Application des techniques moléculaires de PCR-RFLP et de PCR ...

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  • cours - matière potentielle : des manipulations de biologie moléculaire
Université de Pau et des Pays de l'Adour Secteur Ecologie Laboratoire de Génétique Aquaculture et Pathologie La Tremlbhade -e\n- Application des techniq es molécu'aires de PCR .LP et de .PC'-RFLP-SSCP dans rétude de hi djfférenciafl génétilque de deux Huîtres creuses: Grass strea gigas et Crassostrea angulate Mars-mai 1998 Cédile DUFOURGI PFREMER IFREMER Bibliothèque de e Tremblade 11111111111i111 OLR 01313 n r r Ecol i r toire ti lt re et Pa tholo i rem l ~-' ues ol l ir - RFLP et de PCR l'étude de la i e ciation génétique de deux Huîtres creuses: C asso a 1 c
  • analyse des marqueurs microsatellites
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Publié le : mercredi 28 mars 2012
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Laboratoire de GénétiqueUniversité de Pau et des Pays de l'AdourUniversité de Pan et des Pays de l'Adour Laboratoire de Génétique
Aquaculture et PathologieSecteur EcologieSecteu r Ecologie Aquaculture et Pathologie
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Application des techniq es molécu'aires de PCRApplication des techniques moléculaires de PCR-
RFLP .LP et de .PC'-RFLP-SSCP dans rétude de hiet de PCR-RFLP-SSCP dans l'étude de la
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Application des techniques moléculaires de PCR" -RFLP" et de
PCR-RFLP-SSCP" dans l'étude de la différenciation
génétique de deux Huîtres creuses:
Crassostrea gigas et Crassostrea anguLata
PCR*: PoLymorphism Chain Reaction
RFLP* : Restriction Fragment Lenght PoLymorphism
SSCP* : SingLe Strand Confonnation Polymorplusm
Mars-mai 1998 Cécile DUFOURG REMERCIEMENTS
Je tiens à remercier André Gérard et Jean-Pierre Flassch de
m'avoir accueillie dans leur laboratoire.
Merci à Pierre Boudry, mon responsable de stage pour
l'encadrement scientifique dont j'ai bénéficié au cours de ces trois mois.
Un merci tout particulier à Sylvie, la future maman, pour ses
précieux conseils tout au long de mon stage.
Je remercie également Arnaud qui m'a aidée aux nombreuses
relectures de mon rapport et qui m'a gracieusement permis d'utiliser ses
résultats.
Enfin, je remercie chaleureusement tous les membres de l'équipe
du laboratoire pour leur grande disponibilité et l'ambiance décontractée qui a
facilité mon travail.
AVANT-PROPOS
Ce stage a été réalisé au sein du Laboratoire Génétique,
Aquaculture et Pathologie de la station IFREMER de Ronce-les-Bains. Son
objectif était double:
Tout d'abord, il m'a donnée un avant-goût du travail de recherche et la
possibilité d'apporter ma contribution dans le cadre d'un programme de
recherche lancé au laboratoire.
Il m'a permis également de juger mes capacités d'intégration à un groupe de
travail et de m'initier aux diverses manipulations en laboratoire de biologie
moléculaire.
Ce stage m'a appris les précautions multiples à prendre au cours des
manipulations de biologie moléculaire. Celles-ci sont indispensables pour
l'obtention de bons résultats mais aussi pour le bon fonctionnement du
laboratoire. SOMMAIRE
Page
1. INTRODUCTION .. ............................. ................................................................... .
II. MATERIEL ET METHODES 4
II.I. Matériel génétique..................... .............. .... ............ ............... ... ........................ 4
11.2. Matériel biologique : Présentation des populations échantillonnées ............ 4
11.3. Méthodes expérimentales mises en oeuvre............ .......................................... 5
lU.\. Techniques utilisées 5
11.3.1.1. Extraction de l'ADN.............. .. ............................................. 5
II.3.\.2. Technique de PCR (polymerase Chain Reaction).. ............. 6
11.3.1.3. Etude du polymorphisme de Longueur
des Fragments de Restriction (RFLP) de la séquence
codant pour la COL........................................................... 6
11.3.\.4. La technique de PCR-SSCP (Single-Strand
Conformation Polymorphism).............................................. 7
11.3.1.5. Les migrations.................................................... ........ .......... 8
11.3.\.6. Détermination de la température d'hybridation
................. .......................................... 9 d'une paire d'amorces.
II.3.2 Méthodes de construction d'arbres phylogénétiques.......................... 9
II.3.2.1 . Analyse des marqueurs microsatellites :
les F-statistiques.. ..... .................. ........................................... 9
II.3.2.2. Analyse PCR-RFLP des marqueurs mitochondriaux.......... II
II.3.2.3. Construction des arbres phylogénétiques.................... .. .. .... Il
III. RESULTATS ........................ .... ................... ....................................................... .......... 12
III.I. Etude des marqueurs microsatellites.............................. .................................. 12
IlI.2. Etude du polymorphisme au niveau des séquences du gène
codant pour la cytochrome oxydase .......................... ................ .................... ... 13
lII.2.I. Les profils de restriction...................................................... 13
IIl.2.2. Les haplotypes.... ............................................................................... 14
IlU. Apports des gels de polyacrylamide................................................................ 15
III.4. La technique de PCR-SSCP........................................ ............................ ......... 17 IV. INTERPRETATION .......... ... ... ... ... .......................... ........ .. ................ .......................... 18
IV. 1. Origine évolutive des 2 taxons: analyses des arbres phylogénétiques.... ........ 18
IV.2. Apports des gels de polyacrylamide 8% dans l'étude PCR-RFLP................... 19
IV.3. La technique de PCR-RFLP............................................................................ 19
V. CONCLUSION................................................................... ................ ... ....... ................. 21 1. INTRODUCTION
Les mollusques forment un embranchement extrêmement diversifié
divisé en 7 classes dont les 3 principales sont les gastéropodes, les lamellibranches
(ou bivalves) et les céphalopodes. Les huîtres, mollusques de la classe des
lamellibranches, présentent une importante biodiversité. Leur classification en
espèces et groupes d'espèces est de ce fait complexe et sujette à de nombreuses
controverses. Les huîtres creuses se divisent en deux genres : Saccostrea et
Crassostrea. Ce dernier réunit une vingtaine d'espèces. Deux de ces taxons,
Crassostrea gigas et Crassostrea angulata (annexe 1), font l'objet de très nombreux
programmes de recherche du fait de leur importance économique majeure.
Les huîtres creuses Crassostrea angulata ont été importées des côtes
portugaises dès 1868 et ont remplacé l'huître plate indigène Ostrea edulis sur le
littoral français, (COCHARD et DARDIGNAC, 1977) (Annexe 2). Elles sont alors
cultivées de façon intensive jusqu'en 1966. Présentant une forte sensibilité à un
iridovirus provoquant la "maladie des branchies", elles furent frappées par de fortes
mortalités dès 1967 (COMPS 1970, DEL TREIL 1973). Face à ce déclin, les stocks
furent reconstitués par l'importation d'une nouvelle espèce Crassostrea gigas
(nommée l'huître creuse japonaise) de 1966 jusqu'en 1972 dans le bassin de
Marennes Oléron à la suite d'un voyage personnel au Japon (BARRE 1981 , GRIZEL
et HERAL, 1991). L'homme a ainsi mis en contact deux taxons qui étaient à
l'origine géographiquement isolés.
D'importantes études ont été menées sur la distinction entre les
populations Crassostrea angulata et les populations Crassostrea gigas (annexe 3).
Les individus appartenant à ces 2 taxons présentent les mêmes caractères
morphologiques (coquille, charnière, structure des branchies). De plus, les données
physiologiques et écologiques sont similaires pour les deux taxons. Les études
génétiques sur les allozymes (BUROCKER et al., 1979; MATHERS et al., I974;
MATTINCCI et VILLAN!, 1983) n'apportent pas d'éléments suffisants permettant cie
les distinguer et concluent à leur forte homologie génétique.
Devant tant de ressemblances, pouvons-nous réellement parler de 2
espèces différentes? D'autant plus que les croisements d'individus Crassostrea
angulata et Crassostrea gigas donnent naissance à des hybrides viables et fertiles
(BUROCKER et al. 1979). Le concept d'espèce, défini par l'ensemble des individus
susceptibles d'échanger des gènes est ici remis en cause. Il n'existe aucune barrière
reproductive entre les 2 taxons. Aussi Menzel (1974) les considère comme 2 sous­
espèces appartenant à l'espèce C. gigas, les nommant alors Crassostrea gigas
angulata et Crassostrea gigas gigas.
Thunberg (1793) et Lamark (1819) ont pourtant définit 2 espèces différentes. Ils
observent que les populations naturelles de ces deux taxons présentent une
distribution géographique totalement différente. Les individus Crassostrea angulata
se concentrent au sud de l'Europe, en Espagne, au Portugal et au nord de l'Afrique.
Les individus Crassostrea gigas ont un foyer naturel asiatique (Japon, Corée et Taiwan). Ils ont été récemment introduits par l'homme en Europe de l'Ouest, en
Amérique, en Nouvelle Zélande, en Tasmanie et en Afrique de l'Ouest (Annexe 4).
Cet isolement géographique est l'argument déterminant dans l'idée de l'existence de
deux espèces. Il est en effet considéré comme le premier stade de la spéciation dans
la théorie néodarwinisme.
Il existe deux hypothèses expliquant la répartition géographique des deux huîtres.
La première semble dire que l'huître C. angulala est présente "depuis des temps
immémoriaux" près de Lisbonne (DEAN (1893) d'après COCHARD et
DARDIGNAC (1977)). Des amas coquillés datant du VI'"" millénaire avant J-C ont
pu être retrouvés en Bretagne. C. angulala aurait pu être introduite au Japon vers le
XV''''' ou le XVII''''' siècle, pendant les grandes explorations des voyageurs portugais.
Ce voyage (ou d'autres par la suite) serait à l'origine du transport (volontaire ou non)
de naissain de C. angulala fixé aux carènes des navires. On sait, de plus, que
l'ostréiculture a débuté au Japon dans la première moitié du XVIIème siècle.
La seconde hypothèse donnée par STENZEL (1971) serait que C. angulata et C.
gigas ainsi que C. callukensis rencontrées sur les côtes indiennes seraient issues du
fossile Crassoslrea gryphoides présent au miocène, de la péninsule Ibérique au Japon
en passant par l'Asie Mineure. Les bouleversements géologiques auraient provoqué
l'isolement de 3 populations, pour donner ces 3 espèces. C. gigas et C. angulala
restent inchangées sur le plan morphologique et sont compatibles sur le plan
génétique avec, dans le meilleur des cas 10 millions d'années de séparation.
Ces phénomènes s'inscrivent alors dans des problèmes de spéciation et d'adaptation
locale aux milieux.
La présente étude analyse la structure génétique de populations
naturelles de Crassoslrea angulala et Crassoslrea gigas pour déterminer leur niveau
de différenciation.
La recherche de marqueurs génétiques a pour objectif d'estimer la variabilité
génétique de populations des 2 taxons.
S'agissant alors d'une comparaison entre 2 "sous-espèces" (polymorphisme intra­
spécifique), cette étude portera sur l'analyse d'une région cod ante pour la sous-unité 1
de la cytochrome oxydase (COI) de l'ADN mitochondrial a priori peu variable. Cet
ADN est transmis selon le principe de l'hérédité maternelle et ne se recombine pas.
L'idéal serait de disposer de séquences conservées (qui ne varient pas trop entre
individus), qui soient représentatives de la population mais présentant des différences
entre espèces. Chez les animaux, l'ADN mitochondrial est très conservé en taille et
en structure. Il est de petite taille mais sa séquence évolue à un taux élevé. C'est
pourquoi l'étude de cet ADN cytoplasmique a, chez les animaux, permis de décrire
de nombreux cas de polymorphismes.
Ces travaux déjà initiés au laboratoire font appel à la technique PCR-RFLP
(RFLP: Restriction Fragment Lenght Polymorphism) avec migration de l'ADN en gel
d'agarose 1 % et en gel de polyacrylamide. Nous disposons ici d'un marqueur
moléculaire dit diagnostic qui permet de différencier des individus Crassoslrea
angulata et des individus Crassoslrea gigas (BOUDRY et al, sous presse). La COI
interagissant de part sa fonction avec d'autres protéines, sa séquence cod ante se doit
d'être relativement constante d'une espèce à l'autre mais elle présente cependant du
polymorphisme. Notre étude vise à poursuivre l'analyse de ces marqueurs
2 mitochondriaux chez différentes populations échantillonné~s en vue d'une
comparaison avec les résultats déjà obtenus pour ces mêmes individus par l'étude des
marqueurs microsatellites effectuée dans le cadre d'une thèse au laboratoire
(HUVET. A). Elles permettent la construction d'arbres phylogénétiques représentant
les distances génétiques existant entre les différentes populations d'huîtres
échantillonnées.
L'apport de deux nouvelles techniques de migration en gel de
po\yacrylamide dans la détection de ces polymorphismes mais aussi dans la détection
de nouveaux marqueurs génétiques sera mis en évidence.
Nous pourrons dans un premier temps comparer pour quelques individus des
2 taxons C. angulata et C. gigas, la qualité des profils de restriction pour l'étude
PCR-RFLP de la séquence codant pour la COI obtenue par migration en gel
d'agarose et en gel de polyacrylamide.
Dans un second temps, des études PCR-RFLP sur gel d'agarose portant sur une partie
du gène codant pour le 16SrRNA n'ayant pas révélées de polymorphisme (BOUDRY
el al, sous presse), il sera intéressant d'utiliser cet autre type de gel plus résolutif (gel
de polyacrylamide) pour séparer les fragments amplifiés.
En outre, nous essaierons de visualiser par la technique PCR-RFLP en gel d'agarose
et en gel de polyacrylamide des substitutions d'une paire de base (Pb) au niveau de
sites de restriction de l'enzyme MseI entre les 2 taxons d'huîtres d'une portion du
gène 16S séquencée par O'FOIGHIL (1998).
De plus, une technique basée sur l'étude du polymorphisme des fragments de
conformation de l'ADN simple brin (SSCP) est testée au laboratoire dans le but de
rechercher du polymorphisme. La SSCP s'appliquerait à de nombreux programmes
de recherche aussi bien en génétique qu'en pathologie. En effet, elle permet de
détecter des polymorphismes non révélés par d'autres techniques (PCR-RFLP)
comme des substitutions d'une seule base.
Elle devrait nous permettre de visualiser les 3 substitutions d'une seule paire de base
détectées entre les 2 taxons sur la région du gène 16S séquencée par O'FOIGHI
(sous-presse).
3 II. MATERIEL ET METHODES
11.1. Matériel génétique
Un marqueur microsatellite est une séquence d'ADN non génique constituée
de courtes séquences nucléotidiques (de 1 à 6 pb) répétées en tandem et généralement
dispersées dans le génome eucaryote. Ces séquences sont connues depuis 30 ans
(BRITTEN ET KHONE, 1968). Ces locus montrent un important polymorphisme dû
à la variation du nombre de répétitions du motif de base. Les séquences répétées sont
en général encadrées par des séquences uniques elles-mêmes peu variables appelées
séquences flanquantes (Annexe 5). La détermination d'amorces dans ces régions
flanquantes permet d'amplifier spécifiquement une séquence m;crosatellite par PCR.
Le gel de polyacrylamide permet une bonne séparation des fragments indispensable
pour détecter des différences de 2 paires de bases.
Il est admis pour les microsatellites qu'une mutation intervient par glissement de la
polymérase lors de la réplication de l'ADN.
L'examen des individus a été réalisé avec 3 marqueurs microsatellites CG 44, CG
108 et CG 49 mis au point par l'équipe grecque de E. ZOUROS (Intitute of Marine
Biologie ofCreete).
Les avantages des microsatellites, justifiant leur utilisation grandissante, sont
nombreux; parmi eux:
4 - le fort taux de polymorphisme (taux de mutation de l'ordre de 10. à
310. )
- la codominance (distinction des homozygotes et des hétérozygotes,
cf. annexe 5).
- la neutralité (ADN non codant).
La lecture du gel permet de visualiser les allèles (chaque fragment correspond à un
allèle). Un nombre de répétition du motif correspond à un allèle, chaque allèle étant
séparé d'un autre par une ou plusieurs mutations. Les allèles sont numérotés à partir
de 1 pour l'allèle le plus haut avec un incriminant de 2 paires de bases soit 1 motif de
répétition (motifs dinucléotidiques). On appelle "allèles nuls" des allèles non
détectables en PCR. Les allèles les plus hauts, correspondant à ceux qui ont le moins
migré, sont les plus grands. Les individus hétérozygotes pour un locus se distinguent
par la présence de 2 fragments amplifiés (annexe 5).
D'autre part, 2 séquences géniques sont étudiées afin de détecter du
polymorphisme entre les 2 taxons: la séquence mitochondriale codant pour la COI et
le gène 16S.
II.2. Matériel biologique: présentation des populations
échantillonnées
L'échantillonnage comprend 5 populations avec une moyenne de 40
4 individus par population. Les fluctuations du nombre d'individus par population sont
dues aux difficultés d'échantillonnage. Le tableau 1 présente les caractéristiques et la
répartition géographique des populations.
Tableau 1: Populations échantillonnées
Effectif Descriptif (lieu de prélèvement) Population Taxon
prédéterminé
Arcachon, France 50 ARC Cg
48 SEU Cg Anse de la Seudre, La Tremblade,
France
27 MIR Ca Portugal
Cg Tungkang, Taiwan 40 KAO
BOU Cg Vieux-Boucau, Landes, France 49
Cg = Crassos/rea gigas, Ca = Crassos/rea angula/a
Cet échantillonnage comprend 4 populations de type Crassos/rea gigas et 1
population de type Crassos/rea angula/a. Leur taxon est déterminé suivant des
critères taxonomiques et historiques mais non génétiques.
Une sixième population nommée OGA est utilisée dans cette étude. Elle provient des
côtes japonaises et correspond à une population homogène d'individus de type C.
gigas (taxon déterminé sur des critères génétiques, par l'analyse PCR-RFLP de la
séquence codant pour la COI).
Les échantillons ont été reçus au laboratoire sous forme de fragments de
branchies conservés dans de l'alcool ou bien les animaux vivants ont été fournis et
mis en quarantaine au laboratoire puis biopsés.
II.3. Méthodes expérimentales mises en oeuvre:
II.3.1. Techniques utilisées
II.3.!.!. Extraction de l'ADN:
Les extractions de l'ADN sont réalisées au chelex ou préférentiellement au phénol­
chloroforme (Annexe 6). Cette dernière technique se divise de 3 étapes:
• La première consiste à lyser les cellules en incubant à 55°C les échantillons de
branchies dans une solution d'extraction contenant de la protéinase K pendant 4
heures au minimum.
• La seconde étape comprend une phase de déprotéinisation au phénol. Ensuite, les
traces de phénols sont éliminées par ajout de chloroforme.
• La dernière étape consiste à précipiter les acides nucléiques au froid pendant une
heure puis à laver le culot avec une solution d'éthanol. Il faut ensuite dissoudre le
5

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