.3.2.1. Principes………………………………………………...p.145
4.1.3.2.2. Quantification relative avec standard externe (méthode des
courbes standards)………………………………………p.146
4.1.3.2.3. Méthode comparative des Ct…………………………… p.146
4.1.3.2.4. Méthode de Pfaffl………………………………………. p.147
4.2. Méthode……………………………………………………………………………...p.148
4.2.1. Analyse des données brutes………………………………………………… p.148
4.2.2. Analyse statistique………………………………………………………….. p.151
4.2.2.1. Logiciel Bestkeeper………………………………………………. p.151
4.2.2.2. Logiciel REST-RG………………………………………………..p.152
6C. ÉTUDE DE LA RÉGION GÉNOMIQUE RARβ…………………… p.153
1. TRANSCRITS NON VALIDÉS SITUÉS DANS LA RÉGION GÉNOMIQUE
RARβ……………………………………………………………………………………...p.153
1.1. Dessin des amorces de PCR....................................................................................... p.153
1.2. Amplification par RT-PCR des transcrits RARβ non validés…………………… p.153
2. ANALYSE in silico DES RÉGIONS PROMOTRICES POTENTIELLES SITUÉES
EN AMONT DES TRANSCRITS NON VALIDÉS…………………………………... p.155
3. CLONAGE DE LA RÉGION CONSERVÉE P1’-RARβ………………………….. p.156
3.1. Extraction de l’ADNg des CEBHD………………………………………………... p.156
3.2. Dessin des amorces de PCR………………………………………………………... p.157
3.3. Amplification par PCR de la région P1’-RARβ…………………………………...p.158
3.4. Purification des amplicons P1’-RARβ sens et inverse……………………………. p.158
3.5. Digestion enzymatique des amplicons P1’-RARβ sens et inverse……………….. p.160
3.6. Purification des inserts de clonage P1’-RARβ sens et inverse…………………… p.161
3.7. Description du vecteur de clonage…………………………………………………. p.161
3.8. Digestion enzymatique du vecteur de clonage…………………………………….. p.163
3.9. Ligation des inserts P1’-RARβ sens et inverse au vecteur de clonage…………... p.164
3.10. Transformation des bactéries…………………………………………………….. p.165
3.11. Sélection des bactéries transformées……………………………………………... p.166
3.12. Repiquage des bactéries transformées…………………………………………… p.166
3.13. Analyse des bactéries repiquées…………………………………………………... p.168
3.14. Purification des plasmides P1’-RARβ sens et inverse (Miniprep)…………….. p.168
3.15. Séquençage des plasmides P1’-RARβ sens et inverse…………………………… p.170
4. ANALYSE in vitro DE L’ACTIVITÉ DE LA RÉGION PROMOTRICE
POTENTIELLE P1’-RARβ…………………………………………………………….. p.172
4.1. Culture cellulaire……………………………………………………………………p.172
4.2. Transfection cellulaire……………………………………………………………… p.173
4.3. Analyse de l’activité de la région promotrice potentielle P1’-RARβ……………. p.179
D. ÉTUDE DE L’EXPRESSION PROTÉIQUE NUCLÉAIRE DE
RARβ………………………………………………………………………. p.181
1. DESSIN DE L’ANTICORPS RARβ………………………………………………… p.181
2. EXTRACTION DES PROTÉINES NUCLÉAIRES……………………………….. p.182
2.1. Principe……………………………………………………………………………… p.182
72.2. Méthode……………………………………………………………………………...p.182
3. WESTERN-BLOT……………………………………………………………………. p.184
3.1. Principes…………………………………………………………………………….. p.184
3.1.1. Préparation des échantillons………………………………………………... p.185
3.1.2. Électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE)…………………... p.186
3.1.3. Transfert sur membrane (immunobuvardage ou immunoblot)….…………. p.186
3.1.4. Blocage des sites non spécifiques….………………………………………. p.186
3.1.5. Détection……………………………………………………………… …...p.187
3.1.5.1. Anticorps primaire………………………………………………... p.187
3.1.5.2. Anticorps secondaire……………………………………………... p.188
3.1.5.3. Analyse……………….…………………………………………... p.188
3.2. Méthode.......................................................................................................................p.190
4. IMMUNOPRECIPITATION………………………………………………………... p.191
4.1. Principes……………………………………………….............................................. p.191
4.2. Méthode……………………………………………………………………………...p.192
4.2.1. Conjuguaison de l’anticorps RARβ à la protéine A immobilisée………….. p.192
4.2.2. Liaison covalente de l’anticorps RARβ au gel d’agarose………………….. p.193
4.2.3. Immunoprécipitation des protéines RARβ…………………………………. p.194
4.2.4. Élution des protéines RARβ immunoprécipitées…………………………... p.194
4.2.5 Analyse de l’échantillon…………………………………………………….. p.194
RÉSULTATS…………………………………………………… p.195
A. QUANTIFICATION DE L’EXPRESSION G ÉNIQUE DES
R ÉCEPTEURS AUX R ÉTINOÏDES……………………………………. p.197
B. ÉTUDE DE LA RÉGION GÉNOMIQUE RARβ……………………. p.210
1. TRANSCRITS NON VALIDÉS SITUÉS DANS LA RÉGION GÉNOMIQUE
RARβ...................................................................................................................................p.210
2. ANALYSE in silico DES R ÉGIONS PROMOTRICES POTENTIELLES SITU ÉES
EN AMONT DES TRANSCRITS NON VALIDÉS …………………………………...p.213
3. CLONAGE DE LA R ÉGION CONSERV ÉE P1’-RAR β…………………………..p.213
4. ANALYSE in vitro DE L’ACTIVIT É DE LA RÉGION PROMOTRICE
POTENTIELLE P1’-RARβ…………………………………………………………….. p.217
C. ÉTUDE DE L’EXPRESSION PROTÉIQUE NUCLÉAIRE DE
RARβ……………………………………………………………………….p.219
8DISCUSSION…………………………………………………... p.221
CONCLUSIONS-PERSPECTIVES…………………………... p.232
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES……………………... p.236
COMMUNICATION SCIENTIFIQUE………………………. p.252
9

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