MINISTERE DE LA JEUNESSE DE L'EDUCATION NATONALE ET DE LA RECHERCHE

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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Agnès DUMONT Le 4 novembre 2004 Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes CARACTERISATION DES PARAMETRES D'EFFICACITE ET DE TOLERANCE DE L'OXALIPLATINE Président de jury : Ali Bettaïeb Examinateurs : Jean-Pierre Benoit, Directeur EPHE Erick Gamelin, Maître de stage Pascale Lainé, Examinateur Alain Morel, Examinateur Laboratoire EPHE « Ingénierie de la vectorisation particulaire » INSERM ERIT-M 0104 Bâtiment IBT - 10 rue A. Bocquel 49100 ANGERS Directeur EPHE: Pr. Jean-Pierre BENOIT Laboratoire d'accueil: « Adaptation cellulaire au cours du développement tumoral » INSERM U564 CRLCC Paul Papin- 2 rue Moll 49033 ANGERS Directeur scientifique: Pr. Erick GAMELIN RESUME EPHE Banque de Monographies SVT 1

  • traitement

  • formation d'adduits de platine sur l'adn créant des lésions

  • population de patients traités par oxaliplatine

  • mutations des gènes de l'alanine glyoxylate

  • seconde molécule d'intérêt dans le traitement des cancers colorectaux

  • qualité de vie des patients

  • réparation de l'adn

  • oxaliplatine


Publié le : lundi 1 novembre 2004
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATONALE ET DE LA RECHERCHE    ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES  Sciences de la Vie et de la Terre  MEMOIRE  Présenté par  Agnès DUMONT  Le 4 novembre 2004   Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes   CARACTERISATION DES PARAMETRES D’EFFICACITE ET DE TOLERANCE DE LOXALIPLATINE    Président de jury : Ali Bettaïeb Examinateurs : Jean-Pierre Benoit, Directeur EPHE  Erick Gamelin, Maît e de stage r  Pascale Lainé, Examinateur  Alain Morel, Examinateur   
 Laboratoire EPHE « Ingénierie de la vectorisation particulaire » INSERM ERIT-M 0104 Bâtiment IBT - 10 rue A. Bocquel 49100 ANGERS Directeur EPHE: Pr. Jean-Pierre BENOIT jean-pierre.benoit@univ-angers.fr   Laboratoire d’accueil: « Adaptation cellulaire au cours du développement tumoral » INSERM U564 CRLCC Paul Papin- 2 rue Moll 49033 ANGERS Directeur scientifique: Pr. Erick GAMELINediea..gfarmelin@unim                                                          RESUME  
  L’oxaliplatine, dérivé de platine de troisième génération fait partie des trois molécules les plus utilisées dans le traitement des cancers colorectaux. Afin d’évoluer vers un traitement individualisé de ce médicament, nous avons développé deux approches : la prédiction de neurotoxicités et la caractérisation des mécanismes de résistance de la tumeur.   La toxicité limitante de l’oxaliplatine est neurologique et se présente sous deux formes cliniques. Une forme précoce et sévère et une forme chronique plus tardive. La neurotoxicité aiguë est spécifique à l’oxaliplatine et se traduit par des paresthésies aux extrémités des membres et des crampes. L’apparition de ces neuropathies porte donc atteinte à la qualité de vie des patients. La composante aiguë semblerait provenir d’une chélation du calcium intraneuronal par l’oxalate libéré lors du métabolisme de l’oxaliplatine ayant de ce fait une interaction avec les canaux sodiques sensibles au calcium. Certains troubles du métabolisme du glyoxylate induisent une surexpression en oxalate. Il s’agit de maladies génétiques rares appelées hyperoxaluries primaires. Nous avons donc recherché les mutations des gènes de l’alanine glyoxylate aminotransférase (AGT) et de la glyoxylate réductase /hydroxypyruvate réductase (GRHPR) dans une population de patients traités par oxaliplatine. Ceci a nécessité le développement d’une technique de mini-séquençage en temps réel ou pyroséquençage. Nous avons pu montrer de façon significative que l’apparition de neurotoxicités graves est corrélée avec la présence d’un polymorphisme situé sur le gène de l’AGT.   L’échappement des tumeurs à la chimiothérapie pose un réel problème quant à la survie des patients. Les mécanismes impliqués dans la résistance à l’oxaliplatine sont peu connus. Nous avons tenté d’évaluer l’implication des gènes de détoxication (GSTpi,ABCC2) et de réparation de l’ADN (XPA,ERCC1) en réponse à une stimulation à l’oxaliplatine. Nous avons pu montrer une surexpression de XPA dans une lignée cellulaire colique. L’expression de la GSTpi est régulée par le taux de méthylation de son promoteur. L’oxaliplatine ne semble pas perturber l’état de méthylation de ce gène. Toutes ces données restent à confirmer.            de risque àCe travail a permis de mettre en place une méthode fiable de dépistage des patients   toxicité neurologique avant traitement par oxaliplatine. Nous avons également mis en place des techniques de caractérisation des gènes impliqués dans la résistance à l’oxaliplatine qui sont adaptables à l’étude de cellules résistantes à ce médicament.    MOTS-CLES  Oxaliplatine – Neurotoxicité – Oxalate – Pharmacogénétique – Polymorphisme – Résistance     Liste des abréviations..................................................................................................................... 5
TABLE DES MATIERES
INTRODUCTION......................................................................................................................... 6 I-      Présentation des sels de platine.......................................................................................... 11 1.   Généralités.................................................................................................................. 11 2.   Mécanisme d’action...................................................................................................... 12 3.   Etudes précliniques de l’oxaliplatine................................................................................ 13 II-    Oxaliplatine~Résistance...................................................................................................... 14 1.   Résistance au cisplatine................................................................................................. 14 a.   Détoxication................................................................................................ 14 b.   Réparation de l’ADN..................................................................................... 15
c.    Autres mécanismes........................................................................................ 16 2.   Résistance à l’oxaliplatine............................................................................................. 16 a.   Détoxication................................................................................................ 17 b.   Réparation des adduits.................................................................................. 17 c.    Apoptose..................................................................................................... 18 III-   Oxaliplatine~Données cliniques et efficacité...................................................................... 19 1.   Indications cliniques..................................................................................................... 19 a.   Activité en monothérapie................................................................................ 19 b.   Etudes en association.................................................................................... 19 2.   Données pharmacologiques............................................................................................ 20 3.   Tolérance.................................................................................................................... 22 IV-   Oxaliplatine~Neurotoxicité................................................................................................. 24 1.   Symptômes dus à l’oxaliplatine...................................................................................... 24 2.   Physiopathogénie......................................................................................................... 26 3.   Approche thérapeutique................................................................................................. 26 a.   Prévention de la neuropathie aiguë.................................................................. 27 b.   Prévention de la neuropathie chronique............................................................ 28 4.   Implication de l’oxalate................................................................................................. 29 V-     Toxicité à l’Oxalate.............................................................................................................. 31 1.   Intoxication à l’éthylène glycol....................................................................................... 32 2.   Hyperoxaluries............................................................................................................ 33 a.   Hyperoxaluries primaires : Types I et II............................................................ 33 b.   Hyperoxaluries secondaires............................................................................ 38 VI-   Objectif de ce travail............................................................................................................ 39
BIBLIOGRAPHIE....................................................................................................................... 41   
LISTE DES IVÉRBASNOITA  
A :Adénine  ABCC2: Transporteur de type ATP binding cassette ouMRP2(Multidrug Resistance Protein 2) ou cMOAT(Canicular multispecific organic anion transproter)  ADN:Acide désoxyribonucléique  ADNc: ADN complémentaire  ADNg: ADN génomique  AGT: Alanine glyoxylate aminotransférase  AMP: Adénosine monophosphate  ARN :Acide ribonucléique  ARNm: Acide ribonucléique messager  ATP:Adénosine triphosphate
 C: Cytosine  dNTP: Désoxynucléotide triphosphate  dNDP: Désoxynucléotide diphosphate  DTT :Dithiothréitol  DUM neurones:Dorsal Umpair Median neurones  Dysesthésieprovoquée par un contact ou le froid par: Sensation anormale et désagréable, spontanée ou exemple. La perception des objets est déformée.  ERCC-1:Excision Repair Cross Complementation group 1   G: Guanine  G3PDH: Glucose-3-phosphate déshydrogénase  GRHPR: Glyoxylate réductase ; hydroxypyruvate réductase  GSTpi: Glutathion S transférase classe pi  IC 50 :permettant d’inhiber 50% de la croissance cellulaireConcentration  IPTG: Isopropyl-β-D-thiogalacypotonaredis   Kp, pb: Kilo ou paire de bases  LNA: Locked nucleic acid  NER: Nucleotide excision repair ; système de réparation et d’excision des nucléotides  MMLV: Moloney Murine Leukemia Virus  Paresthésiede la sensibilité désagréable mais non douloureux, donnant l’impression de palper du: Trouble coton et pouvant s’accompagner d’une anesthésie. Le terme généralement employé est fourmillement.  PCR: Réaction de polymérisation en chaîne  PEG: Polyéthylène glycol  PM: Poids moléculaire  PPi: Pyrophosphate inorganique  Rnasin: Inhibiteur de ribonucléase recombinant  T: Thymidine  T ½: Temps de demi-vie  Tm: Température d’hybridation (melting temperature)  UV: Ultraviolet  XPA:Xeroderma Pigmentosum protein A  X-Gal: 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-βrapysinoal-gtoacD-ed
    Chaque année, environ 1 million de nouveaux cas de cancer colorectal sont diagnostiqués dans le monde, dont environ 150000 aux Etats-Unis et 36000 en France. Ceci pose donc un véritable problème de santé publique dans les pays occidentaux.  On distingue plusieurs types de cancers colorectaux. Dans plus de 80% des cas, il s’agit d’un adénocarcinome provenant d’une complication d’une tumeur bénigne adénomateuse préexistante, mais il existe aussi des formes héréditaires : polypose adénomateuse familiale et cancer colorectal héréditaire sans polypose dérivant d’agrégations familiales d’adénomes coliques (Narayan et Roy, 2003). Depuis plus de 15 ans, le nombre de décès attribués à ces tumeurs a diminué. Deux facteurs contribuent à cette baisse : un dépistage plus précoce et une évolution dans les traitements administrés. En effet, un dépistage précoce permet une chirurgie curative et une survie à 5 ans de l’ordre de 90%. En revanche, plus de la moitié des cancers colorectaux décelés ont d’emblée ou présenteront par la suite des métastases, ce qui implique un traitement par chimiothérapie et une baisse drastique du taux de survie à 5 ans vers 9% (site internet American Cancer Society)anticancéreux jouent alors un rôle capital pour ces patients.. Les traitements  Avant les années 1990, la principale molécule active contre les cancers colorectaux métastasés était le 5-Fluorouracile (5-FU). Il est toujours la molécule de référence et entre dans la quasi totalité des protocoles de chimiothérapies. En monothérapie, le taux de réponse à un an atteint seulement 10 à 15% avec une faible survie des patients (Grivicich et al.,2001;Shields et al.,2004). De plus, le 5-FU présente des effets toxiques importants (digestifs et hématologiques) qui peuvent être limitants chez certains patients. Il était donc important de trouver de nouvelles molécules. Deux nouvelles molécules ont alors fait leur apparition : l’irinotécan et l’oxaliplatine.  L’irinotécan (CPT-11, Camptosar®) est un dérivé de la camptothécine identifié dans les années 1980. Son activité comme inhibiteur de la topoisomérase I semble particulièrement intéressante car elle diffère de celle du 5-FU. Dans un premier temps, son activité a été démontrée en seconde ligne thérapeutique contre des tumeurs réfractaires au 5-FU. D’autres études ont également révélé son intérêt dans un traitement combiné CPT-11 plus 5-FU. Les toxicités dues à l’irinotécan sont cependant assez invalidantes pour les patients, il s’agit de diarrhées profuses et de neutropénies (Tebbutt al., et2002; Coutinho et al.,2003; Bleiberg,1999).  La seconde molécule d’intérêt dans le traitement des cancers colorectaux est l’oxaliplatine (LOHP, Eloxatine®). L’oxaliplatine est un dérivé de platine de troisième génération, synthétisé dans les années 1970. C’est la première molécule à base de platine ayant une activité clinique contre les cancers colorectaux. Son mode d’action repose sur la formation d’adduits de platine sur l’ADN créant des lésions et induisant la cellule en apoptose (Grivicichet al.,2001). Des études en seconde ligne lui confèrent une activité propre en monothérapie contre les tumeurs réfractaires au 5-FU. Mais son principal intérêt réside dans la synergie existant entre cette molécule et le 5-FU. Cette combinaison présente une efficacité particulièrement intéressante qui la place au rang des associations les plus actives dans cette pathologie, mais là encore au prix d’une toxicité importante (Extraet al., ; Wiseman 1998 et al., 1999 ; De Gramontet al.,2000 ; Raymondet al., 2001).   En France, l’oxaliplatine a obtenu l’autorisation de mise sur le marché (A.M.M.) en 1996 dans l’indication des cancers colorectaux métastatiques résistants au 5-FU. Deux ans plus tard, la combinaison LOHP/5-FU /Acide folinique est acceptée en première ligne thérapeutique. Aux Etats-Unis, le traitement en seconde ligne date de 2003, et l’approbation de première ligne vient d’être autorisée (Janvier 2004). En
seulement 8 ans, ce médicament est placé au rang des traitements de référence dans les cancers colorectaux. Cependant, il reste un médicament assez nouveau et ses paramètres d’efficacité et de tolérance ne sont pas tous établis. L’oxaliplatine a un profil d’activité différent de ses prédécesseurs (cisplatine et carboplatine), d’une part par son activité antitumorale puisqu’il est actif dans les modèles résistants au cisplatine et d’autre part pour sa relative bonne tolérance clinique avec absence de toxicités rénale et auditive ainsi qu’une faible hématotoxicité (Misset al., et1996). En revanche des atteintes neurologiques souvent invalidantes représentent sa toxicité limitante.  Avec 36 000 nouveaux cas de cancers colorectaux par an, dont environ 50% seront traités par de l’oxaliplatine, il est important de pouvoir prescrire une chimiothérapie adaptée au métabolisme de chacun en limitant les effets indésirables pour le confort des patients tout en conservant une efficacité optimale.             La première partie de ce travail cible la composante aiguë de la neurotoxicité de l’oxaliplatine. Dans une étude réalisée chez 1200 patients traités par LOHP (Bugat, 2001), tous ont présenté des toxicités neurologiques et pour 18% d’entre eux, elles ont atteint le grade 3 (soit une gêne fonctionnelle invalidante sur au moins deux cycles). Cette toxicité neurologique peut être de survenue aiguë ou chronique. La toxicité chronique est caractérisée par une atteinte persistante entre les cures d’oxaliplatine avec des dysesthésies prolongées, puis une gêne fonctionnelle avec difficulté pour se boutonner et pour écrire.  La toxicité neurologique aiguë survient en cours ou juste au décours de la perfusion. Elle est donc précoce, transitoire et se traduit par des paresthésies ou dysesthésies au niveau des mains et des pieds, exacerbées au contact du froid. Cette forme de neurotoxicité intervient chez la majorité des patients traités par LOHP et est dose-dépendante. Il a été montré dans notre laboratoire, que ces réactions sont vraisemblablement dues à une inhibition des canaux sodiques calciums dépendants (Grolleauet al., 2001). Cette inhibition semble liée à une chélation du calcium par l’oxalate libéré lors du métabolisme de l’oxaliplatine.hypothèse pourrait être une explication moléculaire à la survenue des neurotoxicitésCette aiguës (Gamelinet al., 2004,in press).  Toutes ces données convergent vers le fait que l’oxalate présente un rôle majeur dans la neurotoxicité aiguë. L’oxalate est le premier métabolite formé lors de la biotransformation de l’oxaliplatine. Il est aussi lié à la neurotoxicité observée dans des cas d’intoxication à l’éthylène glycol dont le métabolisme abouti à la formation d’oxalate ou dans certains troubles du métabolisme du glyoxylate appelés hyperoxaluries. Ces déficits enzymatiques ont été corrélés à la présence de mutations au niveau des gènes codant ces enzymes. Nous faisons l’hypothèse que les patients porteurs d’un déficit partiel en une de ces enzymes pourraient être à haut risque de neurotoxicité lors d’un traitement à l’oxaliplatine du fait d’une impossibilité à faire face à une production aiguë et répétée d’oxalate. Le but de notre travail est de dépister, avant tout traitement par oxaliplatine, les patients risquant une neuropathie au cours de ce traitement en recherchant ces mutations.             Le second objectif porte sur certains mécanismes de résistance à l’oxaliplatine. Le développement d’une résistance aux médicaments anticancéreux par les tumeurs pose un problème considérable car elles échappent au traitement, ce qui nécessite un changement thérapeutique.  De nombreux mécanismes de résistance au cisplatine ont été décrits ces 15 dernières années, essentiellement à partir de lignées établiesin vitroprésentant des niveaux variables de résistance. Des études ont pu ainsi montrer une baisse de l’accumulation intracellulaire de CDDP, une augmentation de l’expression de métallothionines, une augmentation de la synthèse de glutathion et une augmentation de la réparation d’ADN. Il a été montré que l’oxaliplatine est actif dans des lignées tumorales résistantes au cisplatine (Rixe al., et ; 1996 Faivre et al.,2003), les mécanismes de résistance développés sont donc différents. Les voies de résistances à l’oxaliplatine sont moins connues. Néanmoins, il ressort qu’une élévation du taux intracellulaire de glutathion s’accompagne d’une baisse de l’accumulation d’oxaliplatine
(Gourdieret al.,2002). Récemment, deux études tendent à montrer une implication du système de réparation et d’excision de nucléotides (NER) avec une surexpression des deux enzymes clés de cette machinerie, ERCC1 et XPA (Arnould et al., avons décidé nous2003). Compte tenu de ces travaux préliminaires, d’orienter nos travaux vers certains mécanismes de résistance, comme la mise en jeu du système de conjugaison au glutathion incluant les Glutathion-S-Transférases (GST) et l’efflux du produit conjugué par le transporteur ABCC2 (ATP binding cassette).             GSTpi est régulée par le degré de méthylation de son promoteur, ainsiL’expression de l’ARNm de la la caractérisation de l’état de méthylation de l’ADN génomique pourrait être le reflet de l’activité de la GSTpi.  L’oxaliplatine est un agent alkylant, qui interagit avec l’ADN pour former des lésions primaires ou adduits bloquant la réplication de l’ADN et la transcription.On peut donc penser que certaines lignées tumorales résistent en surexprimant les systèmes de réparation de l’ADN. Nous avons choisi d’appréhender également la machinerie des réparations des adduits d’ADN par une approche cellulaire et moléculaire.    L’objectif de notre travail est une recherche des paramètres de tolérance et d’efficacité de l’oxaliplatine. Une meilleure connaissance de ces éléments permettrait l’optimisation du traitement par oxaliplatine : en adaptant la dose en fonction du métabolisme de chaque patient et en tenant compte des caractéristiques de la tumeur afin d’améliorer la tolérance tout en respectant le pouvoir cytotoxique de la molécule.  
I-             PENTARÉSNOIT DES SELS DE NETILAP  1.  GÉNÉRALITÉS           Le premier complexe à base de platine ayant été utilisé dans le traitement des cancers est le cisplatine oucis fût le chloride-dichlorodiammineplatiniumII. Sa première synthèse date de 1844 et son premier nom de Peyrone. De façon fortuite, Rosenberg observa l’inhibition de la division cellulaire au contact d’une électrode de platine lors d’une étude surEscherichia Colice qui lui suggérait que des composés à base de, platine pourraient avoir une activité antinéoplasique. Son équipe démontra que l’effet biologique était dû au cisplatine, et fut la première à apporter la preuve de son activité anticancéreuse chez l’animal (Rosenberget al.1970 qu’il pu être administré à l’homme sans danger., 1965). Mais ce n’est que dans les années  Un peu plus de 3000 composés à base de platine ont été synthétisés depuis la découverte du    cisplatine. Toutes ces molécules ont été expérimentées contre des cellules cancéreuses, cependant, seules 30 ont atteint la phase des essais cliniques et la moitié a d’ores et déjà été rejetée (Desoize et Madoulet, 2002) Quelques complexes de platine sont toujours en essai clinique, dont certains sont développés pour une administration orale. l’heure actuelle, trois dérivés du platine sont couramment utilisés en chimiothérapies : le cisplatine  A (première génération) depuis 1978, le carboplatine (deuxième génération) et l’oxaliplatine (troisième génération).              efficaceDans un premier temps,  moléculela recherche de nouveaux platines était orientée vers une et peu toxique, actuellement elle est motivée par l’obtention de sels de platine dépourvus de résistance croisée avec le cisplatine et le carboplatine.   
 La synthèse de l’oxaliplatine s’est faite dans l’optique de pallier aux problèmes de résistances et de toxicités induites par le cisplatine. Dans un premier temps, la substitution des deux radicaux aminés du cisplatine par un groupement diaminocyclohexane (DACH) permet d’obtenir un composé de meilleure activité anti-tumorale et à la perte d’une résistance croisée. Cependant, son application en développement clinique est limitée par une pauvre solubilité dans l’eau. Cet obstacle a été franchi en remplaçant les deux ions chlores par le groupement oxalate, formant ainsi l’oxaliplatine (Grahamet al.,2004). Les étudesin vitro sur culture de lignées cellulaires ont permis d'établir une activité cytotoxique supérieure à celle du cisplatine malgré des lésions à l'ADN moins marquées (Rixeet al.,1996 ; Woynarowskiet al.,1998).Son efficacité a également été démontrée sur des lignées cellulaires résistantes au cisplatine et au carboplatine (Dunnet al., 1997 ; Fukudaet al.,1995 ; Riccardiet al.,1997).  Il se distingue nettement des autres platines par une cinétique de réaction rapide : formation de ponts inter et intra brins G-G ou G-A sur l’ADN tumoral et un spectre d’activité anti-tumorale différent. L’Eloxatine® en clinique est accru par une absence de résistance croisée au cisplatine. Son intérêt présente une synergie d’action avec le 5-FU, démontréein vitrosur 3 lignées coliques humaines et confirméein vivo sur une sourisnudeporteuse de xénogreffe de tumeur colique HT29.               2.  MÉCANISME DACTION   Le mécanisme cytotoxique précis des sels de platine n’est pas encore complètement défini. Le cisplatine est considéré comme un agent alkylant. Il est capable de se lier avec toutes les bases de l’ADN, mais cette liaison est préférentielle avec la position N7 de la guanine et de l’adénine. Il peut se former des adduits inter ou intrabrin sur l’ADN, soit entre deux guanines adjacentes soit entre une guanine et une adénine.  Le nom chimique de l’oxaliplatine est Trans-l-diaminocyclohexane oxaliplatinium ouCis [oxalato (trans-l-1,2-cyclohexane diamine) platinium (II)]. De masse moléculaire relative 397,33 g/mol, la molécule d’oxaliplatine est formée d’un noyau platine, d’un ligand transporteur DACH et d’un ligand hydrolysable : l’acide oxalique (Formule moléculaire : C8H14N2O4Pt).   L'oxaliplatine est activé par la perte du groupement oxalate qui est remplacé par 2 ions chlore. Il est ainsi transformé en DACH-dichloro-platine, son métabolite actif (Pendyala et al.,1995b). Sa biotransformation conduit ensuite à la formation d’un composé aqueux 1,2-DACH-platine via plusieurs composés instables. L’oxalate et les ions chlores ont été substitués par des molécules d’eau après réaction avec des nucléophiles comme le bicarbonate ou le phosphate dihydrogène (Finket al., 1996 ; Grivicichet al., 2001). Ces formes cationiques aqueuses réagissent à leur tour pour former des adduits sur les acides nucléiques et les protéines. Plusieurs isomères du DACH-platine de cytotoxicité variable existent (Brabec et Kasparkova, 2002).  Les adduits formés par l’oxaliplatine sont préférentiellement intrabrins entre deux guanines   adjacentes (GG>AG). En concentration équimolaire, l’oxaliplatine forme moins d’adduits que le cisplatine (Woynarowskiet al., 1998 ; Hectoret al., 2001). Cependant, le potentiel cytotoxique de l’oxaliplatine est plus fort que celui du cisplatine dans de nombreuses cellules tumorales (Rixeet al., 1996). Sur plusieurs lignées tumorales l’oxaliplatine induit une réponse apoptotique plus forte que le cisplatine (Eriguchi al., et 2003 ; Faivreet al., 2003). Le groupement DACH fait saillie à l’extérieur du sillon majeur de l’ADN et empêche une complète reconnaissance des mécanismes de réparation des mésappariements de l’ADN contrairement au cisplatine (Finket al., 1996 ; Scheeffet al.,1999).
   En résumé, l’oxaliplatine est agent alkylant qui forme des ponts intra et interbrins avec l’ADN cellulaire. Les adduits formés par l’oxaliplatine sont moins nombreux que pour le cisplatine mais dans la plupart des lignées cellulaires leur potentiel cytotoxique est supérieur. Ces adduits induisent une plus grande inhibition de la synthèse d’ADN par blocage de la fourche de réplication (Scheeffet al., 1999).   3.  ETUDES PRÉCLINIQUES DE LOXALIPLATINE              L’activité de l’oxaliplatine sur de nombreuses lignées a été étudiéein vitro, permettant de définir son spectre d’activité. Ce crible a été réalisé par le National Cancer Institute (NCI), afin d’identifier des familles de composés sur la base de leur mécanisme d’action et de leur activité (Rixeet al., 1996). Cinquante lignées cellulaires ont fait l’objet de cette étude. Les IC 50 (concentration permettant d’inhiber 50% de la croissance cellulaire) de toutes ces cellules ont été déterminées.  D’après ce modèle, l’oxaliplatine s’individualise des autres composés de platine (cisplatine et carboplatine), ce qui en fait un agent efficace dans les tumeurs présentant une résistance primaire ou acquise à ces deux autres composés. Selon la méthode comparative de cette même étude, les 20 composés les plus proches de l’oxaliplatine de par leur activité sont des agents alkylants ou d’autres DACH-platine, mais ni le cisplatine, ni le carboplatine n’apparaissent dans cette liste. Ceci confirme le spectre d’action tout à fait particulier de l’oxaliplatine.  L’oxaliplatine a démontré une activité cytotoxique sur de nombreuses lignées tumorales humaines dont des lignées de cancers colique, ovarien, du sein, vésical, de mélanome malin, de gliome et de leucémie. De façon intéressante, son activité est maintenue dans des lignées de cancers bronchique, ovarien et du col utérin résistantes au cisplatine (Raymondet al., 2001). Ces résultatsin vitro ont été confirmés dans plusieurs modèles murins avec des tumeurs hématologique, colique ou mammaire (Raymondet al., 2001).    II-           OITALPILAXNE~RENCTAISÉS   La résistance aux anticancéreux peut se présenter sous deux formes, une forme présente d’emblée (intrinsèque à la tumeur) ou une forme acquise. Les mécanismes impliqués dans ces deux types de résistances sont souvent identiques. De nombreux mécanismes de résistance au cisplatine (CDDP) ont été décrits ces 10 dernières années, essentiellement à partir de lignées cellulaires établiesin vitroprésentant des niveaux variables de résistance. Parallèlement, des lignées résistantes à d’autres sels de platine (carboplatine, tétraplatine et oxaliplatine) ont été isolées et des constatations souvent proches ont été portées, retrouvant des mécanismes communs de résistance.  1.  RÉSISTANCE AU CISPLATINE   La résistance au cisplatine est la mieux étudiée et référencée des dérivés de platine. Plusieurs mécanismes ont été décrits suggérant une résistance multifactorielle à différents niveaux. Quatre modifications majeures sont répertoriées dans la résistance au cisplatine : 1/ Diminution de l’accumulation intracellulaire de CDDP, 2/ Augmentation de l’expression de métallothionines, 3/ Augmentation de la synthèse de glutathion et 4/ Augmentation de la réparation de l’ADN.
 a.     Détoxication  Diminution de l’accumulation intracellulaire de CDDP  On a longtemps supposé que la pénétration intracellulaire du cisplatine se faisait par voie passive. Récemment, une étude a mis en évidence quelques transporteurs comme Ctr1, ATP7A et ATP7B qui pourraient assurer l’influx et l’efflux du cisplatine (Kruh, 2003 ; Samimiet al., 2003).In vitro, la diminution intracellulaire du CDDP a été montrée dans nombreuses lignées résistantes animales ou humaines (CHO, L1210, ovariennes, carcinomes coliques), mais les mécanismes moléculaires qui en sont à l’origine ne sont pas tous bien établis. Il peut s’agir d’une augmentation de l’efflux du médicament, une expression altérée des systèmes de transporteurs des métaux ou encore une inactivation du noyau de platine à l’intérieur de la cellule.  Augmentation de l’expression des métallothionines  Les métallothionines sont des protéines intracytoplasmiques de bas poids moléculaires, riches en résidus thiols, capables de chélater de nombreux métaux lourds. Dans des lignées résistantes au cisplatine, il existe une nette surexpression de ces protéines (Kelleyet al., De plus l’établissement de lignées 1988). cellulaires « révertantes » (cellules qui retrouvent les niveaux de sensibilité au CDDP des lignées parentales), montre une diminution de l’expression des métallothionines. Ainsi, la chélation du CDDP par les métallothionines permet de détourner ce cytotoxique de sa cible cellulaire en le stockant, induisant ainsi, l’établissement d’une résistance.  Augmentation de la synthèse de glutathion  De la même façon, le glutathion (GSH) est un pepetide intracytoplasmique contenant des groupements thiols. Il est le médiateur de la détoxication cellulaire en protégeant la cellule contre les composés toxiques endogènes ou exogènes (Mclellan et Wolf, 1999).  Pendyala et ses collaborateurs montrent une corrélation entre les niveaux de GSH et les IC50 des dérivés de platine (Pendyalaet al., 1995a). De plus, des études sur une lignée de cancer ovarien rendue résistante au CDDP ont mis en évidence non seulement une augmentation des taux cellulaires de GSH mais aussi une surexpression des ARNm de laγ-glutamylcystéine synthétase et de laγ-glutamyl transpeptidase, régulant toutes deux le taux de glutathion (Godwinet al., 1992).  La glutathion-S-transférase pi (GSTπ établie) permet de détoxifier le CDDP. Une corrélation a été entre l’augmentation de l’expression de la GSTπet l’augmentation de la formation du conjugué platine-GSH (Gotoet al.,1999). Ces mêmes auteurs ont mis en évidence plus récemment, une accumulation nucléaire de GSTπen réponse au CDDP dans des lignées coliques humaines, ainsi qu’une augmentation de la sensibilité de ces cellules en présence d’un inhibiteur de GSTπ(Gotoet al., 2002).  L’efflux du CDDP passe également par des transporteurs membranaires de type ABC (ATP binding cassette ou MRP), plus particulièrement ABCC2 (MRP2 ou cMOAT) (Taniguchiet al.,1996). L’analyse des tumeurs colorectales de 45 patients associe ABCC2 à une résistance au cisplatine, en observant une augmentation significative de l’expression des ARNm dans les régions cancéreuses par rapport au tissu sain (Hinoshitaet al., 2000).  b.     Réparation de l’ADN   L’une des cibles principales des sels de platine étant l’ADN de nombreuses études ont mis en évidence que la capacité accrue de réparer ces liaisons Pt-G/G ou Pt-G/A était impliquée dans la résistance
au CDDP.  Le mécanisme de réparation et d’excision des nucléotides (Nucleotide excision repair, NER) est très conservé. Les deux protéines les plus importantes de ce complexe sont XPA (Xeroderma Pigmentosum protein A) et ERCC1 (Excision Repair Cross Complementation group 1) intervenant respectivement dans la reconnaissance et l’excision des lésions d’ADN (Araujo et Wood, 1999). Une augmentation de l’expression des ARNm des gènesERCC1 etXPA a été observée dans de nombreuses lignées cellulaires et tumeurs résistantes au CDDP localisées dans les ovaires, les poumons et le colon (Yu etal., 1998 ; Rosellet al., 2002). Une corrélation directe a été établie entre une augmentation des taux d’ARNm de XPA et ERCC1 et une augmentation de la capacité de réparation des adduits CDDP/ADN dans la cellule (Dabholkar al. et, 1994 ; States et Reed, 1996). La transfection du gène codant pour ERCC1 dans des cellules ovariennes de hamster augmente de 4 à 5 fois la résistance au CDDP (Leeet al., 1993). D’ailleurs plusieurs équipes s’accordent sur le fait que le taux d’expression intratumoral de l’ARNm de ERCC1 est un facteur prédictif de résistance à une chimiothérapie à base de platine (Dabholkaret al., 1994 ; Shirotaet al., 2001).  Un autre mécanisme de réparation est impliqué dans la résistance au CDDP, il s’agit du système de réparation des mésappariements (MMR ouMismatch Repair) (Niedneret al. de, 2001). Sa fonction est supprimer les mésappariements provenant d’une erreur d’incorporation des nucléotides lors de la synthèse d’ADN. La reconnaissance d’une lésion CDDP/ADN par le MMR induit la plupart du temps une apoptose de la cellule. Donc la perte de ce mécanisme augmente la capacité d’une cellule à tolérer les lésions formées par le cisplatine (Brabec et Kasparkova, 2002). Mais les résultats sont contradictoires puisque la même année, une autre équipe avance le fait que des cellules de carcinome colique résistent à de hautes doses de CDDP sans pour autant être déficientes en MMR (Sergentet al., 2002).  c.Autres mécanismes   Il a été démontré que l’oncogène nucléairec-fosétait augmenté dans les lignées résistantes au CDDP. Des altérations de la p53 ont été également décrites dans certaines lignées résistantes (Brownet al., 2003). Une forte activité de la télomérase et une élongation des télomères semblent également impliquées dans la résistance au CDDP dans les cellules de cancer colorectal. Par ailleurs une forte expression des gènes ABCB1(ouMDR-1) etABCCa été observé dans ces cellules (Kuranagaet al., 2001).                                              2.  RÉSISTANCE À LOXALIPLATINE   Les mécanismes de résistance à l’oxaliplatine sont beaucoup moins référencés que ceux du CDDP. Néanmoins, les premières études ont soupçonné des mécanismes similaires étant donné que ces deux médicaments forment des adduits sur l’ADN. On sait que l’oxaliplatine est actif dans les tumeurs résistantes au CDDP, donc tous les mécanismes de résistance ne peuvent pas être les mêmes. a.     Détoxication   Comme pour le cisplatine, on observe une baisse de l’accumulation d’oxaliplatine dans les cellules résistantes (Hectoret al. à, 2001). La majorité de l’oxaliplatine entrant dans les cellules ne se liera jamais l’ADN (Mishimaet al., composés 2002). La voie du glutathion est principale dans la détoxication de endogènes ou exogènes au sein de la cellule. Les études sur les cellules résistantes à l’oxaliplatine se sont portées sur cette voie. Des carcinomes ovariens (A2780) ont été adaptés à l’oxaliplatine à différentes concentrations. Des mesures par HPLC (Chromatographie liquide haute performance) ont montré un taux de GSH trois fois supérieur dans ces cellules par rapport aux parentales. Cette élévation s’accompagne
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