ANALYSE DES MECANISMES MOLECULAIRES ET CELLULAIRES RESPONSABLES DE LA VARIATION MORPHOLOGIQUE : CAS DE LA TAILLE CHEZ DROSOPHILA MELANOGASTER.

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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté le 11 mai 2006 par Barbara VIGINIER Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes ANALYSE DES MECANISMES MOLECULAIRES ET CELLULAIRES RESPONSABLES DE LA VARIATION MORPHOLOGIQUE : CAS DE LA TAILLE CHEZ DROSOPHILA MELANOGASTER. jURY : Pr Geneviève CORDIER- Examinateur Pr Pierre CAPY - Rapporteur Pr Jean-Luc VAYSSIERE – Examinateur Pr Christophe TERZIAN - Examinateur Laboratoire EPHE de Biologie Intégrative des Populations. Muséum National d'Histoire Naturelle, 16 rue Buffon, 75005 Paris. Directeur du laboratoire : Pr Michel VEUILLE Directeur du stage : Pr Christophe TERZIAN, ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCE DE LA VIE ET DE LA TERRE ANALYSE DES MECANISMES MOLECULAIRES ET CELLULAIRES EPHE Banque de Monographies SVT 1

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Publié le : lundi 1 mai 2006
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE   ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES  Sciences de la Vie et de la Terre    MEMOIRE   Présenté le 11 mai 2006 par  Barbara VIGINIER  Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes   ANALYSE DES MECANISMES MOLECULAIRES ET CELLULAIRES RESPONSABLES DE LA VARIATION MORPHOLOGIQUE : CAS DE LA TAILLE CHEZ DROSOPHILA MELANOGASTER.
  
     jURY :  Pr Geneviève CORDIER- Examinateur Pr Pierre CAPY - Rapporteur Pr Jean-Luc VAYSSIERE – Examinateur Pr Christophe TERZIAN - Examinateur      Laboratoire EPHE de Biologie Intégrative des Populations. Muséum National d’Histoire Naturelle, 16 rue Buffon, 75005 Paris.  Directeur du laboratoire : Pr Michel VEUILLE Directeur du stage : Pr Christophe TERZIAN, terzian@mnhn.fr ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCE DE LA VIE ET DE LA TERRE   ANALYSE DES MECANISMES MOLECULAIRES ET CELLULAIRES
RESPONSABLES DE LA VARIATION MORPHOLOGIQUE : CAS DE LA TAILLE CHEZ DROSOPHILA  MELANOGASTER.   Présenté par Barbara VIGINIER   RESUME  Une des questions fondamentales en Biologie et en Evolution est de comprendre la diversité morphologique du monde vivant. La variation de la taille des organismes est une composante majeure de cette diversité morphologique. Pourquoi certaines espèces présentent des différences de taille, par exemple pourquoi Drosophila melanogaster est deux fois plus petite que Drosophila virilis ? La taille du corps d’un individu est un caractère phénotypique complexe qui dépend de facteurs environnementaux et génétique. Trois phénomènes sont impliqués dans sa régulation : la prolifération, la croissance et la mort cellulaire. Un réseau de gènes complexe régule ce caractère quantitatif, dont une voie importante : la cascade de transduction du signal de l’insuline. Au cours de ce travail, j'ai estimé dans un premier temps la variation génétique de plusieurs gènes impliqués dans la voie insuline. Pour cela, j’ai effectué le séquençage de ces gènes, au sein de populations de Drosophila melanogaster africaine et européenne, qui divergent fortement au niveau de la taille de leur corps. Dans un deuxième temps, j’ai réalisé une étude du transcriptome de deux lignées isofemelles de Drosophiles africaines et européennes, grâce à l’utilisation de puces à ADN et de la PCR quantitative en temps réel,. L’objectif de ce travail était d’identifier la variation naturelle de ce phénotype et de comprendre son évolution grâce à des études d’association entre variation génétique, transcription différentielle et variation de la taille du corps. Seuls deux gènes, impliqués dans la prolifération et la croissance cellulaire, ont une expression génétique significativement différente entre les deux lignées isofemelles. Concernant la voie de l’insuline, le gène S6K est un candidat potentiel, pour la variation transcriptionnelle entre les lignées de petites et de grandes tailles. Ce travail montre la difficulté de mettre en relation un caractère quantitatif complexe avec un génotype, en particulier, lorsqu’il s’agit d’un réseau de gènes complexe, comme la transduction du signal de l’insuline. De plus, l’expression des gènes des populations naturelles est très variable  entre individus de la même population: l’analyse du transcriptome par les puces à ADN permet de dresser une liste de gènes candidats, qui peuvent être ensuite associés à des expérimentations fonctionnelles, dans des études complémentaires.   MOTS-CLES : Drosophila melanogaster, taille, prolifération cellulaire, croissance cellulaire, insuline, puce à ADN, PCR quantitative, expression génétique.                                                          I.        Introduction générale......................................................................................... 4      II.       Bibliographie .................................................................................................................................................................. 6 1)       Mécanismes moléculaires responsables de la variation morphologique..................... 6 2)       Caractères quantitatifs
(QTL)....................................................................................................................... 6 3)       Génétique de la taille d’un organisme.................................................................................................... 8 4)       Corrélation entre la variation d’expression et la variation phénotypique................... 8 5)       Analyse comparative des transcriptomes entre populations : critique de la méthode 10 6)       Analyse des réseaux génétiques............................................................................................................... 10   III.        Objectifs du travail................................................................................................................................................. 12
1)     Voie insuline .......................................................................................................... 13 2)       La drosophile .......................................................................................................................................................... 14 3)     Questions évoquées au cours de ce travail................................. 15   Liste des abréviations  ADN : Acide Désoxyribonucléique ADNc : ADN complémentaire ARN : Acide Ribonucléique CP : Crossing point ENS : Ecole Normale Supérieure GTPase : Guanydin Triphosphatase IGF2 : Insulin Growth Factor 2 ILP : Insulin Like Protein InR : Insulin Receptor QTL : Quantitative Trait Locus PCR : Polymerase Chain Reaction Rnase : Ribonuclease Tm : Température de fusion TOR : Target Of Rapamycin
UTP : Uracyl Triphosphate          I.        Introduction générale   Une des questions fondamentales en Biologie et en Evolution est de comprendre la diversité morphologique du monde vivant (Simpson P., 2002 ; Carroll SB., 2000). La variation de la taille des organismes est une composante majeure de cette diversité morphologique. Pourquoi certaines espèces présentent des différences de taille ? Par exemple, pourquoi Drosophila melanogaster est deux fois plus petite que Drosophila virilis ? Cette question relève d'une discipline qui connaît un succès croissant : la macro-évolution. Il s'agit de déterminer les mécanismes responsables des variations morphologiques observées entre espèces à l'aide des données issues de la biologie du développement. La même question peut être posée au sein d’une même espèce entre différentes populations. Dans ce cadre, ce projet consistera à comprendre, à une échelle micro-évolutive, quels sont les mécanismes à l’origine de la variation de taille observée en milieu naturel. Ce travail concerne l’étude de l’évolution et de la régulation de la taille du corps de Drosophila melanogaster  au cours de son développement. L’originalité de cette approche réside dans l’intégration de la notion de variation naturelle à la génétique du développement. Mon sujet se focalisera sur les aspects de variation génétique liés à cette question. En effet, l’apparition d’évènements de fixation d'allèles spécifiques au sein d'une population, provenant de l’action de la sélection naturelle sur la variation génétique, est à l’origine des changements phénotypiques dans le monde vivant. La taille du corps d’un individu est un caractère phénotypique complexe, dépendant de facteurs environnementaux et génétiques. Les mécanismes cellulaires impliqués montrent une grande complexité et sont actuellement très étudiés (Goberdhan DCI. et Wilson C., 2003). Ce caractère présente l’avantage d’avoir une forte valeur adaptative, comme en témoigne l'existence d'une corrélation significative entre latitude géographique et taille chez la drosophile (James AC. et al., 1995 ; French V. et al . , 1998). Mon travail se focalise sur l’étude de la voie de signalisation de l’insuline qui est fortement conservée chez les métazoaires (Garofalo R.S., 2002). Au niveau cellulaire, le mécanisme de croissance fait intervenir différentes cascades de transduction de signal dont la voie Ras/MAP kinase, la voie ‘insuline’ PI3K/AKT, et la voie TOR nutriment-sensitive (Goberdhan DCI. et Wilson C., 2003). La voie insuline a un rôle majeur au cours de la croissance et de la prolifération cellulaire : il existe en effet un flux continu de travaux remarquables en Biologie du Développement concernant la fonction des réseaux de gènes impliqués dans cette voie de signalisation (Lehner CF., 1999 ; Conlon I. et Raff M., 1999). Mon travail propose, une double approche reposant d’une part sur l’étude du niveau d’expression des gènes et d’autre part, sur celle de leur niveau de variation moléculaire. Pourquoi étudier le niveau d'expression des gènes ? Le rôle des régions régulatrices apparaît fondamental au cours de l’évolution des gènes de développement (Carroll SB., 2000 ; Stern DL., 1998), suggérant qu’une régulation du niveau transcriptionnel de certains de ces gènes dans la voie insuline pourrait contribuer de manière significative à leur évolution.  Le caractère phénotypique étudié au cours de mon travail est la taille du corps de Drosophila melanogaster . Il dépend de la taille des cellules (c’est-à-dire résultant de la croissance cellulaire) et du nombre de cellules (c’est-à-dire résultant de l’effet antagoniste de la prolifération cellulaire et de l’apoptose). La taille du corps des individus sera donc mesuré à partir d’un paramètre couramment
utilisé, la taille de l’aile chez l’adulte (Reeve ECR. et Robertson FW., 1952). Pour analyser ce phénotype, le nombre de trichomes (égal à celui des cellules) et la surface de l’aile sont mesurés. L’activation de la voie insuline engendre une cascade de signalisation cellulaire, induisant le recrutement spécifique de protéines, et une régulation du niveau de traduction des ARNms. Ceci a pour conséquence de moduler le niveau de métabolisme (consommation des lipides, apport de glucose, synthèse de glycogène, de lipides et de protéines) et d’induire la croissance et la prolifération cellulaire (Goberdhan DCI. et Wilson C., 2003). Parmi les gènes connus intervenant dans la voie insuline, on distingue deux groupes fonctionnels : les gènes associés à la régulation du nombre de cellules (Puig O. et al., 2003), et ceux régulant la taille des cellules (Böhni R.et al., 1999). Les gènes suivants ont été sélectionnés, sur la base de leur capacité à induire une variation de taille ou du nombre de cellules suite à une perte ou un gain de fonction : dFoxo, S6k, InR, Tsc1, Tsc2, DILP2, Akt1, 4E-BP, chico, Pten, eIF-4a, Pi3K21B .  Au cours de ce travail, j'ai estimé, dans un premier temps, la variation génétique de plusieurs gènes impliqués dans la voie insuline, au sein de populations africaine et européenne qui divergent fortement au niveau de la taille de leur corps. Dans un deuxième temps, une étude a été menée afin d’identifier la variation naturelle de ce phénotype et de comprendre son évolution grâce à des études d’association entre variation génétique, transcription différentielle et variation de la taille du corps.      II.        Bibliographie  1)       Mécanismes moléculaires responsables de la variation morphologique.  Les changements à l’origine de la spéciation peuvent se situer au niveau du génome, du transcriptome ou du protéome. Dans chacune de ces catégories, il existe de nombreuses variations qui peuvent entraîner des variations de phénotypes, qui se situent au niveau de la partie codante des gènes ou au niveau de la transcription des gènes. Pour les gènes eucaryotes, la transcription est régulée entre autres par la liaison de facteurs de transcription sur de courtes séquences qui sont les sites de liaison et qui appartiennent à l’ADN cis-régulateur. Les facteurs de transcription s’associeraient typiquement à beaucoup de sites de liaisons de gènes-cibles, et réciproquement, un gène-cible possèderait de multiples sites de liaison pour des facteurs de transcription différents, qui seraient soit activateurs, soit répresseurs et dont la liaison permettrait de déterminer s’il y a transcription ou non. Les séquences cis-régulatrices agissent en intégrant la présence des différents facteurs de transcription dans la cellule. Ainsi, une mutation dans la région codante d’un facteur de transcription, peut altérer le produit du gène et peut affecter sa fonction et celles qui en découlent. Donc elle peut toucher de nombreuses fonctions dans la cellule, alors qu’une mutation qui altère la séquence cis-régulatrice d’un gène peut changer seulement le niveau d’expression du gène qu’elle régule et ainsi affecter une fonction seulement. La différence d’expression des gènes apparaît donc centrale pour l’évolution. Elle peut provenir :      
· de changements de séquences cis-régulatrices qui affectent : -  l’initiation de la transcription, - le taux de transcription,  -  la stabilité des transcrits de manière allèle spécifique. ·      de changements de facteurs de régulation trans qui interagissent avec les séquences cis régulatrices. ·      ou, à la fois de changements de facteurs de régulation trans et de changements de séquences cis-régulatrices. Récemment, de nombreuses études ont été menées chez l’organisme modèle Drosophila, notamment par Wittkop P.J. et al. (2002), dans le but de mieux comprendre l’évolution des génomes et l’impact des séquences cis-régulatrices dans cette évolution. Ils ont étudié la pigmentation de différentes drosophiles. En effet, la coloration est l’un des caractères les plus variables chez les animaux et c’est une riche source de modèles d’évolution des phénotypes. Les différences de pigmentation sont souvent polygéniques et corrélées à des changements de régulation des facteurs de transcription de ces gènes et des changements de la structure des gènes. Le réseau génique conduisant à la pigmentation est assez bien connu chez la drosophile, ce qui permet de faciliter l’étude. Dans cette voie de biosynthèse, on observe deux gènes importants dans la synthèse de mélanine noire : ebony  et yellow . Ces deux gènes sont très bien connus. Des résultats suggèrent que le mode et le niveau d’expression de ebony et de yellow , ensemble, détermine le mode et l’intensité de la mélanisation.   2)       Caractères quantitatifs (QTL)  Les techniques de la génétique quantitative considèrent que les caractères sont gouvernés par un nombre infini de gènes, tous génétiquement indépendants, ayant chacun un effet infinitésimal sur le caractère d'intérêt. Pour chacun de ces gènes, il existerait deux allèles, l'un favorable et l'autre défavorable. La valeur génétique d'un individu serait alors fonction de la proportion des gènes pour lesquels l'individu possède un allèle favorable. Cette approche statistique ignore donc les gènes réellement impliqués dans le caractère et suppose que chacun a un effet infime. Il est évident que ce modèle n'est pas exact, mais il a permis et permet encore de réaliser un fort progrès génétique dans des domaines aussi variés que l’agronomie, la génétique humaine et la biologie évolutive. Pour certains caractères cependant, des gènes ont un effet prépondérant. On parle dans ce cas de gènes à effet majeur. C'est par exemple le cas des gènes de nanisme chez la poule. Dans d'autres cas, certains gènes ont des effets intermédiaires sur le caractère, mais ne peuvent être mis en évidence par la seule analyse des performances des descendants d'un individu hétérozygote. Ils sont appelés QTL (Quantitative Trait Locus), indiquant que ces loci interviennent dans le déterminisme d'un caractère quantitatif. On emploie ici le terme de « locus » pour indiquer que cette zone du génome a un effet sur le caractère étudié, sans que l'on sache si un seul ou plusieurs gènes formant un haplotype sont responsables de l'effet observé. L’identification des QTL responsables d’un
caractère donné est essentiel : en agronomie et zootechnie, pour augmenter les performances animales ou la production céréalière, en médecine pour analyser la pression sanguine, l’obésité ou la susceptibilité à certaines maladies, ou en biologie évolutive pour étudier la diversité phénotypique et l’adaptation produite par la sélection naturelle. L'un des objectifs de la génétique moléculaire est d'identifier les QTL ayant un effet significatif sur les caractères d'intérêt. L'approche classique est d'identifier les loci potentiellement responsables du caractère étudié, puis de tester leurs éventuels effets sur ce phénotype. On distingue deux types principaux de gènes candidats en fonction des informations conduisant à étudier ce gène : les candidats physiologiques choisis en fonction de la connaissance biologique du caractère et de leur rôle, et les candidats positionnels choisis en fonction de leur position sur le génome à l'endroit où le gène majeur a été cartographié. Puisque les caractères quantitatifs comme la taille sont contrôlés par de nombreux gènes, on peut émettre l’hypothèse selon laquelle la variation phénotypique observée à l’échelle des populations peut être au moins en partie expliquée par la variation au niveau des gènes candidats. La mise au point des outils de génomique fonctionnelle, et plus particulièrement les puces à ADN ou microarray, permettent aujourd’hui d’envisager des expériences de comparaison de transcriptomes de différentes populations présentant des phénotypes très différenciés. Plusieurs travaux de ce type ont déjà été publiés. Il s’agit dans tous les cas : 1) de mesurer la variation du niveau d’expression entre individus appartenant à différentes populations phénotypiquement distinctes, 2) d’identifier le gène ou le groupe de gènes dont la variation d’expression augmente de manière significative avec la variation phénotypique, 3) la troisième étape qui valide les étapes précédentes consiste alors, à montrer par des études fonctionnelles, que le niveau d’expression du ou des gènes identifiés est responsable des différences phénotypiques observées. Malheureusement, ceci est souvent difficile à mettre en place.   3)       Génétique de la taille d'un organisme.  Parmi les caractères quantitatifs importants étudiés dans des domaines aussi variés que l’agronomie, la génétique humaine et la biologie évolutive, la taille d’un individu est un trait intéressant. La croissance de chaque organe est contrôlée par le nombre de cellules et/ou la taille des cellules pour atteindre une dimension finale qui est en relation avec la taille de l’organisme. Comment la croissance des organes est coordonnée dans un individu reste peu connu. Le comportement cellulaire (prolifération, croissance et mort) semble être déterminant pour la taille d’un animal. Ce comportement est contrôlé grâce à l’expression de nombreux gènes. La taille d’un individu se mesure et se contrôle elle-même. En effet des manipulations de la prolifération cellulaire et/ou de la taille cellulaire donnent le plus souvent un organe ou un animal de taille normale. Ils sont alors constitués d'un nombre relativement faible de cellules plus grandes ou d'un nombre relativement élevé de cellules plus petites. Il semble donc que la croissance des plantes et des animaux est régulée par la corrélation avec la dimension absolue plutôt qu’avec la corrélation avec le nombre de cellules
(Zhang H. et al, 2000).   4)       Corrélation entre la variation d’expression et la variation phénotypique.  L’analyse par puce à ADN offre de nombreux avantages : le génome entier pour une grande variété d’organismes peut être analysé de façon complète avec un bon rendement. Elle permet de mesurer la variation de l’expression des gènes, mais ne permet pas de comprendre cette variation. Il est possible d’observer de nombreuses différences d’expression de gènes qui ont un effet négligeable au niveau des performances de l’organisme, car ces gènes ont une influence faible sur la voie à laquelle ils participent. Néanmoins, certaines variations d’expression affectent des gènes, qui ont un rôle métabolique important, et qui pourraient modifier les performances. Pour cette catégorie de gènes, ceci reste une hypothèse qui doit être confirmée par d’autres approches expérimentales. Cependant, Wayne ML. et al. (2002) montrent que l’utilisation des puces à ADN s’avère très efficace pour faire une évaluation quantitative objective des gènes intervenant dans un QTL tel que le nombre d’ovarioles chez Drosophila melanogaster . La construction de listes fiables de gènes candidats est une première étape essentielle pour pouvoir ensuite étudier les relations entre génotype et phénotype. L’étape suivante qui permet de vérifier l’implication des gènes candidats est l’analyse par PCR quantitative en temps réel. Cette technique est caractérisée par sa grande précision et sa reproductibilité, mais les résultats dépendent de certains facteurs comme la préparation des échantillons, la qualité des standards et le choix des gènes de « ménage » (Klein D., 2002). Oleksiak MF. et al. (2002) ont étudié trois populations de Fundulus  : deux populations de la même espèce F. heteroclitus vivant dans des milieux différents et une espèce très proche génétiquement F. grandis . Ils observent chez F. heteroclitus,  pour 27 gènes, une différence d’expression plus importante entre les populations de F. heteroclitus du Nord et du Sud qu’entre F.  heteroclitus du Sud et F. grandis  vivant dans le même milieu, alors que la population de F.  hétéroclitus  du Sud est plus semblable génétiquement de la population de F. heteroclitus  que de F. grandis . Ce résultat peut s’expliquer par la différence d’environnement dans lequel ces populations ont évolué : la population du nord a évolué dans de l’eau froide et la population du sud ainsi que F. grandis  dans de l’eau plus chaude. Ce modèle d’expression de gène permet de voir que la variation d’expression des gènes peut être un mécanisme important de l’évolution induite par la sélection naturelle. Cependant, ce travail montre également que, pour une proportion importante de gènes, la variation d’expression entre individus d'une population est supérieure à la variation d’expression entre individus appartenant à des populations différentes. Pour comparer deux populations, il faut donc contrôler le maximum de paramètres extérieurs pour observer les variations d’expression en relation avec le mécanisme étudié. Bochdanovits Z. et al. (2003) étudient la taille de deux populations naturelles de Drosophila melanogaster en comparant leurs transcriptomes. Les lignées isofemelles de provenances géographiques différentes sont élevées à des températures différentes. De nombreux gènes montrent des variations d’expression significatives entre populations, mais on ne peut pas conclure sur ceux intervenant pour la taille puisque les conditions d’élevages sont différentes.  
 5)       Analyse comparative des transcriptomes entre populations : critique de la méthode  L’étude des transcriptomes a montré de nombreuses différences intra-espèce et inter-espèces, du niveau d’expression, même chez des espèces très proches (Fay JC. et al., 2004). Dans certains cas, la variation génétique de l’expression de gène est associée à la variation phénotypique. Néanmoins, la différence d’expression de gènes corrélés à un phénotype contribue ou non à ce phénotype. Cette différence est-elle simplement corrélée à un phénotype ou est-elle la cause de ce phénotype ? Fay JC. et al. (2004) identifient chez neuf souches de levure, 633 gènes ayant une différence d’expression significative entre lignées. Parmi ces gènes, seulement 20 peuvent être associés à la résistance au sulfate de cuivre et 24 à la coloration rouille en présence de sulfate de cuivre. La différence d’expression entre souche, pour la majorité de ces gènes, peut être due à l’absence de contrainte sélective sur leur niveau d’expression, ou à une forme de sélection naturelle. L’étude du profil d’expression des gènes permet de mettre en évidence des variations de la régulation de certains gènes, qui peuvent potentiellement contribuer au phénotype de l’organisme, et servir de substrat pour l’évolution et la sélection. Mais des études complémentaires systématiques doivent être effectuées entre les variations de régulation et les séquences codantes, pour identifier les conséquences fonctionnelles et la relative contribution de chaque polymorphisme. Cowles CR. et al. (2002), chez quatre souches de souris, associent pour certains gènes la variation d’expression avec des SNPs, lorsque la séquence codante de l’ADN est altérée et seulement dans des tissus spécifiques. Cependant cette expérience est faite sur trois organes et uniquement chez l’adulte, de plus seule les variations de 1,5 fois sont prisent en compte. Ce type d’étude dans un contexte spécifique ne peut être généralisé.   6)       Analyse des réseaux génétiques  L’étude des réseaux génétiques permet de comprendre les propriétés dynamiques collectives des groupes de gènes qui se contrôlent les uns les autres. La compréhension fine du comportement global d’un réseau est indispensable pour pouvoir diagnostiquer et prédire les dérèglements conduisant à certaines pathologies. Elle permet en effet de définir les limites au delà desquelles les niveaux d'expression induisent une perturbation du fonctionnement du réseau génétique. Un réseau peut donc être considéré comme plus ou moins robuste selon l'étendue des variations d'expression tolérées. Ainsi, l'un des buts de l'étude des variations d'expression au sein des populations naturelles est d'établir une cartographie des niveaux d'expression d'un réseau de gènes donné. Pour être complète, cette cartographie doit être associée à une description des variations nucléotidiques de ces mêmes gènes. C’est pourquoi la modélisation dynamique des réseaux génétiques suscite un intérêt croissant (Thieffry D. et al., 2002). La combinaison d’outils d’inférence avec des données fonctionnelles diverses devrait s’avérer très utile pour la caractérisation de réseaux de régulation impliqués dans des processus cellulaires spécifiques comme le cycle cellulaire, des voies de différenciation cellulaire, ou encore de leurs dérèglements pathologiques. Une fois disponible, de tels outils de modélisation dynamique
devraient devenir rapidement incontournables pour caractériser les différents types de comportements dynamiques des réseaux biologiques.  La voie de signalisation de l'insuline: un exemple de réseau génique. Plusieurs réseaux géniques interviennent dans la prolifération et la croissance cellulaire, mais récemment, des études génétiques ont mis en évidence une voie de signalisation très conservée entre Drosophila , Caenorhabditis  et mammifères, qui joue un rôle essentiel dans le contrôle de la taille des cellules, des organes et du corps des individus : la voie « insuline ». Il s'agit d'une voie de transduction du signal à l'intérieur des cellules, c'est à dire une cascade de réactions (phosphorylations par des kinases) déclenchée par la liaison d'un ligand (insuline et Insulin Like Protein, ILP) à un récepteur membranaire (Insulin Receptor, InR) qui permet la communication entre les cellules et participe au contrôle de la glycémie. Cette régulation s’effectue grâce à des interactions entre protéines et des interactions protéine-ADN avec un facteur de transcription important dFoxo. Ces études chez Drosophila  montrent que la conservation des structures génétiques peut être étendue au niveau structural. Chez la Drosophile, la croissance tissulaire s’effectue au cours des trois stades larvaires. L’adulte naît des structures mises en place chez la larve avec une taille qui n’évoluera pas. Les pertes de fonction des gènes codant pour des composants conservés de la voie de signalisation de l’insuline ( dInR , chico , dPi3K , dAkt , dPdk1 , dS6K ) provoquent des réductions importantes de la taille des organes et des appendices adultes, témoin d’un défaut important de croissance larvaire (Stocker H. et al., 2000). Dans la plupart des cas, l’analyse à l’échelle cellulaire des appendices adultes révèle une réduction de la taille et du nombre des cellules. A l’inverse, la surexpression du récepteur dInR  à l’aide d’un transgène provoque une augmentation de la taille moyenne des cellules ainsi que de leur nombre. La surexpression de Pi3K  et des autres gènes en aval ( Akt/Pkb ) et S6K  conduit à une augmentation de la taille mais pas du nombre des cellules, indiquant que l’activation de la voie PI3K seule peut stimuler la croissance des cellules mais pas leur prolifération (Weinkove D. et al., 1999). Par contre la perte de Pten qui est un antagoniste de l’activité de Pi3K augmente la taille. Parallèlement, à la régulation de la voie de signalisation de l’insuline, il existe une autre voie importante : la voie TOR (Target Of Rapamycin). TOR est une protéine conservée de la famille des phosphatidylinositol kinases, impliquée dans le contrôle de la croissance par l’intermédiaire de la régulation de la transcription en réponse à la quantité de nutriment. Sa cible principale est S6K, qu’il active par phosphorylation. Les mutations de TOR inhibent la croissance larvaire, en réduisant la taille et la capacité de prolifération cellulaire (Zhang H. et al., 2000).  D’autres réseaux génétiques interviennent également dans la régulation de la prolifération et de la croissance cellulaire et peuvent être des voies de cancérisation, par exemples : ·              La famille Ras, composée de gènes codant pour des petites GTPases qui interviennent dans les mécanismes de prolifération cellulaire et d’apoptose (Evan G. et al., 1998) ·              Les intégrines qui jouent un rôle fondamental dans l’adhésion, la mobilité, la survie et la prolifération cellulaire.  
  III.        Objectifs du travail  Il existe une grande diversité au niveau de la taille des organismes, même au sein d’une espèce. Par exemple, nous rencontrons chez Drosophila melanogaster , en plus du dimorphisme sexuel, une variation de la taille globale de l’organisme selon les endroits du globe appelée cline. Il a été recensé différents clines latitudinaux, en Australie, en Amérique du Sud, ainsi qu’un cline de l'Afrique à l'Europe. La variation de la taille le long de ce dernier est croissante en remontant vers le Nord : les mouches africaines sont plus petites que les mouches européennes. Nous allons essayer de déterminer les mécanismes responsables de la variation de la taille de la drosophile. Chez la drosophile, la croissance de l’organisme est liée à la prise de nourriture ; or celle-ci se fait seulement du premier au troisième stade larvaire, juste avant la pupaison. Les nutriments, ingérés pendant le stade larvaire, induisent la sécrétion de peptides de type insuline.   1)       Voie insuline  Des études génétiques sur des individus mutants montrent que la perte de l’activité de certains gènes comme chico , Inr entraînement la diminution de la taille des mouches par la réduction du nombre et de la taille des cellules. Les cellules dépourvues de PI3K ont une taille réduite avec le même nombre de cellules, de même pour AKT/PKB et S6K. Par contre la perte de l’activité de Pten,  qui est un antagoniste de l’activité de Pi3K, augmente la taille. La drosophile possède sept gènes codant des peptides de type insuline. La surexpression d’un de ces gènes produit des mouches plus grandes, suite à une augmentation de la taille et du nombre des cellules. Chez la levure, une privation de nourriture provoque une inhibition de la fonction TOR qui induit une diminution de l’activité traductionnelle, qui entraîne une autophagie des cellules. Zhang H. et al. (2000) montrent l’importance de Tor chez la Drosophile dans la régulation de la croissance au cours du développement larvaire. Les mutations de Tor inhibent la croissance larvaire, en réduisant la taille et la capacité de prolifération cellulaire. De plus, Tor  interagit avec d’autres gènes de la voie de signalisation de l’insuline, tel que Pten, Pi3K et S6K .  2)       La drosophile : modèle d’étude  Plusieurs facteurs influencent l’expression des gènes chez un individu : le cycle de vie, le type cellulaire et la réponse aux fluctuations physiologiques et aux conditions environnementales. Pour contrôler au maximum ces paramètres, j’ai choisi comme organisme modèle Drosophila melanogaster , dont la biologie du développement et la physiologie ont été largement explorées et dont le génome entier est séquencé.   
3)       Questions évoquées au cours de ce travail.
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