ETUDE DE L'EVOLUTION DU POLYMORPHISME GENETIQUE ET DE LA REPONSE HUMORALE DU VIRUS DE L'HEPATITE C (VHC) CHEZ DES PATIENTS COINFECTES PAR LE VIRUS DE L'IMMUNODEFICIENCE HUMAINE (VIH) ET ASYMPTOMATIQUES A LONG TERME (ALT) Soutenue le 21 octobre 2003 devant le jury suivant : Monsieur le Pr Dominique DORMONT - Président Monsieur le Pr Stéphane RICHARD - Rapporteur Monsieur le Pr Gilles DUVERLIE - Examinateur Monsieur le Pr. Jean-Marie HURAUX - Examinateur Madame le Dr Annie CAHOUR - Examinateur Génétique Oncologique EPHE Directeur EPHE: Pr S. RICHARD Faculté de Médecine Paris-Sud E-mail : 94276 Le Kremlin Bicêtre Laboratoire de Genetique Virale du CERVI Directeur de stage : Dr A. CAHOUR Hôpital de la Pitié-Salpêtrière E-mail : 105, Bd de l'Hôpital 75013 Paris ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE EPHE Banque de Monographies SVT 1

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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE présenté par Magali BELNARD Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes ETUDE DE L'EVOLUTION DU POLYMORPHISME GENETIQUE ET DE LA REPONSE HUMORALE DU VIRUS DE L'HEPATITE C (VHC) CHEZ DES PATIENTS COINFECTES PAR LE VIRUS DE L'IMMUNODEFICIENCE HUMAINE (VIH) ET ASYMPTOMATIQUES A LONG TERME (ALT) Soutenue le 21 octobre 2003 devant le jury suivant : Monsieur le Pr Dominique DORMONT - Président Monsieur le Pr Stéphane RICHARD - Rapporteur Monsieur le Pr Gilles DUVERLIE - Examinateur Monsieur le Pr. Jean-Marie HURAUX - Examinateur Madame le Dr Annie CAHOUR - Examinateur Génétique Oncologique EPHE Directeur EPHE: Pr S. RICHARD Faculté de Médecine Paris-Sud E-mail : 94276 Le Kremlin Bicêtre Laboratoire de Genetique Virale du CERVI Directeur de stage : Dr A. CAHOUR Hôpital de la Pitié-Salpêtrière E-mail : 105, Bd de l'Hôpital 75013 Paris ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE EPHE Banque de Monographies SVT 1

  • protéine ns4a

  • patients coinfectes par le virus de l'immunodeficience humaine

  • vhc

  • cellule

  • évolution de la variabilité génétique du site interne d'entrée des ribosomes

  • réplication adaptative du vhc dans les pbmcs

  • intensité de la réponse anticorps


Publié le : mercredi 1 octobre 2003
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE   ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES  Sciences de la Vie et de la Terre   MEMOIRE présenté par  Magali BELNARD   Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes     ETUDE DE L'EVOLUTION DU POLYMORPHISME GENETIQUE ET DE LA REPONSE HUMORALE DU VIRUS DE L’HEPATITE C (VHC) CHEZ DES PATIENTS COINFECTES PAR LE VIRUS DE L’IMMUNODEFICIENCE HUMAINE (VIH) ET ASYMPTOMATIQUES A LONG TERME (ALT)     Soutenue le 21 octobre 2003 devant le jury suivant :  Monsieur le Pr Dominique DORMONés dent  T- Pr i Monsieur le Pr Stéphane RICHARD- Rapporteur  Monsieur le Pr Gilles DUVERLIE- Examinateur                                                Monsieur le Pr. Jean-Marie HURAUX Examinateur - Madame le Dr Annie CAHOUR- Examinateur     Génétique Oncologique EPHE Directeur EPHE: Pr S. RICHARD Faculté de Médecine Paris-Sud E-mail : stephane.richard@kb.u-psud.fr 94276 Le Kremlin Bicêtre  Laboratoire de Genetique Virale du CERVI Directeur de stage : Dr A. CAHOUR Hôpital de la Pitié-Salpêtrière E-mail : cahour@ext.jussieu.fr 105, Bd de l’Hôpital 75013 Paris  ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE  
ETUDE DE L'EVOLUTION DU POLYMORPHISME GENETIQUE ET DE LA REPONSE HUMORALE DU VIRUS DE L’HEPATITE C (VHC) CHEZ DES PATIENTS COINFECTES PAR LE VIRUS DE L’IMMUNODEFICIENCE HUMAINE (VIH) ET ASYMPTOMATIQUES À LONG TERME (ALT)   
Magali BELNARD   Le 21 octobre 2003  RESUME  Il est actuellement que la coinfection par le VHC est fréquente (30%) chez les patients positifs pour le VIH (revuebien établi Maier, 2002). Actuellement, l’infection par le VIH peut être contrôlée grâce à l'introduction de traitements antirétroviraux hautement actifs (HAART), mais ces patients qui survivent plus longtemps à l'infection VIH, décèdent souvent d'une complication hépatique liée à l'infection VHC. Dans ce contexte, la gravité des lésions du foie, survenant 2 à 3 fois plus vite, est plus importante que dans le cadre d’une infection simple par le VHC. C’est pourquoi de nombreuses études visant à étudier les interactions entre ces deux virus ont été menées afin de comprendre les mécanismes impliqués dans ce processus. Cependant, ces observations ont été faites dans le contexte de traitements antiviraux ou d’une immunité altérée. Afin d’étudier l’impact du VIH sur l’évolution du VHC, nous nous sommes intéressés à des patients coinfectés, issus d’une cohorte d’individus ALT pour le VIH présentant l’avantage de posséder une immunité stable (lymphocytes CD4+ > 600/mm3), de n’être soumis à aucun traitement antiviral et de posséder des charges virales VIH fortes (patients progresseurs lents-P) ou faibles (patients non progresseurs-NP). Nous avons étudié, dans un premier temps, l’évolution de la réponse humorale contre plusieurs protéines du VHC afin (i) de compléter les études antérieures caractérisant la réponse cellulaire dirigée contre le VHC et le VIH, chez les NP et (ii) de déterminer la dynamique de cette réponse sous diverses pressions VIH. Dans un second temps, nous avons étudié l’évolution de la variabilité génétique du Site Interne d’Entrée des Ribosomes (IRES), situé dans la région 5’non codante (5’NC) du VHC, dans le plasma et les Cellules Mononucléées du Sang Périphérique (PBMCs) de ces 2 groupes de patients, en vue d’y observer (i) une compartimentation du VHC, (ii) une influence potentielle du VIH sur cette variabilité, (iii) une modification de l’activité traductionnelle des IRES mutés, en lysats de réticulocytes de lapin et sur cellules hépatocytaires. Pour cela, nous avons utilisé d’une part, un test sérologique Inno-Lia IV (Innogenetics) de type immunoblot, nous permettant d’étudier l’intensité de la réponse anticorps (Ac) vis-à-vis de chaque antigène du VHC et d’autre part, nous avons mis au point une stratégie d’étude du polymorphisme conformationnel simple brin (SSCP), associée au clonage et au séquençage, nous permettant d’apprécier la variabilité du VHC dans l’IRES. L’activité traductionnelle des variants sélectionnés et clonés dans un vecteur bicistronique, contenant les gènes de la luciférase, a été mesurée en luminométrie. Les résultats montrent des réponses Ac stables et largement ciblées, traduisant l’infection VHC chronique, mais néanmoins plus faibles vis-à-vis de certaines protéines non structurales (NS4A et NS5A) chez les coinfectés, en comparaison à un groupe de sujets infectés uniquement par le VHC. Il semble également y avoir un profil spécifique des NP avec une réponse plus forte contre E2 chez ces patients. L’étude de la variabilité suggère une tendance évolutive plus probable du VHC sous de fortes charges virales VIH ainsi qu’une réplication adaptative du VHC dans les PBMCs. D’une manière générale, le maintien de la structure et l’absence de modification de la fonctionnalité des IRES sélectionnés (malgré la présence de variants adaptatifs) suggère l’importance de cette structure vis-à-vis du mécanisme de persistance du VHC dans l’organisme.  MOTS CLES : coinfection VIH/VHC, ALT, SSCP, vecteur bicistronique, luminométrie  
 ABREVIATIONS
  3’NC :(région) 3’ non codante 5’NC :(région) 5’ non codante Aa :acide(s) aminé(s) Ac :anticorps ADNc :acide désoxyribonucléique complémentaire Ag :antigène(s)
ALAT :alanine aminotransferase ARNm :acide ribonucléique messager CMH :complexe majeur d’histocompatibilité CPA :cellule(s) présentatrice(s) d’ag(s) CTL :cytotoxic T lymphocyte(s) (lymphocyte(s) T cytotoxique(s)) Dntp(s) :dinucléotide(s) triphosphate(s) eIF :facteur d’initiation eucaryote ELISA :elispot assay (technique elispot) HAART :highly active antiretroviral therapy (traitement antirétroviral hautement actif) HepG2 :cellules d’hépatocarcinome humain HLA :human leucocyte antigen (antigène leucocytaire humain) HNANB :hépatite(s) non A non B HVR :région hypervariable IFN :interféron Il :interleukine IRES :internal ribosomal entry site (site interne d’entrée des ribosomes) ISDR :Interferon sensitivity determining region (région impliquée dans la sensibilité à l’IFN) Kb :kilobase kDA :kiloDalton LB :lymphocyte B MMLV - RT :moloney murin leukemia virus reverse transcriptase nt :nucléotide(s) NK :natural killer pb :paire(s) de bases PBMC(s) :peripheric blood mononuclear cells (cellules mononucléées du sang périphérique) PCR :polymerase chain reaction PePHD :PKR-eIF2a phosphorylation homology domain RE :reticulum endoplasmique  SSCP :single-stranded conformational polymorphism VHA :virus de l’hépatite A VHB :virus de l’hépatite B VHC :virus de l’hépatite C VIH :virus de l’immunodéficience humaine         A - GENERALITES SUR LE VIRUS DE L’HEPATITE C............. 5 1. Historique ............................................................................................................... 5 1.1. La découverte du virus................................................................................. 5 1.2. Classification.................................................................................................... 5 2. Structure du VHC............................................................................................ 6 2.1. La virale..........................................................................................
6 2.2. Le génome.......................................................................................................... 6 2.2.1.1. La région 5'NC`.......................................................................................... 6 2.2.1.2. La région 3'NC............................................................................................ 7 2.2.2.1. La protéine de la capside (protéine C)......................................................... 7 2.2.2.2. Les glycoprotéines d’enveloppe E1 et E2.................................................... 7 2.2.2.3. La protéine P7............................................................................................. 8 2.2.2.4. La protéine F............................................................................................... 8 2.2.3.1. La protéine NS2.......................................................................................... 8 2.2.3.2. La protéine NS3.......................................................................................... 9 2.2.3.3. La protéine NS4A....................................................................................... 9 2.2.3.4. La protéine NS4B....................................................................................... 9 2.2.3.5. La protéine NS5A....................................................................................... 9 2.2.3.6. La protéine NS5B..................................................................................... 10 3. Cycle de réplication........................................................................................ 10 4. Polymorphisme viral...................................................................................... 11 4.1. Les génotypes................................................................................................. 11 4. . Les quasi-espèces........................................................................................... 2 12 B - EPIDEMIOLOGIE - PATHOGENIE................................................... 13 1. Prévalence ............................................................................................................ 13 2. Modes de transmission................................................................................. 13 3. Physiopathologie.............................................................................................. 14 3.1. Evolution de la maladie............................................................................. 14 3.2. Hépatite aiguë................................................................................................ 14 3.3. Hépatite chronique...................................................................................... 14 3.3.2.1. Facteurs liés à l'hôte.................................................................................. 15 3.3.2.2. Facteurs viraux.......................................................................................... 15 3.4. Manifestations extrahépatiques.............................................................. 16 4. Réponse immunitaire..................................................................................... 16 4.1. Réponse cellulaire......................................................................................... 17 4.2. Réponse humorale........................................................................................
17 4.3. Mécanismes d'échappement immunitaire........................................... 18 5. Diagnostic ............................................................................................................. 18 5.1. Tests sérologiques et génotypage............................................................ 18 5.2. Tests moléculaires......................................................................................... 19 5.3. Tests histologiques........................................................................................ 19 6. Thérapies .............................................................................................................. 19 6.1. Traitements..................................................................................................... 19 6.2. Facteurs influençant la réponse aux traitements............................. 20 6.3. Mécanismes de résistance aux traitements......................................... 21 7. Vaccination ......................................................................................................... 22 C - GENERALITES SUR LES ELEMENTS IRES........................... 23 1. Comparaison des traductions IRES et coiffe dépendantes.... 23 1.1. Mécanisme de traduction coiffe dépendante..................................... 23 1.2. Mécanisme de traduction IRES (Internal Site Entry Ribosome).................................................................................................................... 23 2. Différents IRES viraux................................................................................ 23 3. IRES du VHC................................................................................................... 24 3.1. Phylogénie....................................................................................................... 24 3.2. Structure.......................................................................................................... 24 3.3. Mécanisme d'initiation de la traduction............................................. 25 3.4. Modulation de l'activité IRES................................................................. 25 3.5. Polymorphisme de l'IRES et relation avec son activité................. 26 D – COINFECTION VIH/VHC........................................................................ 28 1. Notions sur le Virus de l'Immunodéficience Humaine
(VIH) ............................................................................................................................... 28 2. La coinfection VIH/VHC............................................................................ 28 2.1. Epidémiologie................................................................................................ 28 2.2. Impact du VIH sur le VHC...................................................................... 29 2.3. Impact du VHC sur le VIH...................................................................... 29 2.4. Réponse immunitaire.................................................................................. 30 2.5. Coinfection et quasi-espèces VHC.......................................................... 32 2.6. Coinfection et compartimentation........................................................ 32   
A - GENERALITES SUR LE VIRUS DE L’HEPATITE C   1.    Historique   1.1. La découverte du virus  En 1960, les cas d'hépatites post-transfusionnelles (HPT) étaient extrêmement répandus. La découverte des virus de l'hépatite B (VHB) en 1968(Prince et al, 1968) et de l'hépatite A (VHA) en 1973 (à la mise en place de tests de détection de ces 2 virus responsables deFeinstone et al, 1973) a abouti 25% des HPT. Les 75% restant, dont on ignorait toujours l'origine, ont été nommés hépatites non A-non B (NANB). Après des tentatives infructueuses pour mettre en évidence des marqueurs sérologiques, des études de transmission de la maladie chez des primates par inoculation de fractions sanguines, d’homogénats de foie et de préparations plasmatiques contaminés,  agentont permis de confirmer la suspicion d’un infectieux d’origine virale (Alter et al, 1978). Durant les 10 années qui ont suivi, les techniques de biologie moléculaire et cellulaire ont largement été utilisées afin de définir la nature de ce virus. C’est l’obtention d’un ADN complémentaire (ADNc), dérivé du génome viral responsable de l’hépatite NANB, provenant du sang d’un chimpanzé infecté expérimentalement par le sérum d’un patient présentant un titre viral inhabituellement élevé, qui a permis à Choo et ses collaborateurs de mettre en évidence pour la première fois, en 1989, le virus de l’hépatite C (VHC)(Choo et al, 1989).   1.2. Classification  Les différentes études visant à définir la nature de l'agent infectieux ont démontré successivement que le virus pouvait être inactivé par traitement au chloroforme, suggérant que c’était un virus contenant des lipides ou enveloppé (Feinstone et al., 1983) et qu’il pouvait passer à travers des pores de 80nm et partiellement de 50nm, ce qui suggérait que sa taille variait de 40 à 60nm (He et al., 1987). Par un processus d’élimination systématique des classes de virus, combiné aux propriétés physicochimiques nouvellement définies, l’agent infectieux a été décrit comme un petit virus à ARN enveloppé (probablement un flavivirus ou ressemblant). Les anal de sé du VHC ont de le classer dans la famille desFlaviviridae. La
2.    Structure du VHC
taille de la particule et son génome ARN traduit en une polyprotéine immature, clivée ultérieurement en protéines structurales et non-structurales, ont fait de ce virus le prototype d’un nouveau genre : le genre hépacivirus.             2.1. La particule virale  La particule virale du VHC n'a jamais été visualisée en microscopie électronique du fait de l'absence de  systèmes de cultures productifs. Des pseudo-particules virales ont été mises en évidencein vitro dans des lignées cellulaires (lymphocytes humains, hépatocytes simiens et humains) (Shimizu et al., 1996) et in situ, lors d'hépatites chroniques (biopsies hépatocytaires animales et humaines) sans qu'aucune correspondance avec le VHC n'ait pu être établie. Les découvertes successives sur la structure du VHC (voir paragraphe 1.2) ont permis de décrire les divers éléments de sa particule virale, c’est-à-dire une enveloppe lipidique, dans laquelle sont enchâssées les 2 glycoprotéines d’enveloppe E1 et E2, ainsi qu'une capside icosaédrique résultant de la polymérisation de la protéine C et dans laquelle se trouve le génome du VHC.   2.2. Le génome  Le VHC est un virus à ARN simple brin de polarité positive (Reed et Rice, 2000). Son génome de 9,6 kb est composé de 3 régions principales : - une région 5’non codante (5’NC) en position N-terminale formée des 341 premiers nucléotides (nts) du génome. - une phase ouverte de lecture (ORF) de 9000 nts codant pour une polyprotéine de 3033 acides aminés (aa). Cette polyprotéine est clivée après traduction par des enzymes cellulaires et virales donnant, respectivement, 4 protéines structurales (capside, E1, E2, p7) et 6 protéines non-structurales (NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b). Un second cadre de lecture a été récemment décrit et code une petite protéine F en portion N-terminale. une région 3’non codante (3’NC) en position C-terminale de longueur variable, entre 220 et 250 nts. -  2.2.1.     Les régions non codantes  2.2.1.1.                La région 5'NC`  La région 5’NC se situe entre les nucléotides 1 et 341 du génome du VHC. Elle se termine au niveau du codon AUG initiateur de la traduction virale, en position 342. C’est une région hautement conservée formée de structures secondaires complexes (tiges-boucles) et tertiaires (pseudonoeuds) constituant 4 domaines et contenant les fonctions régulatrices de la traduction et de la réplication virale. Elle possède la majeure partie du Site Interne d’Entrée des Ribosomes (IRES) qui joue un rôle important dans l’initiation de la traduction et qui permet aux ribosomes de se fixer
directement au niveau de l’AUG initiateur assurant une traduction immédiate (Rinjbrandt et Lemon, 2000).      2.2.1.2.                La région 3'NC  La région 3'NC est constituée de 3 domaines caractérisés : une structure en tiges-boucles, peu conservée de 40 nts, suivie d'une queue polyuridine (poly U) de longueur variable (40 à 150 nts) selon les isolats, et pour finir, d'une séquence de 98 nts (queue 3'X), très conservée, composée de 3 tiges-boucles dont la dernière (45 nts) est la plus stable (Ito et al., 1998). La fonction essentielle de la région 3'NC est d'initier la réplication virale en assurant la synthèse du brin négatif, intermédiaire de réplication (Friebe et Bartenschlager, 2002). Du fait de sa grande stabilité, la dernière tige-boucle serait impliquée dans cette fonction. D'autres rôles ont été imputés à cette région comme des rôles de stabilisation (queue 3'X) de l'ARN et d'activateur de la traduction virale par interaction directe avec la région 5'NC (Ito et al, 1998) ou avec des facteurs cellulaires comme la PTB (Polypyrimidine Tract Binding Protein), l'autoantigène La et certaines protéines ribosomales.   2.2.2.     La région codante : les protéines structurales  2.2.2.1.                La protéine de la capside (protéine C)  La protéine de la capside est clivée par une enzyme cellulaire au niveau du site C/E1 après synthèse de la polyprotéine. Elle a un poids moléculaire de 21 kilodaltons (kDa) et a été observée principalement dans le cytosol, enchâssée dans la membrane du réticulum endoplasmique (RE) par son extrémité carboxy-terminale (Chang et al., 1994). Elle a la capacité de se multimériser pour former, par interaction avec l’ARN viral, la nucléocapside icosaédrique du virus.Elle interagit aussi avec la région 5'NC (Santolini et al., 1994) et la glycoprotéine E1 pour l'assemblage du virion (Lo et al., 1996). D'autres fonctions sont imputées à la forme cytoplasmique de cette protéine comme l'interaction avec le système immunitaire,la perturbation du métabolisme lipidique, un rôle oncogène sous certaines conditions ou la capacité de réguler l'apoptose. Une forme plus petite de la protéine C, appelée aussi p16 (16 kDa), a aussi été mise en évidence et serait localisée plus spécifiquement dans le noyau (Lo et al., 1995). Cette forme tronquée de la p21 jouerait un rôle dans la modulation de certains gènes de régulation du cycle cellulaire (Ray et al., 1998) ou dans l'inhibition de la transcription d'autres virus comme le VIH (Srinivas et al., 1996) ou le Virus de l’Hépatite B (VHB).   2.2.2.2.                Les glycoprotéines d’enveloppe E1 et E2  Les deux glycoprotéines d’enveloppe E1 et E2, de 30 kDa et 70 kDa respectivement, sont les constituants de l’enveloppe virale. Ce sont des protéines transmembranaires avec un ectodomaine amino-terminal dans la lumière du Réticulum Endoplasmique (RE) et un ancrage hydrophobe carboxy-terminal dans la membrane du RE (Dubuisson et al., 1994). Elles sont associées de manière non covalente sous forme d’hétérodimères (Ralston et al., 1993) mais elles ont aussi été retrouvées sous forme d’agrégats, associées par des ponts disulfures (Dubuisson et al., 2000). La première forme dite productive entre dans la composition de l'enveloppe virale, tandis que la seconde serait plutôt impliquée dans le mécanisme d'échappement immunitaire (voir plus bas). La protéine E2 joue plusieurs rôles dans la survie de la particule virale dans l’organisme. Tout d’abord, elle serait impliquée dans l’adsorption du virus à la surface cellulaire en se liant par son ectodomaine au récepteur cellulaire CD81 (Pileri et al., 1998). Étant la cible première de la réponse immunitaire humorale, elle une ré h dans sa N-terminale a HVR1
au virus d’échapper régulièrement aux anticorps neutralisants (Kato et al., 1993). La protéine E1, longtemps considérée comme responsable de la fusion entre l'enveloppe virale et l'enveloppe cellulaire semblerait, à l'heure actuelle, avoir des rôles partagés avec E2, notamment dans la reconnaissance du récepteur cellulaire. Comme les autres virus desFlaviviridae par, l’acquisition de l’enveloppe virale s’effectuerait bourgeonnement au niveau de la membrane du RE, dans laquelle sont encrées les deux protéines E1 et E2.   2.2.2.3.                La protéine P7  Ce petit peptide de 63 aa a été peu étudié (Carrere-Kremer S. et al., 2002). Il se situe au niveau de la membrane plasmique, ses extrémités N et C-terminales étant orientées vers l'extérieur de la cellule et un petit domaine hydrophyle vers la face cytoplasmique. Sa fonction n'est pas encore définie, mais sa structure et sa localisation dans la cellule lui imputeraient un rôle structural.   2.2.2.4.                La protéine F  Cette protéine nouvellement définie est issue d'un cadre de lecture différent de celui de la polyprotéine (décalage d'un nucléotide vers la droite), situé au sein de la région codant la capside. Elle est retrouvée dans tous les génotypes à des tailles variables (Walewski et al., 2001) et un certain nombre de sérums provenant d'individus infectés de manière chronique présentent une réactivité vis-à-vis de cette protéine. Elle semble produite à 54% de la production de la capside et localisée dans le cytoplasme (Varaklioti et al., 2002). Il se pourrait qu’elle détienne une des nombreuses fonctions attribuées à la capside (Gosert et al., 2002).   2.2.3.     La région codante : les protéines non-structurales  2.2.3.1.                La protéine NS2  La protéine NS2, d’une masse de 23 kDa, est la première protéine non structurale du génome. Elle est ancrée dans la membrane du RE, ses extrémités NH2et COOH étant dans la lumière. Son rôle principal est de cliver la jonction NS2/NS3 en association avec NS3 lors des modifications post-traductionnelles de la polyprotéine (Grakoui et al, 1993). En effet, le clivage autocatalytique 2/3 a lieu entre les nucléotides 898 et 1207 et implique un mécanisme zinc dépendant(Hijikata et al., 1993). On ne sait pas à l’heure actuelle si le zinc joue un rôle catalytique ou structural dans ce processus. Néanmoins, un site de liaison au zinc a été identifié dans la région de NS3 impliquée dans cette activité protéase et des analyses cristallographiques et biochimiques ont suggéré que le zinc était essentiel pour l’intégrité de la structure protéique de NS3 et donc de son activité sérine/protéase (DeFrancesco et al., 1996).     2.2.3.2.                La protéine NS3  C’est une protéine d’approximativement 70 kDa. Sa partie N-terminale (1/3 de la protéine) est impliquée dans le processus d’autoprotéolyse NS2/NS3 mais aussi dans le clivage entransde toutes les autres protéines non structurales : c’est sa fonction sérine protéase. Elle est efficace uniquement en présence de NS4A qui joue le rôle de cofacteur. Cette dernière interagit avec l’extrémité N-terminale de NS3 pour former une structure intégrale (Kim et al., 1996), fonctionnelle. Les 2/3 restants ont un rôle NTPase/hélicase, essentiel à la réplication virale (Suzich et al., 1993). L’activité NTPase est augmentée lors de la fixation de NS3 sur la queue poly (U) de l’ARN.
Il existe une dernière fonction de NS3 qui consiste à réguler la transduction du signal par la protéine kinase A (PKA) dans la voie de l’AMP cyclique.   2.2.3.3.                La protéine NS4A  Cette protéine de 54 aa est impliquée dans plusieurs fonctions. Elle stabilise la protéine NS3 et joue un rôle de cofacteur dans son activité sérine protéase, elle permet l'ancrage dans les membranes cellulaires des protéines impliquées dans le complexe de réplicationvia interagit son domaine N-terminal et elle avec NS5A en régulant sa phosphorylation.   2.2.3.4.                La protéine NS4B  Le rôle de cette protéine de 30 kDa n'est pas très bien défini. Il semblerait qu'elle soit un composant du complexe de réplication viral.   2.2.3.5.                La protéine NS5A  Cette protéine existe sous 2 formes de 56 et 58 kDa résultant d'une phosphorylation différentielle des résidus sérine, au niveau de régions situées en amont de l'acide aminé 2350. La phosphorylation de la forme p58 serait activée par NS4A au niveau de sites additionnels de phosphorylation situés entre les acides aminés 2200 et 2250. L'impact de ces phosphorylations sur les fonctions de NS5A est encore mal connu. Cependant, il a été proposé que NS5A possède une région de résistance à l'IFN plutôt centrale, appelée ISDR (interferon sensitivity-determining region), qui aurait la particularité d'empêcher l'inhibition de la traduction virale en interagissant avec la PKR (protéine kinase R) (Gale Jr et al, 1998). Le mécanisme est le suivant : la PKR, dont la synthèse est stimulée entre autres par un agent antiviral comme l'IFN, inhibe l'activité du facteur d'initiation de la traduction eIF2 en phosphorylant sa sous-unité a, ce qui entraîne une inhibition de la traduction virale. L'ISDR est capable d'interagir avec la PKR en l'empêchant de phosphoryler eIF2 ce qui à pour conséquence de lever l'inhibition.       2.2.3.6.                La protéine NS5B  La protéine NS5B de 68 kDa possède des séquences caractéristiques des ARN polymérases ARN dépendantes (motif RGDD) dont l'activité a été démontréein vitro. Cependant, son activité étant 10 à 20 fois plus faible que celle de la polymérase du poliovirus (Lohmann et al, 1998), il a été suggéré que seulement une petite portion de NS5B était impliquée dans cette activité. La région N-terminale semble être fortement associée à cette activité polymérase puisque, une fois cette portion délétée, on observe une chute importante, voire une disparition, de la réplication (Lohmann et al, 1997). La protéine NS5B semble localisée dans le cytoplasme, associée à la membrane du RE tandis que les formes tronquées sont transportées dans le noyau. NS5B semble aussi interagir avec les protéines NS3 et NS4A formant le complexe de réplication.   3.    Cycle de réplication   
Comme décrit précédemment, la particule infectieuse se lie aux récepteurs putatifs cellulairesvia les ectodomaines des glycoprotéines d'enveloppe E1 et E2 sous étroite interaction. Les récepteurs cellulaires impliqués dans cette reconnaissance sont les suivants : - le récepteur CD81, le mieux défini, a été décrit comme appartenant à la famille des tétraspanines (Pileri et al., 1998). Ses fonctions sont multiples. Il est impliqué dans des phénomènes d'adhésion, d'activation, prolifération et différentiation cellulaires et s'associe aux récepteurs CD4 et CD8 des lymphocytes T ainsi qu'aux récepteurs CD19 et CD21 des lymphocytes B. Il est exprimé de manière ubiquitaire à la surface des cellules de mammifères. Dans le cadre de la reconnaissance des glycoprotéines E1 et E2, la liaison semble dépendante de la conformation du récepteur qui par ailleurs a la possibilité de se dimériser multipliant sa capacité de liaison par 10. La réactivité de ce récepteur semble restreinte au génotype 1a du VHC et aux cellules lymphocytaires. - par analogie aux membres desFlaviviridae, les récepteurs des lipoprotéines de faible densité (rLDL) ont aussi été décrits comme récepteurs putatifs du VHC. En effet, la particule virale semble capable de se lier aux lipoprotéines de faible (LDL) et de très faible (VLDL) densité grâce auxquelles une endocytose cellulaire est possibleviales rLDL (Agnello et al., 1999). - les glycosaminoglycannes, exprimés de manière ubiquitaire à la surface des cellules, ont largement été décrits pour leur capacité à adsorber les particules virales avant l'interaction avec leurs récepteurs spécifiques. Des travaux sur le VHC ont mis en évidence par des phénomènes de déglycosylations l'importance de ces structures dans la capacité infectieuse des particules du VHC. - deux nouveaux récepteurs viennent d'être décrits. Le SR-B1 (Human Scavenger Receptor class B type 1) (Scarselli et al., 2002) est une glycoprotéine de 82 kDa dont l'expression semble stable dans les cellules CHO (lignée transfectée) et HepG2 (lignée d'hépatocarcinome). Il reconnaît la glycoprotéine E2 par son domaine HVR1 pour les génotypes 1a et 1b du VHC, notamment dans les cellules HepG2 (pas d'implication du CD81). Un autre récepteur vient d’être découvert. Il s’agit de lectines de type L-sign et DC-sign, situées à la surface de cellules hépatocytaires et dendritiques, respectivement (Percherancier et al., 2003).     Une fois que la reconnaissance de la particule virale par son récepteur est établie, une étape de fusion s'amorce antre les enveloppes virales et cellulaires. Cette dernière semble dépendante d'un pH acide qui entraîne un changement conformationnel de l’enveloppe virale en une forme active et permet une endocytose du virus (Flint et al., 1999). L'endosome, qui transporte la particule, fusionne avec l'enveloppe virale libérant ainsi l’ARN positif après décapsidation. L'ARN (+) est par la suite soumis à l'étape de traduction grâce à la machinerie cellulaire (ribosomes, protéines cellulaires) au niveau du RE. Les protéines virales matures synthétisées vont former, d'une part le complexe de réplication (NS3 à NS5B) associé la membrane du RE, et d'autre part les protéines structurales enchâssées au niveau de la membrane du RE et de vésicules lipidiques (protéine C). L'ARN (+) sert alors de matrice pour la synthèse de l'intermédiaire de réplication, l'ARN(-), qui à son tour va donner naissance à un grand nombre de brins positifs. Les futures particules virales bourgeonnent à partir du RE en internalisant les ARN (+) et les protéines C. Elles sont ensuite transportées par vésicules d’exocytose vers la membrane cellulaire sans passer par l'appareil de Golgi et relarguées dans le milieu extracellulaire.   4.    Polymorphisme viral   4.1. Les génotypes  Le VHC, comme tous les virus à ARN, possède un polymorphisme important du fait du manque d’activité correctrice de l’ARN polymérase (Mullan et al., 2001). Ce polymorphisme est plus ou moins
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