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Ministère de l'Education Nationale Ecole Pratique des Hautes Etudes - Sciences de la Vie et de la Terre – Mémoire présenté par Nathalie Delaunay PKC , CALPAINE ET P35 : RELATION AVEC L'APOPTOSE ET L'INFECTION VIRALE Présenté le 11 juillet 2001 en présence du jury composé de : Mr Norbert Koenig : Président Mr Yves Benyamin : Directeur EPHE() Laboratoire de Motilité cellulaire, EPHE-UMR 5539, Bat 24/cc-107/étage 4/ USTL Place E. Bataillon, F 34090 Montpellier Tel : Mme Dominique Joubert :Directrice de stage( ) INSERM U469, CCIPE, 141, rue de la cardonille, 34094 Montpellier cedex 5 Tel : - RESUME - Ce mémoire est la synthèse de deux études indépendantes et menées en parallèle. Les résultats in vitrode l'étude de la protéolyse de la PKCa par la calpaïne ont montré un profil particulier de courbe en cloche inversée. Cette courbe est spécifique de l'isoformeades PKC et ne dépend pas du type cellulaire.Les résultats fondés sur l'observation initiale de l'accumulation du domaine catalytique de la PKCa à partir du 3ème jour après infection par le baculovirus contenant le cDNA du gène codant EPHE Banque de Monographies SVT 1

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  • régulation des calpaïnes par la calpastatine

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Publié le : dimanche 1 juillet 2001
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Ministère de l’Education Nationale Ecole Pratique des Hautes Etudes -Sciences de la Vie et de la Terre –
Mémoire présenté par Nathalie Delaunay
PKC , CALPAINE ET P35 : RELATION AVEC L’APOPTOSE ET L’INFECTION VIRALE
  Présenté le 11 juillet 2001 en présence du jury composé de :  Mr Norbert Koenig : Président Mr Yves Benyamin : Directeur EPHE(benyamin@univ-montp2.fr) Laboratoire de Motilité cellulaire,EPHE-UMR 5539,Bat 24/cc-107/étage 4/ USTL Place E. Bataillon,F 34090 Montpellier Tel : 04 67 14 38 13 Mme Dominique Joubert :Directrice de stage(joubert@montp.inserm.fr ) INSERM U469, CCIPE,141, rue de la cardonille,34094 Montpellier cedex 5 Tel : 04 67 14 29 18   -RESUME -Ce mémoire est la synthèse de deux études indépendantes et menées en parallèle. Les résultatsin vitro protéolyse de la PKCa par de l’étude de lala calpaïne ont montré un profil particulier de "courbe en cloche" inversée. Cette courbe est spécifique de l’isoformeades PKC et ne dépend pas du type cellulaire.Les résultats fondés sur l’observation initiale de l’accumulation du domaine catalytique de la PKCa à partir du 3ème jour après infection par le baculovirus contenant le cDNA du gène codant
LISTE DES ABREVIATIONS
pour la PKCahumaine ont montré que la protéase responsable de l’accumulation du domaine catalytique de la PKCa est une "calpaïne-like". Cette activité "calpaïne-like" est induite lors de l’infection virale ; son inhibition diminue l’accumulation de la protéine p35 (issue du baculovirus) et du même coup l’infection virale. Par ailleurs, p35 active la calpaïnein vitro. Un lien direct existe entre les deux protéines. De plus, p35 n’est pas un substrat calpaïne, alors qu’elle est un substrat de la caspase-3. Enfin, la PKCa et la calpaïne sont impliquées dans l’apoptose d’une cellule de mammifère. Le domaine catalytique de la PKC a généré suite à la protéolyse par la calpaïne induit l’apoptose dans la cellule GH3B6. Tout activateur de calpaïne devient donc potentiellement apoptotique; c’est le cas de la protéine p35 lorsqu’elle est surexprimée dans une cellule de mammifère. Ce résultat est tout à fait nouveau et apporte un regard différent sur le rôle de la protéine p35 lors de l’infection virale. Mots clés : PKCa, calpaïne, p35, infection virale et apoptose.    AcMNPV:Autographia californiamulticapsid nuclear polyhedrosis virus ADN: Acide désoxyribonucléique AIF: activated inducing factor Apaf-1: apoptotic protease activating factor-1 ANT: adenine nucleotide translocator Asp: résidu acide aspartique (D) BH: Bcl-2 homology BIR: baculovirus AIP repeat CAD: caspase-activated DNAse CaMKIV: calmodulin-dependent protein kinase CARD: caspase recruitment domain CD95: cluster differenciation 95 Ced: cell death abdormal CTL: lymphocyte T cytotoxique Crm A: cytosine response modifier A Cyt c: cytochrome c Cy3: cyanine-3
nisaeMA  kRK EPKietorp desanik ngen itovateacti
CMV: cytomégalovirus
DAG: diacylglycérol
DED: death effector domain
GFP: green fluorescent protein
Kbkilo base
IP3: inositol tri-phosphate
ICE: interleukin 1-bconverting enzyme
IAP: inhibitor of apoptosis
MIHA/B/C: mammalian IAP homolog A/B/C
MEK :
LDH: lactate deshydrogénase MAPK : m
KDa: kilo Dalton
PARP: poly(ADP-ribose) polymérase
NGF: nerve growth factor
NAIP: neuronal apoptosis inhibitory protein
MOI: multiplicity of infection
PEI: polymère d’éthylénimine
PIP2: phosphatidyl inositol bi-phosphate
DTT: dithiothréitol
FADD: Fas associated protein with death domain
FITC: fluorescein isothiocyanate
FLICE FADD-like ICE
DIABLO/SMAC: direct IAP binding protein with low pI
DISC: death inducing signaling complex
DFF: DNA fragmentation factor
DMSO: diméthylsulfoxyde
PKC: protéine kinase C Pfu: plaque forming unit PLC: phospholipase C PMA: phorbol myristate acétate PMSF: phénylméthylsulfonyl fluoride PTP: pore transitoire de perméabilité RAIDD: Rip-associated ICE homologous with death domain RCPG: récepteur couplé aux protéines G RIP: receptor interacting protein SDS: sodium dodécyl sulfate Sf:Spodoptera frugiperda TCA: acide trichloacétique TNF-R1: récepteur au TNF TPA: 12-O-tétradécanoylphorbol-13-ester TRADD: TNF-R1-associated protein with death domain TRH: thyrotropin releasing hormon VDAC: voltage dependent anionic channel   
TABLE DES MATIERES
   1. L'apoptose ou la mort cellulaire programmee 1.1. Historique 1.1.1. Qu’est-ce que l’apoptose ? 1.1.2. Les fonctions de l’apoptose au cours du développement 1.1.3. Changements morphologiques et moléculaires 1.1.3.1. Changements morphologiques
1.1.3.2. Caractéristiques moléculaires
1.2. Les caspases, effecteurs du programme apoptotique
1.2.1. L’apoptose est contrôlée par un programme génétique
1.2.2. Caractères généraux des caspases
1.2.3. Le rôle clé des caspases dans le programme apoptotique
1.3. La transduction du signal apoptotique
1.3.1. Les différentes phases de l’apoptose
1.3.2. Les deux voies de transduction du signal apoptotique
1.3.2.1. La voie du TNF ou du ligand Fas
1.3.2.2. La voie mitochondriale
1.4. Les inhibiteurs de caspases
1.4.1. Les inhibiteurs naturels p35 et IAP
1.4.1.1. La protéine p35 du baculovirus
1.4.1.2. Interaction p35-caspase
1.4.1.3. Les IAP
1.4.2. Les inhibiteurs synthétiques de caspases
1.5. Les gènes de la famille Bcl-2, inhibiteurs d’apoptose
 
2. Les calpaïnes
2.1. Caractères généraux des calpaïnes
2.2. Structure des calpaïnes
2.3. Régulation des calpaïnes
2.3.1. Activation des calpaïnes
2.3.2. Régulation des calpaïnes par la calpastatine
2.4. Les calpaïnes dans le programme apoptotique
 
3. Les proteines kinases C
3.1. Caractères généraux des protéines kinases C
INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE
3.2. Structure des PKC 3.3. Régulation des PKC 3.3.1. Activation des PKC 3.3.2. "Down-régulation" des PKC 3.4. Les PKC dans le processus apoptotique     1. L’apoptose ou la mort cellulaire programmée           1.1. Historique  1.1.1. Qu’est-ce que l’apoptose ?            La mort cellulaire programmée ou apoptose constitue une étape essentielle développement du des organismes pluricellulaires. De plus, c’est un processus de mort cellulaire physiologique très conservé au cours de l’évolution, puisque certaines cellules d’ insectes et de plantes peuvent également rentrer en apoptose lorsqu’elles sont infectées par un virus ou une bactérie.  L’origine du mot apoptose vient du grec ancien "la chute", et était utilisée pour décrire la chute des feuilles des arbres en automne, la chute des pétales des fleurs qui se fanent, "une métaphore pour une mort à la fois naturelle, inéluctable et programmée" (J.C. Ameisen.La sculpture du vivant)  Observée pour la première fois en 1842 par Vogt chez les batraciens au cours de leur différentes métamorphoses, puis décrite par l’embryologiste Glücksmann en 1951 dans divers tissus chez les invertébrés et vertébrés, Kerr et Wyllie en 1972 ont été les premiers à parler d’apoptose proprement dite grâce à leurs observations en microscopie électronique. Ce sont ces auteurs qui ont (re) découvert et (re) nommé l’apoptose, initialement définie par Flemming en 1855 sous le terme de "chromatolyse". En effet, Flemming avait décrit avec précision des phénomènes de fragmentation du noyau et du corps cellulaire en pleine autodestruction.   L’idée nouvelle proposée par Kerr et Wyllie est que la mort de cellules par apoptose serait comparable d’un tissu à l’autre et d’un animal à l’autre ; ce type de mort reflèterait un "programme" intracellulaire, c’est-à-dire mis-en-oeuvre par la cellule elle-même. Ce programme serait activé ou inhibé par divers stimuli environnementaux, physiologiques ou encore pathologiques. Des anomalies dans le contrôle de la mort cellulaire programmée peuvent contribuer à l’apparition de maladies mortelles. C'est le cas de certains cancers ou encore de maladies aiguës touchant toutes sortes d’organes comme les hépatites virales, les ischémies cérébrales, l’infarctus du myocarde, toutes caractérisées par une disparition massive de cellules par apoptose.                        Les fonctions de l’apoptose au cours du développement1.1.2.
 C’est au cours du développement embryonnaire que le processus apoptotique a tout d’abord été étudié. Des mutants d'un petit ver rond ou nématode du nom deCaenorhabditis elegansont été observés. Ces mutants qui sont déficients dans le programme apoptotique, possèdent 15% de cellules en plus que les vers normaux. Ils ont une morphologie et un comportement normal par contre, leur locomotion est affectée (Elliset al la1986).Des mutants comparables ont été réalisés chez., drosophile, mais de façon surprenante, ceux-ci meurent au cours du développement (Whiteet al.,1994).Chez les vertébrés, des souris "knock out" pour lacaspase-3, c’est-à-dire chez lesquelles le gène codant pour la caspase-3 a été inactivé, meurent peu après la naissance et présentent un nombre de cellules supplémentaire dans leur système nerveux central (Kuidaet al., 1996). Ce phénomène serait dû à une déficience dans le contrôle du programme apoptotique des cellules neuroépithéliales. Les auteurs ont cependant remarqué que l’exécution du programme apoptotique semble se dérouler normalement dans les autres organes de ces souris génétiquement modifiées.  Selon Jacobson en 1997, les principales fonctions associées à l’apoptose au cours du développement animal sont : 1- la formation des extrémités, bien que l'équipe de Golstein (Chautanet al souris implique unperte des cellules interdigitales chez l’embryon de., 1999) ait montré que la autre mode de mort cellulaire : la nécrose (lorsque le programme apoptotique est déficient), 2-l’élimination de structures indésirables, par exemple la queue des têtards, 3- le contrôle du nombre de cellules : c’est le cas de certaines régions du système nerveux central où les oligodendrocytes sont en excès. Seuls les oligodendrocytes qui établissent un contact avec un neurone peuvent survivre : plus de la moitié d’entre eux est éliminée par apoptose, 4- l’élimination de cellules anormales, non fonctionnelles, ayant une localisation aberrante, ou devenues dangereuses pour l’organisme ; un exemple parlant est la migration des lymphocytes T à travers le thymus : 99% d’entre eux meurent en raison d'une trop forte réactivité (ils sont dits auto-réactifs) ou d'une absence totale de réactivité. Enfin (5) les cellules différenciées mais sans organelles, comme par exemple les hématies qui perdent leur noyau au cours de leur différenciation.  L’apoptose n'est pas une particularité du développement. Elle existe aussi chez l’adulte, lors de processus biologiques tels que l'élimination des thymocytes auto-réactifs (Smithetal., 1989), ou encore lors de l’atrophie d’une glande endocrine ; c'est par exemple le cas de l’hypophyse chez la femme enceinte qui augmente de volume, et qui suite à l’accouchement retrouve sa taille initiale grâce à l’exécution du programme apoptotique (Kuliget al., 1999).   1.1.3. Changements morphologiques et moléculaires                                                    1.1.3.1. Changements morphologiques  L’apoptose s’oppose à un autre type de mort cellulaire, la nécrose "Contrairement au . caractère anarchique et cataclysmique de la nécrose, l’apoptose se déroule d’une manière étrangement discrète et stéréotypée" (J.C. Ameisen.La sculpture du vivant).  Alors que la nécrose donne l’image d’un phénomène d’explosion, l’apoptose ressemble à un phénomène d’implosion. La cellule qui déclenche son suicide commence tout d’abord par couper tout contact avec son environnement. Elle se détache et s’écarte des cellules voisines par perte de jonctions cellulaires. Puis, elle se morcèle de manière ordonnée : elle condense puis fragmente son noyau. La membrane externe se modifie, mais reste intacte empêchant la libération du milieu intracellulaire. Dans le même temps, le corps cellulaire se condense, lui aussi, puis se fragmente en petites vésicules : les corps apoptotiques ; ces corps apoptotiques sont par la suite reconnus et éliminés par les macrophages. Cette mort rapide, solitaire et sans "fracas" n’entraîne habituellement ni lésion, ni inflammation, ni
cicatrisation.                                   1.1.3.2. Caractéristiques moléculaires  Deux critères moléculaires principaux servent à identifier une cellule apoptotique d’une cellule nécrotique ou normale. Le premier critère concerne la membrane cellulaire. En effet, s’opère au cours de l’apoptose une altération de la perméabilité membranaire : on observe une asymétrie de la bicouche phospholipidique provoquée par la translocation de la phosphatidylsérine, de la membrane interne vers l’extérieur de la cellule. La phosphatidylsérine ainsi exposée pourra être détectée à l’aide d’un marqueur spécifique, l’annexine V. L’annexine V couplée à la fluorescéine, et en présence de calcium se lie avec une grande affinité à la phosphatidylsérine, l’un des phospholipides majeurs de la membrane cellulaire. Ce marquage FITC-annexine V, en plus d’une coloration d’exclusion au iodure de propidium (colorant vital) permet de distinguer par cytométrie de flux les cellules apoptotiques, des cellules nécrotiques ou des cellules normales (Vermesetal., 1995).  Le deuxième critère est la fragmentation de l’ADN en séquences multiples de 150 à 200 paires de bases. Ces 200 paires de bases correspondent à la longueur de l’ADN enroulé autour des octamères d’histones dans un nucléosome. Cette fragmentation régulière qui peut être visualisée par migration de l’ADN génomique d’une cellule apoptotique sur gel d’élèctrophorèse montre un aspect typique "en échelle".  Ces changements morphologiques et moléculaires sont provoqués par un large spectre de signaux de mort physiologiques ou appliqués de façon expérimentale à la cellule, et sont observés comme l’avaient fait auparavant Kerr et Wyllie dans divers types cellulaires et espèces. De fait, les voies de transduction du signal de mort indépendantes convergent vers un programme de mort cellulaire commun, programme dont les effecteurs essentiels sont des protéases appelées caspases.   1.2. Les caspases, effecteurs du programme apoptotique  1.2.1. L’apoptose est contrôlée par un programme génétique  La découverte de l’existence de protéines qui participent au contrôle de la vie et de la mort des cellules d’un embryon n’est pas venue de l’étude des embryons de mammifères, de batraciens ou même d’oiseaux, mais, pour des raisons de facilité d'observation et de rapidité de développement, de l’étude du développement deCaenorhabditis elegans.  A l’âge adulte, le corps deCaenorhabditis elegansdont la taille est d’un millimètre environ est composé d’exactement 959 cellules. Sa durée de vie est de deux semaines. Au cours de son développement qui ne dure que trois jours, l’embryon deCaenorhabditis eleganssubit des épisodes de morts cellulaires. La cellule-oeuf donne naissance à 1090 cellules-filles. Les 131 cellules (constituées en majorité par des cellules neuronales) disparaissent par un processus ayant toutes les caractéristiques de l’apoptose, car elles sont rapidement absorbées par les cellules voisines. Deux gènes effecteurs de l’apoptose,ced-3etced-4, ainsi qu’un gène répresseurced-9ont été identifiés par Ellis en 1986.cedest l’abréviation decell death-abnormal, mortsoit en français "anomalie de la cellulaire".  En poursuivant la caractérisation de ces trois gènes, les mêmes auteurs ont montré une interaction étroite entre les produits des gènesced-3,ced-4etced-9Ced-3 et Ced-4 sont tous deux. nécessaires au déclenchement de l’apoptose, cependant, le véritable "exécuteur" du programme apoptotique au sein de la cellule est la protéine Ced-3. Néanmoins, le contrôle de l'apoptose s'effectue au niveau de Ced-4 qui active Ced-3, et qui d'autre part en se complexant à Ced-9 inhibe l'activité de
Ced-3 ; Ced-9 ne pouvant être inhibiteur sans Ced-4. Ced-4 est donc un intermédiaire. Ainsi, le fait qu'unecellule entre ou non en apoptose dépend d’un équilibre entre les quantités respectives de Ced-3, Ced-4, Ced-9.  Les produits de ces gènes présentent des homologues chez les mammifères. Ainsi Ced-4 est l’homologue du facteur pro-apoptotique Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1). L’équivalent de Ced-9 est la protéine Bcl-2. Son mode d’action sera détaillé plus loin. Quant à Ced-3, il s'agit du prototype d’une famille de protéases à cystéine appeléecaspase. Son homologuechez les mammifères est ICE (interleukin-1b-converting enzyme), une enzyme décrite originellement comme intervenant dans la maturation et l’activation de la pro-IL1ben IL1b, cytokine impliquée dans la réponse cellulaire inflammatoire (Thornberryet al., 1992). Notons cependant que la surexpression du gène murin ICE dans des fibroblastes de rat est capable d'induire l’apoptose dans les cellules Rat1 (Miura et al.,1993).                      1.2.2. Caractères généraux des caspases  Les caspases forment une famille comptant à ce jour 14 membres connus chez les mammifères. Les caspases possèdent toutes une cystéine au niveau de leur site actif. Elles reconnaissent un motif tétrapeptidique de type D-X-X-D*-X, où X représente un résidu aminoacide quelconque. De fait, les caspases ont la propriété de cliver leur substrat après le résidu acide aspartique * (Alnemrietal., 1996). Les caspases sont de deux types : 1- les caspases initiatrices qui jouent un rôle déterminant au cours de la phase d’induction ou phase précoce de l’apoptose, et qui sont chargées d’initier et de transmettre le signal de mort ; 2- les caspases effectrices, dont le rôle plus en aval est de cliver des substrats ; l'intégrité de ces substrats étant essentielle à la survie de la cellule.                        1.2.3. Le rôle clé des caspases dans le programme apoptotique  Les caspases sont présentes dans la cellule sous forme zymogène ou pro-caspase c’est-à-dire avec une activité enzymatique intrinsèque restreinte. Lorsqu’elles sont activées, elles se présentent sous la forme d’un hétérotétramère composé de deux sous-unités identiques d’environ 20 kDa (prodomaine), associées à deux autres sous-unités également identiques d’approximativement 10 kDa qui constituent le domaine caspase proprement dit. Les sous-unités de 20 et 10 kDa sont libérées par "trans-clivage" ; ces protéolyses successives aboutissent à des réactions autocatalytiques, c’est-à-dire qui s’amplifient de façon exponentielle. Cette réaction autocatalytique est initialisée par l’interaction d’une pro-caspase avec des récepteurs spécifiques chargés de transmettre le signal de mort. Les caspases responsables de ces premières réactions en chaîne sont dites initiatrices. Leur inhibition peut empêcher le signal pro-apoptotique de se propager. Lorsque le processus protéolytique s’amplifie, les caspases effectrices sont à leur tour activées.  D’un point de vue structural, selon Villa en 1997, les caspases initiatrices diffèrent des caspases effectrices par la longueur de leur prodomaine ; en effet, les caspases initiatrices qui constituent ce premier groupepossèdent un prodomaine constitué de 60 à 100 résidus acides aminés. Le 2ème groupe formé par les caspases effectrices diffèrent des précédentes par un prodomaine court (28 résidus seulement).  C’est la longueur et la composition du prodomaine qui va permettre aux caspases initiatrices d’interagir ou non avec des protéines adaptatrices. Ces protéines adaptatrices telles que
TRADD (TNF-R1-associated protein with death domain), RAIDD (Rip-associated ICE homologous with dead domain), FADD (Fas associated protein with death domain) ou RIP (receptor interacting protein) font le lien entre les récepteurs de mort (à la surface de la cellule, et ancrés dans la membrane cellulaire), et les caspases initiatrices. L’interaction caspase initiatrice-protéine adaptatrice se fait via : les domaines CARD (caspase recruitmentdes domaines particuliers de 2 types domain), et DED (death effector domain). Le domaine CARD intervient par ailleurs dans la formation de l’apoptosome : la caspase-9 interagit avec Apaf-1via c parune séquence CARD ; c’est la libération de cytochrome la mitochondrie qui permet la formation du complexe caspase-9/Apaf-1 constituant l’apoptosome (Li et al., 1997).  Le mode d'action des caspases effectrices est différent, car elles n'ont pas besoin de protéines adaptatrices pour être activées. Elles présentent en effet un prodomaine court, et sont ainsi dépourvues de domaine CARD ou DED. Elles s’autoactivent par "trans-clivage" mais peuvent aussi être activées par d’autres caspases, voire d’autres protéases telles que le granzyme B (protéase à sérine), molécule exprimée lors de la dégranulation des CTLs (lymphocytes T cytotoxiques). Ce phénomène conduit ces cellules T vers l’apoptose (Shietal., 1996).            1.3. La transduction du signal apoptotique                       1.3.1. Les différentes phases de l’apoptose  L’apoptose se déroule en trois phases : tout d’abord une phase d’induction,spécifique du signal de mort, et qui conduit à l’activation de caspases. Ces signaux de mort peuvent être très différents : physiologiques comme pharmacologiques, intra comme extra cellulaires.  Suit unephase d’exécution,phase critique durant laquelle le programme apoptotique est en marcheviaune cascade d'activation orchestrée par les caspases ; lorsque les caspases effectrices sont activées, elles dégradent et inactivent en particulier certaines protéines structurales du cytosquelette, dont l'actine ou la lamine A ; lorqu'elle est protéolysée, cette dernière induit une perte de rigidité de la membrane nucléaire, et déstructure la cellule. Cet évènement tardif de l’apoptose précède la désintégration du noyau ou le clivage internucléosomal de l’ADN ; ce clivage est orchestré par une endonucléase bien particulière, la CAD (caspase-activated DNAse). Cette enzyme est normalement inactivée par la fixation de son inhibiteur, l’iCAD, appelée également DFF (DNA fragmentation factor). En situation apoptotique, l'iCAD est clivée par une caspase, et ceci conduit à la libération de l’endonucléase active, qui produit alors l'échelle d’ADN si caractéristique (Enarietal., 1998). D’autres protéines nucléaires impliquées dans la réparation de l’ADN comme p53 ou la PARP (poly(ADP-ribose) polymérase) sont aussi clivées par une caspase. De même, les PKC (protéine kinase C), comme les PKCd(Emotoet al., 1995) et PKCq(Dattaet al., 1997) impliquées dans diverses voies de transduction, sont non seulement substrats de caspases, mais sont activées de manière constitutive, suite à leur clivage par la caspase.  Toutes ces protéolyses entraînent la cellule vers laphasede dégradationirréversible au cours de laquelle elle acquiert toutes les caractéristiques morphologiques et biochimiques que nous avons vu auparavant.                        1.3.2. Les deux voies de transduction du signal apoptotique  Green a proposé en 1998 deux voies indépendantes de transduction du signal apoptotique. Ces deux voies aboutissent à l’activation d’un tronc commun constitué par les caspases.                                  1.3.2.1. La voie du TNF ou du ligand Fas
 Au cours de la phase d’induction, l’apoptose est induite par des molécules présentes à la surface cellulaire comme le ligand Fas ou encore le ligand TNF. Chaque ligand active respectivement son récepteur (CD95-Fas-APO-1) et TNF-R1. Ces deux ligands synthétisés sous formes de trimères se complexent avec leur récepteur. Ainsi, ils s'oligomérisent et déclenchent le signal apoptotique. Ces récepteurs possèdent un domaine cytoplasmique qui leur permet d'interagir avec les caspases initiatrices pour former des complexes viades domaines de liaison spécifiques comme le domaine DISC (death inducing signaling complex). Ces complexes moléculaires sont composés de protéines adaptatrices que nous avons vu auparavant comme FADD, TRADD ou encore la caspase-8, appelée aussi FLICE (FADD-like ICE). La constitution de DISC entraîne le clivage protéolytique de FLICE. FLICE, ainsi séparée de sa séquence N-terminale devient active et déclenche l’activation de caspases effectrices (Muzioet al., 1996). D’autres constituants interviennent en tant que protéines d’échafaudages : c'est par exemple le cas de RIP qui est indirectement associée au récepteur TNF (TNF-R1)viaTRADD. Ces domaines de liaison sont représentés.                                   1.3.2.2. La voie mitochondriale  La deuxième voie apoptotique fait intervenir des changements mitochondriaux induits par la présence de molécules pro-apoptotiques apparentées à Bcl-2, comme par exemple Bax ; leur mode d’action sera détaillé au§ 1.5.  La mitochondrie est composée de deux membranes : une membrane externe perméable à de nombreuses molécules. Cette membrane mitochondriale contient entre autres un canal appelé VDAC (voltage dependant anionic channel) et qui forme avec le transporteur ANT (adenine nucleotide translocator) situé au sein de la membrane interne, le pore transitoire de perméabilité ou PTP. De façon très succincte, lors de l’apoptose, la mitochondrie subit des modifications de perméabilité de ses deux membranes : le potentiel transmembranaire (DFm) diminue, ce qui se traduit par un gonflement de l'organelle et l’ouverture du PTP. Cette ouverture permet alors au cytochrome c d’être libéré depuis le compartiment intermembranaire mitochondrial vers le cytoplasme de la cellule pour interagir avec la protéine Apaf-1. Apaf-1 s’associe à son tour à la caspase-9, et l’apoptosome formé active les caspases effectrices. D’autres molécules sont aussi libérées dans l’espace intermembranaire de la mitochondrie au cours de l’apoptose. C’est le cas de l’AIF (activated inducing factor-1). Cette molécule semble à elle seule suffisante pour induire la protéolyse de la membrane nucléaire et la fragmentation de l’ADN, caractéristiques de la phase d’exécution du programme apoptotique (Susin et alle tronc commun de caspases effectrices.., 1999). Ces deux voies se rejoignent pour activer  L'inhibition du programme apoptotique peut se faire de différentes manières, impliquant des molécules exogènes, soit synthétisées par des virus, soit des inhibiteurs synthétiques ; ces deux types d’inhibiteurs permettent d’inactiver un grand nombre de caspases afin de bloquer efficacement le programme apoptotique. Un troisième type d'inhibiteur de l'apoptose est représenté par des protéines mitochondriales : les produits des gènes de la famille Bcl-2 (Greenet al., 1998).            1.4. Les inhibiteurs de caspases  1.4.1. Les inhibiteurs naturels p35 et IAP  En 1991 l’équipe de Lois Miller et Rollie Clem découvrent des baculovirus mutants, présentant des mutations dans deux gènes. Ces virus se propagent très difficilement chez l'insecte, leur hôte, contrairement au baculovirus natif. Les protéines virales altérées chez ces mutants empêchent les cellules de rentrer en apoptose en réponse à la pénétration et la présence du virus. Ces deux protéines sont la p35 et l’IAP (inhibitor of apoptosis). C’est la découverte des caspases qui a
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