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MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE présenté par Lionel Gibert pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Titre : Caractérisation des canaux ioniques dans l'épithélium branchial de truite (Oncorhynchus mykiss) et dans l'érythrocyte de lamproie (Petromyzon marinus). en vue de la soutenance du : 28 janvier 2001 devant le jury suivant : Mme Geneviève Cordier – Président Mr Alain Van Wormhoudt – Rapporteur Mr Serge Thomas – Examinateur Mr Guy Nonnotte – Examinateur Laboratoire : Evolution moléculaire et Adaptation Directeur : Mr Alain Van Wormhoudt. E.P.H.E. (Sciences de la Vie et de la Terre) e-mail : Laboratoire : Unité de Recherche en Physiologie Cellulaire Directeur : Mr Serge Thomas. Station Biologique de Roscoff e-mail : RESUME Les poissons téléostéens vivent dans des environnements qui sont en déséquilibres osmotiques avec leurs fluides corporels. En conséquence, ils doivent faire face à des flux EPHE Banque de Monographies SVT 1

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Publié le : lundi 1 janvier 2001
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MINISTERE DE L’EDUCATION NATIONALE
ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre
MEMOIRE présenté par Lionel Gibert
        pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes  Titre : Caractérisation des canaux ioniques dans l’épithélium branchial de truite (Oncorhynchus mykiss) dans l’érythrocyte de lamproie etP(etromyzon marinus).  en vue de la soutenance du : 28 janvier 2001 devant le jury suivant :  
Mme Geneviève Cordier –Président Mr Alain Van Wormhoudt –Rapporteur Mr Serge Thomas –Examinateur Mr Guy Nonnotte –Examinateur
 Laboratoire: Evolution moléculaire et AdaptationDirecteur : Mr Alain Van Wormhoudt. E.P.H.E. (Sciences de la Vie et de la Terre)  e-mail :avw@cimrs1.mnhn.fr   Laboratoire:Unité deRecherche enPhysiologieCellulaire    Directeur : Mr Serge Thomas. Station Biologique de Roscoff  e-mail :ft.hformas@sb-roscof    RESUME
 Les poissons téléostéens vivent dans des environnements qui sont en déséquilibres osmotiques avec leurs fluides corporels. En conséquence, ils doivent faire face à des flux
passifs d’eau et d’ions. Ainsi, en eau douce ils subissent des pertes d’ions accompagnées d’entrées massives d’eau. Ces mouvements passifs d’ions sont contrebalancés par la présence de mécanismes compensateurs impliquant les épithélia branchiaux, gastro-intestinaux et rénaux. L’importante surface d’échange de l’épithélium branchial associée à sa localisation entre les milieux intra et extra-corporels en font le site privilégié pour ces échanges ioniques. Au niveau de l’épithélium branchial les mécanismes compensateurs sont méconnus. Ils impliquent non seulement des transporteurs membranaires tels que les antiports, les symports et les pompes mais également des canaux ioniques. L’approche par la technique du « patch-clamp » nous a permis de mettre en évidence les voies de conductance ioniques présentes dans la membrane des cellules branchiales dissociées de la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss). Quatre voies de conductance ont pu être identifiées. Une voie de conductance chlore rectifiée sortante inhibée par le DIDS, le NPPB, le DPC et la glybenclamide ainsi qu’une voie de conductance sodique inhibée par l’amiloride et deux voies de conductance potassiques, l’une inhibée par le baryum et la lidocaine et l’autre sensible au pinacidil et à la glybenclamide. De plus, les expérimentations réalisées en présence d’acide okadaïque ou de saxitoxine, principales phycotoxines rencontrées lors des efflorescences algales sur les côtes bretonnes, ont révélé une sensibilité des courants membranaires globaux à l’acide okadaïque. Outre l’appareil branchial, les érythrocytes constituent une cible privilégiée pour de nombreuses toxines. Au niveau de l’appareil branchial, la proximité des épithélia branchiaux avec le réseau vasculaire contribue à la relation étroite qui existe entre les faces séreuses des épithélia et les érythrocytes. Ainsi, des travaux préliminaires sur la caractérisation des canaux ioniques présents dans la membrane des érythrocytes de lamproie (Petromyzon marinus) ont été entrepris afin de pouvoir tester, ultérieurement, les effets des toxines marines sur ces cellules. Ces travaux ont révélé la présence d’un canal potassique de type KATP sensiblel’existence d’un canal potassique activé par les ions au baryum, ainsi que calcium.  Mots clés: « patch-clamp », épithélium, téléostéens, canaux ioniques, absorption de NaCl, truite arc-en-ciel,Oncorhynchus mykiss, érythrocytes, lamproie,Petromyzon marinus, régulation du volume cellulaire.         
                                         
 
Sommaire   
Liste des abréviations  Introduction  Etat de la question  Références bibliographiques
 
                         
Liste des abréviations   
pS : picoSiemens. nS : nanoSiemens. p : picoAmpère. A - entrante.d ctance γ : u con + γ : conductance sortante. γER: conductance au point d’inversion. Erou Erev : potentiel d’inversion des courants. Vp: potentiel imposé à la pipette. P 0: probabilité d’ouverture du canal. P ion X. X: perméabilité de la membrane pour l’ τo :constante de temps d’ouverture d’un canal.
τf :constante de temps de fermeture d’un canal. IC50 obtenir 50% de: concentration, pour le produit X, nécessaire pour l’effet maximal. PO2 pression partielle en oxygène. : PCO2 pression partielle en dioxyde de carbone. : Rb+ : rubidium. Cs+ césium. :    Li+ : lithium. 9-AC : anthracene-9-carboxylate. NPPB : acide 5-nitro-2-(3-phénylpropinoamino) benzoïque. DIDS : acide 4,4’-diisothiocyanostilbène-2,2 disulfonique. DPC : diphénylamine carboxylate. SITS : 4 acétamino-4’-isothicyanostilbène-2, 2’-disulfonate. TEA : tétraéthylamonium. NMDG : N-méthyl-D-glucamine. STX : saxitoxine. OA : acide okadaïque. EDTA : acide éthylènediamine-tetraacetique. MTX : maïtotoxine. ORCC : “Outwardly Rectifying Chloride Channel”. SK channels : canal K+de faible conductance activé par le calcium (« Small K+channels »).   IK channels : canal K+ conductance intermédiaire activé par le calcium (« de Intermediate K+channels »).  BK channels : canal K+de forte conductance activé par le calcium (« Big K+channels »).  KCa : canal K+activé par le calcium identifié dans le globule rouge humain. NSC : canal cationique non sélectif. CFTR : “Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator”. DAT : “Digital Audio Tape”.                        LJP : “Liquid Jonction Potentiel”. CFP : “Ciguatera Fish Poisonning”. PSP : “Paralytic Shellfish Poisonning”. DSP : “Diarrhetic Shellfish Poisonning”. ASP : “Amnésic Shellfish Poisoning”. NSP : “Neurologic Shellfish Poisonning”.
RVD : “Regulatory Volume Decrease”. AMPc : Adénosine monophosphate cyclique. GMPc : Guanosine monophosphate cyclique.   
INTRODUCTION
           Les poissons téléostéens vivent dans des environnements en déséquilibres osmotiques avec leurs fluides corporels. Ils doivent donc faire face à des mouvements passifs d’eau et d’ions. Ces mouvements sont contrebalancés par des mécanismes compensateurs impliquant les épithélia gastro-intestinaux, rénaux et branchiaux. Les échanges d’eau sont effectués majoritairement au niveau des épithélia rénaux et gastro-intestinaux, tandis que les transferts d’électrolytes sont régis par les épithélia branchiaux et gastro-intestinaux. L’importante surface d’échange de l’épithélium branchial, associée à sa localisation entre les milieux intra-corporels et extra-corporels en font le site privilégié pour les échanges ioniques. A ce jour, très peu de connaissances sont disponibles sur la nature et le rôle des transporteurs membranaires qui interviennent dans le maintien de l’homéostasie cellulaire. Les schémas proposés pour la sécrétion ou l’absorption d’ions par l’épithélium branchial des poissons téléostéens sont encore imprécis et reposent surtout sur des observations de flux isotopiques et des mesures de conductances globales combinées à l’utilisation d’inhibiteurs des différents transporteurs membranaires. Plus récemment, des expérimentations par la technique électrophysiologique du « patch-clamp » ont été entreprises sur des cellules branchiales en culture afin de clarifier les mécanismes de régulation ionique et de préciser les types cellulaires impliqués. Le premier volet de notre étude a eu pour objectifs d’identifier par la technique du « patch-clamp » les voies de conductances ioniques présentes dans la membrane des cellules dissociées de l’épithélium branchial de truite (Oncorhynchus mykiss) et d’étudier leurs dysfonctionnements sous l’effet des toxines marines. Par l’emploi de cellules dissociées, nos expérimentations se démarquent des premières études réalisées par la même technique sur des cellules en culture. Cette approche offre
deux avantages. D’une part, les procédés pour l’obtention des cellules dissociées sont plus aisés à mettre en œuvre que ceux pour l’obtention de cellules branchiales en culture. D’autre part, les membranes des cellules fraîchement dissociées ne présentent à leurs surfaces que des transporteurs natifs. Pour le modèle animal, notre choix s’est porté sur la truite arc-en-cielOncorhynchus mykiss. Ce poisson téléostéen est euryhalin, il offre donc l’opportunité d’étudier les processus de régulation ionique sur un épithélium branchial absorbeur, lorsque le poisson est maintenu dans son environnement aquatique, l’eau douce, mais également d’étudier les processus de régulation ionique sur un épithélium sécréteur, lorsque le poisson est acclimaté en eau de mer. La nature recèle une grande variété de substances produites par les animaux ou les végétaux et dont on découvre progressivement les effets nuisibles. Parmi ces substances figurent les phycotoxines, molécules produites par les micro-algues du phytoplancton et dont certaines, comme l’acide okadaïque et la saxitoxine, sont connues pour les intoxications dont elles sont responsables. Ces deux molécules sont produites en abondance lors des efflorescences algales, phénomène devenu épisodique sur les côtes bretonnes, où elles occasionnent la mort prématurée de nombreuses truites dans les fermes aquacoles. La position de l’appareil branchial, en contact direct avec le milieu environnant, en fait une cible privilégiée pour les phycotoxines Il est donc intéressant d’étudier les effets de ces deux toxines sur l’épithélium branchial de truiteOncorhynchus mykiss. Parallèlement des travaux ont été menés sur les érythrocytes de lamproiePetromyzon marinus. Ce deuxième volet de notre étude a eu pour objectif de caractériser les canaux présentes dans la membrane de ces cellules. En effet, outre l’appareil branchial, les érythrocytes constituent une cible privilégiée pour les toxines. Au niveau de l’appareil branchial, la proximité de la face séreuse, l’épithélium branchial avec le réseau vasculaire hypertrophié, autorise le passage de nombreuses molécules dans le sang. La principale caractéristique des érythrocytes de lamproie est l’absence d’un échangeur Cl-/HCO3-fonctionnel. Or, le profil pharmacologique des voies de transports pour les ions potassium, chlorure et pour l’échangeur Cl-/HCO3-, sont identiques. Cette caractéristique des érythrocytes de lamproie nous fournit l’opportunité d’étudier le rôle et la régulation des canaux ioniques en l’absence d’un échangeur Cl-/HCO3- impliqué dans de échangeur nombreux processus cellulaire.    
  
 ETAT DE LA QUESTION
Les canaux ioniques constituent l’un des principaux mécanismes de transport épithélial pour le passage des ions à travers la membrane des cellules. Depuis une vingtaine d’années l’application de nouvelles approches expérimentales a permis de caractériser de nombreux canaux ioniques présents dans les épithélia tels que la peau de grenouille (Larsenet al., 1987), la vessie urinaire (Palmer, 1982), la glande rectale de requin (Gregeret al., 1987; Gregeret al., 1985), la branche grêle ascendante de Henle (Wanget al., 1997). Bien que de nombreux canaux ioniques soient identifiés, relativement peu d’informations sont disponibles sur le nombre et le rôle de ces canaux ainsi que sur leur régulation (pour revue Van Driessche et Zeiske, 1985). En rapport avec leurs fonctions et leurs localisations, les épithélia expriment dans leurs membranes cellulaires de nombreux transporteurs ioniques. Suivant leurs localisations, aux interfaces entre les milieux extracorporels et intracorporels les épithélia assurent des fonctions variées : le maintien de l’équilibre hydrominéral, la régulation des échanges acido-basiques et gazeux, l’absorption d’eau et de nutriments. Les épithélia présentent une organisation structurale adaptée aux fonctions qu’ils remplissent. Ils sont constitués d’une ou plusieurs couches de cellules qui expriment à leurs surfaces des transporteurs épithéliaux variés, suivant la nature de l’épithélium, et qui sont liées entre elles par des jonctions serrées localisées sur leur membrane apicale. Selon la nature des transporteurs épithéliaux et le nombre de jonctions serrées il est possible de distinguer trois types d’épithélia : -                    les épithélia absorbeurs lâches -                    les épithélia absorbeurs serrés -                    les épithélia sécréteurs serrés En conséquence, deux voies sont possibles pour le transport des ions à travers les épithélia : par mouvements à travers la cellule épithéliale ou bien par diffusion passive à travers les jonctions serrées, uniquement pour les épithélia lâches. Le modèle admis pour expliquer les mouvements d’ions à travers les épithélia est celui de Koefoed-Johnsen et Ussing (Koefoed-Johnsen et Ussing, 1958). Originellement, ce modèle a été proposé pour décrire le transport des ions sodium à travers la peau de grenouille. Cependant, ce modèle s’est révélé applicable pour expliquer les propriétés fondamentales de l’absorption des ions sodium dans une grande variété d’épithélia absorbeurs allant de la peau de grenouille jusqu’aux épithélia des cellules de mammifère. Selon ce modèle, le transport s’effectue en deux étapes. Premièrement, l’entrée passive d’ions sodium à travers la face muqueuse suivant son gradient électrochimique puis l’extrusion des ions sodium au niveau de la face séreuse par la pompe Na+/K+-ATPase localisée dans la membrane basolatérale des cellules épithéliales. Selon ce modèle, les membranes apicales et basolatérales diffèrent par leurs perméabilités relatives aux ions. La membrane apicale est essentiellement perméable aux ions sodium tandis que la membrane
basolatérale est perméable aux ions potassium. Le gradient électrochimique nécessaire pour l’absorption des ions sodium est généré et maintenu par la pompe Na+/K+-ATPase qui fonctionne en parallèle avec une voie de « fuite » potassique localisée dans la membrane basolatérale(Fig. 1). Comme tous les vertébrés aquatiques osmorégulateurs les poissons téléostéens maintiennent la concentration en chlorure de sodium dans leurs fluides corporels à approximativement 40% de celle de l’eau de mer. Pour les poissons téléostéens, hyper-osmorégulateur ou hypo-osmorégulateur suivant leurs habitats, la régulation des échanges ioniques, pour le maintien de l’homéostasie cellulaire, s’effectue principalement au niveau de l’appareil branchial. L’appareil branchial des poissons téléostéens est composé d’une dizaine d’arcs branchiaux soutenus par des supports cartilagineux. Chaque arc branchial présente une double rangée de filaments, ou lamelles primaires, qui portent sur leurs deux faces et perpendiculairement à leur grand axe des feuillets aplatis appelés encore lamelles secondaires(Fig. 2). Structuralement, l’appareil branchial peut être considéré comme la combinaison de deux épithélia distincts, l’épithélium primaire et l’épithélium secondaire (Laurent et Dunel, 1978). L’épithélium primaire (ou épithélium filamenteux) couvre les lamelles primaires ainsi que les régions inter lamellaires. Il est en contact direct avec le compartiment vasculaire par l’intermédiaire des artères afférentes et efférentes et du sinus veineux. Il est composé de cinq grands types cellulaires comprenant, les cellules respiratoires (cellules prédominantes de l’épithélium branchial caractérisées par la présence sur leur membrane apicale d’inter digitations), les cellules à mucus, les cellules neuroépithéliales (contenant des amines biogéniques), les cellules accessoires (précurseurs des cellules à chlorure), et les cellules à chlorure. L’épithélium secondaire (épithélium lamellaire), restreint aux lamelles secondaires n’est pas en contact direct avec le système vasculaire. Il est beaucoup plus simple et fin. Il est constitué de deux principaux types cellulaires qui sont les cellules à chlorure et les cellules respiratoires. Les épithélia branchiaux sont considérés comme relativement imperméables aux ions, à l’eau et aux molécules organiques à cause des nombreuses protéines constitutives des jonctions serrées (Sardetet alqui unissent d’une part les cellules respiratoires entre., 1979) elles et d’autre part les cellules respiratoires aux cellules à chlorure. Pour ces raisons, l’épithélium branchial est considéré comme un épithélium « tight ». Il est à noter que pour l’épithélium primaire des téléostéens marins, les cellules à chlorure sont liées aux cellules accessoires par des jonctions serrées où les chapelets protéiques constitutifs sont moins
nombreux. Il est généralement considéré que ces chemins para cellulaires sont d’importantes voies de fuite pour les ions et l’eau (Evans, 1979). Jusqu’à présent très peu de travaux ont été réalisés sur les mécanismes de régulation ionique au sein de l’épithélium branchial des poissons téléostéens. La compréhension des mécanismes de transport ioniques a longtemps été entravée par la complexité morphologique et la fragilité de l’épithélium branchial. Les surfaces filamenteuses, de part leur structure tridimensionnelle complexe, ne peuvent être montées en chambre de Ussing, méthode qui permet une approche électrophysiologique des processus de transport ioniques. En outre, l’imbrication des différents types cellulaires ne permet pas de les dissocier physiquement pour une étude séparée. Le réseau vasculaire ramifié et anastomosé de l’appareil branchial complique la situation, les cellules branchiales baignent par leur membrane basolatérale dans un milieu indéterminé, sous dépendance neuro-hormonale qui ne peut être reproduitin vitro(Laurent et Dunel, 1980). Ces difficultés ont été contournées, dans un premier temps, par des approches expérimentales indirectes puis par des approches plus fines utilisant des techniques cellulaires, moléculaires et électrophysiologiques. De nombreux épithélia transporteurs ont la possibilité d’excréter des protons et cette propriété est souvent liée à la capacité pour l’épithélium d’absorber des ions sodium. En 1939 Krogh (Krogh, 1939) démontre que l’épithélium branchial du poisson rouge (Carassius auratus l’autre. Il) absorbe les ions sodium et chlorure indépendamment l’un de suggère un processus d’absorption pour les ions sodium et chlorure s’effectuant par des mécanismes d’échanges parallèles indépendantsviades transporteurs. Plus tard des études utilisant des radio-isotopes confirment la proposition de Krogh, en démontrant que l’absorption des ions sodium et chlorure peut être stimulée indépendamment par l’injection intraveineuse d’ions NH4+ HCO et3-. De plus, l’injection dans l’aorte ventrale de la truite (Salmo gairdneri) d’un inhibiteur spécifique de l’anhydrase carbonique, l’acétozalamide, inhibe les influx d’ions sodium ainsi que les efflux de protons (Maetz et Garcia Romeu, 1964). Ces résultats conduisent à l’adoption d’un modèle impliquant le fonctionnement simultané de deux échangeurs qui sont l’échangeur Na+/H+et l’échangeur Cl-/HCO3-. De tels mécanismes existent dans certaines cellules isolées telles que les érythrocytes (Weaveret al., 1999) mais également dans les cellules des épithélia lâches comme la vésicule biliaire de lapin (Cremaschiet al., 1979), le petit intestin (Mureret al., 1976), et les tubules proximaux des reins (Kinsella et Aronson, 1980). Cependant, ce mécanisme de transport pour les ions sodium et chlorure n’a été décrit pour aucun épithélium « tight ». De plus, les expérimentations sur l’appareil branchial des ont été menées sur des animaux entiers,in vivo, sur les nombreux facteurs de
ne peuvent être contrôlés. Ainsi, les drogues injectées directement dans l’aorte ventrale peuvent avoir un effet cardiovasculaire, qui en retour, modifient les échanges ioniques transépithéliaux. En outre, les échanges ioniques à travers l’épithélium branchial dépendent du gradient électrochimique de chaque ion mais aussi du potentiel transépithélial, facteurs modifiés par le changement des solutions de perfusion plasmatiques. En 1989, Avella et Bornacin ré-examinent les mécanismes d’absorption pour les ions sodium par une technique moins contraignante, la tête perfusée isolée de truite (Oncorhynchus mykiss) (Avella et Bornacin, 1989). Leurs résultats montrent que les flux d’ions sodium varient en fonction du pH intracellulaire. La perfusion d’acétozalamide sur la face basolatérale diminue l’absorption sodique en produisant une réduction de la concentration intracellulaire en protons. L’ajout dans le milieu extérieur d’amiloride, inhibiteur de l’échangeur Na+/H+et des  Nacanaux sodiques, bloque les influx de+. Ces données sont en accord avec le modèle proposé par Krogh. Cependant lors de ces expérimentations la concentration extracellulaire en ions sodium, maintenue à une valeur très faible de 160 µM, ne permet pas d’expliquer le transfert intracellulaire d’ions Na+ uniquement par l’échangeur sodium-proton : la cellule subirait une alcalinisation intracellulaire incompatible avec sa survie. Suite à leur travail, Avella et Bornancin proposent un système alternatif, similaire au modèle d’absorption pour les ions sodium décrit quelques années plus tôt dans la peau de grenouille. Ainsi, l’absorption des ions sodium mettrait en jeu deux transporteurs membranaires fonctionnant en série : une pompe protogénique et un canal sodique sensible à l’amiloride. Localisée dans la membrane apicale des cellules branchiales la pompe protogénique génèrerait un gradient électrochimique favorable pour l’entrée des ions sodium qui s‘effectuerait via un canal sensible à l’amiloride. Au niveau de la membrane basolatérale le gradient électrochimique nécessaire pour l’extrusion des ions sodium serait généré et maintenu par une pompe Na+/K+-ATPase qui fonctionnerait en parallèle avec une voie de « fuite » potassique. Ce second mécanisme d’un transport actif des ions sodium a été décrit dans de nombreux épithélia « tight » notamment, dans la vessie urinaire de crapaud (Ludens et Fanestil, 1972) et de tortue (Steinmetzet al collecteurs de., 1967) et dans certains segments des tubules rein de mammifère (Stoneret al., 1974). Plus récemment, des données supplémentaires ont été obtenues par l’application de techniques immunohistochimiques. Une fraction de la partie carboxy-terminale de la pompe H+-ATPase des  anticorps dirigéscellules rénales de bovin a été utilisée pour obtenir des contre cette L’em de ces anticor sur des sections de l’é branchial de
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