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  • cours - matière potentielle : l' adipogenèse chez les cellules
  • cours - matière potentielle : du processus de différentiation adipocytaire
  • cours - matière potentielle : du développement fœtal
Implication du canal sodique épithélial dans la formation d'œdèmes rénaux causés par les thiazolidinediones : régulation et mécanismes d'action. Stéphane Renauld, Ahmed Chraïbi. Les thiazolidinediones (TZD) sont des agonistes des récepteurs nucléaires PPARγ utilisés pour augmenter la sensibilité à l'insuline chez les patients diabétiques de type 2. Cependant, certains patients traités aux TZD développent une hypertension marquée accompagnée d'œdèmes. Une augmentation de transcription des gènes codants pour ENaC induite par les PPARγ a été montrée.
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Publié le : lundi 26 mars 2012
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Implication du canal sodique épithélial dans la formation d’œdèmes rénaux causés par les thiazolidinediones : régulation et mécanismes d’action. Stéphane Renauld, Ahmed Chraïbi. Les thiazolidinediones (TZD) sont des agonistes des récepteurs nucléaires PPARγpour utilisés augmenter la sensibilité à l'insuline chez les patients diabétiques de type 2. Cependant, certains patients traités aux TZD développent une hypertension marquée accompagnée d'œdèmes. Une augmentation de transcription des gènes codants pour ENaC induite par les PPARγ aété montrée. Cependant, aucune étude fonctionnelle de la régulation de l'activité de ENaC par les PPARγn'a été réalisée. L'objectif de notre étude est de déterminer si la stimulation des PPARγest suivie d'une augmentation de l'activité de ENaC et de préciser les mécanismes sous-jacents. Pour ce faire, les courants sodiques ont été mesurés dans des ovocytes de grenouille exprimant le canal ENaC et au niveau d’une lignée cellulaire de tubule collecteur de rein de souris, les mpkCCDc14. Des expériences de RT-PCR et de Western Blot ont été également employées. Nos résultats montrent qu’un traitement de 48h aux TZDs double l’activité de ENaC au niveau de l’ovocyte. Cet effet est totalement aboli par l’incubation préalable au GW9662, un antagoniste des PPARγ. Une mutation au niveau du site d’interaction de la protéine SGK1 avec ENaC diminue l’effet stimulateur des PPARγet les canaux Liddle (canaux ENaC présentant une mutation au niveau C-terminal empêchant leur dégradation) ne sont pas sensibles aux TZDs. Ces résultats suggèrentque les PPARγstimulent l’activité de ENaCvia l’expressionde SGK1 et l’inhibition d’une ubiquitine ligase, la protéine Nedd4. Caractérisation de deux nouveaux ligands non-peptidiques et sélectifs pour le récepteur AT2de l’angiotensine II.Marie-Odile Guimond, Charlotta Wallinder, Anders Hallberg, Nicole Gallo-Payet. Le récepteur AT2 del’angiotensine II est fortement exprimé au cours du développement fœtal et son expression diminue rapidement après la naissance. Des études récentes suggèrent que ce récepteur pourrait jouer un rôle protecteur lors de maladies affectant entre autre les systèmes métaboliques et nerveux. Cependant, l’absence de ligand non peptidique pour le récepteur AT2les études rendin vivodifficiles. Dans cette étude, deux composés métaboliquement stables et hautement sélectifs pour le récepteur AT2, le M024 et le M132, ont été étudiés dans les cellules NG108-15. Ces composés ont une très grande affinité pour le récepteur AT2 (Ki de 0.4 et 17 nM respectivement). À une concentration de 0,1 nM, le M024 induit une élongation neuritique des cellules à des niveaux similaires à ceux obtenus avec l’Ang II ou avec le CGP42112A, qui est le seul agoniste sélectif pour le récepteur AT2. Le M132, quand à lui, possède une structure similaire au M024, mais il n’affecte pas la morphologie des cellules. Cependant, lorsqu’utilisé en combinaison avec l’Ang II, le M132, à des concentrations de 10 et 100 nM, inhibe l’élongation neuritique induite par l’Ang II de manière similaire au PD123319, l’antagoniste couramment utilisé pour ce récepteur. Afin de confirmer ces effets, les deux composés ont été testés pour leur capacité à agir sur les voies de signalisation induite par le récepteur AT2. Le M024 active mapk p42/p44 etRap1 à des niveaux égaux à ceux obtenus avec l’Ang II et le CGP42112A. D’un autre côté, le M132 inhibe l’action de l’Ang II sur ces mêmes voies de signalisation. Ces résultats indiquent donc que le M024 agirait comme un agoniste du récepteur AT2, alors que le M132 aurait des propriétés d’antagoniste. Il s’agit des deux premiers ligands non-peptidiques et métaboliquement stables ayant une si grande affinité pour AT2. Ce seront donc des outils très utiles pour la recherchein vivo et, éventuellement, utilisables comme outils thérapeutiques.
Effet des PPARγsur l’activité et l’expression des canaux potassiques, ROMK.Siham Ait Benichou, Ahmed Chraïbi. Les récepteurs nucléaires PPARγ participentà la régulation de divers processus cellulaires et membranaires tels que le transport du sodium au niveau rénal. Il est très bien établi qu’au niveau du néphron distalla réabsorption du sodium favorise la sécrétion potassiqueviales canaux ROMK montrant un lien étroit entre le transport de ces deux cations. Notre objectif est de vérifier l’hypothèse d’une implication directe des PPARγ dansla régulation de l’expression et de la fonction des canaux ROMK. Pour ce faire, les courants potassiques sont mesurés dans des ovocytes de grenouille exprimant les canaux ROMK en présence ou en absence de PPARγ, traités ou non à la rosiglitazone, un agoniste des PPARγ. Des expériences de RT-PCR et de Western Blot seront effectuées afin de déterminer l’effet de l’activation des PPARγl’expression des canaux sur ROMK et de définir les mécanismes de cette régulation. Nos résultats montrent qu’un traitement à la rosiglitazone augmente l’amplitude du courant potassique de deux fois. Aucun effet n’a été observé quand les ovocytes étaient traités au GW9662, un antagoniste des PPARγ. La mutation du site de phosphorylation du canal par SGK (S44A), montrent que l’effet des PPARγtotalement aboli. Nos travaux montrent que l’activation des PPAR estγ stimulela fonction des canaux ROMK et suggèrent une augmentation de la densité de ces canaux viavoie de la SGK. Des la expériences d’immunocytochimie et de marquage au niveau membranaire permettront de vérifier notre hypothèse et de confirmer la voie de signalisation impliquée dans cette régulation. Métabolisme énergétique cardiaquein vivo d’unmodèle nutritionnel de cardiomyopathie diabétique de type 2 chez le rat. Sébastien L. Ménard, Étienne Croteau, Roselle Gélinas, Pascal Brassard, René Ouellet, M’Hamed Bentourkia, Johan E. van Lier, Christine Des Rosiers, Roger Lecomte, André C. Carpentier. La résistance à l’insuline et le diabète de type 2 (DT2) mènent fréquemment au développement d’une cardiomyopathie métabolique (CM).Objectifs:Le but de cette étude est de caractériser le métabolisme énergétique cardiaque d’un modèle animal de cardiomyopathie diabétique de type 2.Méthodes:Des rats Wistar mâles rendus résistants à l’insuline à l’aide d’une diète riche en fructose et en gras pendant 6 semaines et ayant reçu une injection de streptozotocine (25mg/kg) (rats HFHFS) vs. des rats contrôles 18 ont été utilisés: 1) Mesurein vivoFDG), de dela consommation myocardique de glucose (MMRG du 18 l’index de captage des acides gras libres (Kiet de la fraction d’éjection ventriculaire gauchedu FTHA) 18 11 (ventriculographie auFTHA), de l’index de VO2 myocardique(k2C-acétate), dela cinétique de de 13 l’index de perfusion myocardique (K1de la cinétique deNH3) à l’aide de la tomographie par émission de positrons.Résultats:: 1) une hyperglycémie à jeûn; 2) uneLes rats HFHFS sont caractérisés par résistance à l’insuline; 3) une diminution de 94% du MMRG; 3) une augmentation de 21% duKI des acides gras libres (P= 0.28) associé à une augmentation de 15% de l’expression génique myocardique du transporteurCd36 (P =0.26); 4) une VO2 myocardique50% plus importante; 5) une perfusion myocardique réduite de 59%; et 6) une diminution de 26% de la fraction d’éjection ventriculaire. Discussion:Les rats HFHFS sont caractérisés par un DT2 compliqué d’une CM incluant de profonds changements des flux métaboliques myocardiques. Ce modèle animal sera très utile afin de tester l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques et préventives pour le traitement de la cardiomyopathie du DT2.
Dysfonction hypothalamo-hypophyso-surrénalienne dans le sepsis expérimental: MIF, « Most Important Factor »? Béatrice Débarges, Frédéric Chagnon, Claude Roberge, Olivier Lesur, Nicole Gallo-Payet. Le sepsis conduit souvent à une insuffisance surrénalienne relative, caractérisée par une augmentation transitoire des glucocorticoïdes (GC) et par une dysfonction de l’axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien. Les sécrétions de glucocorticoïdes sont contrôlées par l’ACTH et par des cytokines. Une de ces cytokines, le Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF), inhibe les effets du cortisol et est un agent pro-inflammatoire puissant. Il est exprimé dans l’hypophyse et dans la glande surrénale. Hypothèses :MIF est impliqué dans l’incapacité de la glande surrénale à répondre au stress induit par le sepsis. Son action s’exerce soit au niveau hypophysaire, altérant la sécrétion d’ACTH ou directement au niveau de la glande surrénale, interférant avec l’action de l’ACTH.Méthodes :Modèle de rat soumis à un sepsis endotoxinique (10 mg/kg de LPS 055:B5E.coli, 18±2heures) et un modèle de culture primaire de cellules corticosurrénaliennes.Résultats :les rats Wistar, le sepsis induit une augmentation Chez d’ACTH de 4 fois et de corticostérone de 19 fois. Par western blot, nous confirmons la présence de MIF et de son récepteur, CD74, dans la surrénale et l’hypophyse. Dans les cellules fasciculées, une -9 stimulation de 10 et 30 minutes au MIF (6.10M) induitune augmentation de la phosphorylation de mapk p42/44 ,suggérant la présence de CD44, corécepteur indispensable à CD74 pour activer la voie mapk p42/44 ense liant à MIF. Les présences de MIF et CD74 ont été confirmé par immunofluorescence sur des cellules stimulées ou non au LPS.Conclusion: Nos modèles de sepsis valident l’implication de MIF dans la régulation de l’axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien et de sa fonction surrénalienne. Potentiel mutagène chez les spermatides? Geneviève Acteau, Mélina Arguin, Jessica Leroux, Frédéric Leduc, Guylain Boissonneault. Les spermatozoïdes de plusieurs hommes infertiles présentent une altération de la chromatine et une fragmentation d’ADN. Afin d’acquérir une structure hydrodynamique, les spermatides compactent leur bagage génétique en remodelant leur chromatine ce qui occasionne chez 100% des spermatides, une fragmentation bicaténaire transitoire d’ADN. Nos résultats préliminaires en immunofluorescence suggèrent la présence d’un mécanisme de réparation sujet à l’erreur. Notre objectif est d’évaluer le potentiel mutagène de ce remodelage de la chromatine. Pour ce faire nous avons utilisé MutS, une protéine bactérienne qui lie les mauvais appariements d’ADN en vue de leur réparation.Nous avons démontré la spécificité de MutS pour les hétéroduplexes d’ADN par des rétentions sur gel (EMSA) et des immunocaptures. Nous allons maintenant étendre cet essai sur de l’ADN génomique des spermatides et des spermatozoïdes dans le but de démontrer et cartographierles mutations dues au remodelage. En étudiant cette source d’instabilité génétique, une nouvelle composante évolutive serapotentiellement découverte ainsi que l’étiologie d’anomalies génétiques chez l’embryon.
Les spermatides : ça casse ou ça passe! Frédéric Leduc, Marie-Chantal Grégoire, Mélina Arguin, Geneviève Bikond Nkoma, Guylain Boissonneault. Récemment, nous avons observé chez les souris et les hommes fertiles que la réorganisation de la chromatine des spermatides passe par un état d’instabilité génétique, marqué par la fragmentation de l’ADN et sa réparation par un système prompt à l’erreur. Il est donc essentiel de connaître les séquences touchées par cette fragmentation, puisque si celle-ci persiste, cela pourrait avoir des conséquences dramatiques pour la fertilité. Or, il n’existe aucune méthode pour cartographier les cassures à l’échelle d’un génome. À l’aide d’un modèle inductible de cassures bicaténaires endogènes, le locus MAT de la levureS. cerevisiae, nous décrivons une nouvelle stratégie, appelée «damaged DNA immunoprecipitation » pour cartographier les dommages à l’ADN qui permet d’enrichir spécifiquement les séquences avoisinant les cassures induites. En combinaison avec les technologies de biopuces et de pyroséquençage, nous pourrons établir un profil des dommages de l’ADN des spermatozoïdes des hommes infertiles, ce qui constituerait le premier pas vers la compréhension génétique de certaines formes d’infertilité masculines et de l’apparition de maladies génétiquesde novo.« Coaching » par une diététiste : une nouvelle méthode efficace à moindre coût pour la gestion du diabète.Marc-Antoine Bégin, Farrah Jean-Denis, Mélissa Labonté, Ghislaine Houde, Julie Ménard, Jean-Luc Ardilouze, Patrice Perron. Le diabète et ses complications constituent un fardeau économique majeur pour le système de santé. Le rôle des diététistes dans la gestion des risques cardiométaboliques (RCM) n’a jamais été évalué sur une longue période. L’objectif de cette étude randomisée de 2 ans est de démontrer que le coaching des patients diabétiques par une diététiste permet d’atteindre et de maintenir à moindre coût les valeurs thérapeutiques cibles recommandées pour réduire les RCM. 101 sujets diabétiques (A1c>7%) ont été randomisés dans le groupe coaching (GC, suivi aux 3 mois: poids, tour de taille (Tt), tension artérielle (TA), hypoglycémies, glycémies capillaires, biochimie, motivation, éducation + suivis téléphoniques mensuels et ajustements thérapeutiques + suivis annuels par l’endocrinologue) ou le groupe témoin (GT, suivi par médecin de famille +endocrinologue). Les groupes (GC n=51/GT n=50) étaient similaires pour: âge (60±10/60±11 ans), durée du diabète (16±9/16±10 ans), TA systolique et diastolique (TAS: 131±15/131±24; TAD: 74±9/77±10), glycémie à jeun (Glu: 8.8±3.2/8.4±3.3 mM), A1c(8.1±0.9/8.1±1.1 %), TG (1.88±1.28/1.78±1.23 mM), LDL-C (1.94±0.70/ 2.03±0.64 mM), CT/HDL-C(3.39±1.16/ 3.50±1.27), 2 IMC (34±8/31±5 kg/m ) et Tt (113±18/106±12 cm). À 1 an (GC n=42/GT n=44), l’ANOVA à mesures répétées a démontré une différence (p<0,05) pour l’A1cvs. 8.1±1.1/8.1±1.5 %), Tt (8.1±0.9/7.3±0.8 (113±18/113±19 vs. 106±12/108±13 cm), TAS (131±15/120±16 vs. 131±24/130±16 mmHg) et TAD (74±9/69±10 vs. 77±10/78±13 mmHg). Nos résultats indiquent que le coaching par une diététiste semble plus efficace que le traitement conventionnel. Si les analyses à 2 ans confirment nos résultats préliminaires, cette étude devra être confirmée à plus large échelle.
Effet physiologique du récepteur AT2de l’angiotensine II sur l’adipocyte.Michael Shum, Claude Roberge, Marie-France Langlois, André C. Carpentier, Anders Hallberg, Nicole Gallo-Payet. Plusieurs études ont montrées que l’utilisation des bloqueurs du R-AT1 (ARB)améliorait la résistance à l’insuline en modulant la physiologie de l’adipocyte. Cet effet pourrait être en partie dû à une activation du R-AT2. Des rats mâles Wistar ont été traités avec le nouvel agoniste sélectif du R-AT2,M24(0,03mg/kg/J), le Losartan-K (LOS-K) (10mg/kg/J) ou M24+LOS-K pendant 8 jours. Les analyses Western, montrent que chez les rats traités au M24 et M24+LOS-K, l’expression du R-AT2et de PPARy2augmente alors que l’expression du R-AT1 nevarie pas dans le tissu adipeux sous-cutané (SC). Cependant, dans le tissu adipeux abdominal (rétropéritonéal) l’expression du R-AT2et PPARy2ne varie par alors que l’expression du R-AT1Ces résultats préliminaires semblent indiquer que le diminue.M24, augmente l’expression de marqueurs de fonctionnalité des adipocytes sous-cutanés (ex: PPARy2) mais diminue ceux des adipocytes du tissu abdominal (rétropéritonéal) (ex:R-AT2). Ces résultats sont également observés dans des cultures primaires d’adipocytes provenant de tissu adipeux rétropéritonéal. Ceci favoriserait doncle stockage des lipides en périphérie plutôt qu’au niveau viscéral. De plus, l’action du M24 pourrait être due à une stimulation spécifique du R-AT2, mais aussi à l’inhibition de l’action du R-AT1. Cependant, d’autres études plus approfondies seront nécessaire pour bien comprendre le rôle exact du R-AT2dans la physiologie du tissu adipeux. Étude du rôle de GRP1 dans l’adipogenèse. Audrey Emond, Marie-France Langlois. De nombreuses études ont démontré l’importance du peroxisome-proliferator-activated receptorγ(PPARγ), un récepteur nucléaire (NR) modulant l’expression génique, dans la différentiation et la fonction des adipocytes. Son activation est possible par les thiazolidinediones, comme la rosiglitazone, des molécules augmentant la sensibilité à l’insuline utilisées dans le traitement du diabète de type 2. Une meilleure compréhension de l’adipogenèse dépend entre autres de la caractérisation des corégulateurs de PPARγ. General receptor for phosphoinositides 1 (GRP1) a été identifié comme un corépresseur des récepteurs des hormones thyroïdiennes (TRs). Les PPARs et les TRs étant des NRs, nous avons émis l’hypothèse que GRP1 pouvait être un corégulateur des PPARs et ainsi avoir un effet sur l’adipogenèse. Nous avons étudié l’expression protéique de GRP1 au cours de l’adipogenèse chez les cellules 3T3-L1 à différents stades de différenciation. Les résultats obtenus suggèrent que GRP1 est présent chez les 3T3-L1 non différenciées et que son expression est modulée au cours du processus de différentiation adipocytaire. Des essais transcriptionnels utilisant un gène rapporteur montrent qu’une concentration croissante de GRP1 occasionne une diminution de l’activité de PPARγ2 en présence de rosiglitazone. Ces résultats préliminaires suggèrent que GRP1 intervient possiblement dans la régulation de l’expression de gènes impliqués dans l’adipogenèse. Ces effets seront plus largement étudiés par sa surexpression et son invalidation dans le modèle des cellules 3T3-L1.
Caractérisation de l’impact des acides gras libres (AGL) sur l’engagement adipocytaire des cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain (CSMAd).Thomas Grenier-Larouche, Sherif Abou-Elela, Nathalie Rivard, André C. Carpentier. Certaines études démontrent que la différenciation adipocytaire des cellules souches mésenchymateuses régule le nombre d’adipocytes matures dans le tissu adipeux. Une altération de ce phénomène pourrait être à l’origine du débordement des AGL alimentaires observée dans le développement du diabète de type 2 Les mécanismes par lesquels les CSMAd s’engagent vers la lignée adipocytaire sont peu connus mais certaines voies de signalisation, notamment celle des Wnts (Wingless type), semblent être d’importants régulateurs de ce processus. Afin d’investiguer ces processus, des CSMAd sont différenciées 21 jours à l’aide d’un cocktail adipogénique (insuline,1,7μM; dexamethasone, 1μM; IBMX, 500μM; indomethacine, 10μM) et des concentrations physiopathologiques d’oléate et de palmitate (100 à 250μM) sont ajoutées aux cultures en différenciation. La lipotoxicité est évalué par un essaie colorimétrique au MTT. L’adipogenèse est démontrée par la lecture de la densité optique à 500 nm de l’extraction de coloration à l’huile rouge à l’aide d’isopropanol 100% et l’expression de certains marqueurs de différenciation (PPAR-γ, AP-2). L’exposition prolongée aux différentes concentrations de palmitate diminue de façon significative la survie cellulaire par rapport aux conditions contrôles (de 68,82%±8,88 à 64,35%±11,59,ρ>0,05)aux cultures exposées à l’oléate ( etρ>0,001) maissans être dépendant de la concentration. Nos résultats, bien que fragmentaires, laissent croire qu’une surexposition du tissu adipeux au palmitate pourrait altérer la formation de nouveau adipocytes, et mené à l’hypertrophie des adipocytes déjà présents. Régulation fonctionnelle du récepteur de l’ACTH, MC2R.Simon Roy, Nicole Gallo-Payet MC2R, majoritairement trouvé dans les glandes surrénales, est le récepteur de l’hormone ACTH qui stimule la production de glucocorticoïdes chez l’homme. MC2R est un RCPG qui requiert la présence d’une protéine accessoire (MRAP) pour sa fonctionnalité. L’objectif était de déterminer si MC2R subit une désensibilisation (diminution ou perte de production d’AMPc) et une internalisation après des expositions de courtes ou longues durées à différentes concentrations d’ACTH. Les expériences ont été réalisées dans des cellules HEK293/FRT exprimant de façon stable Myc-MC2R et MRAPβ-Flag. Nos résultats montrent que la cinétique d’accumulation de l’AMPc intracellulaire n’est pas linéaire, indiquant une désensibilisation. Dans ces conditions, la diminution d’expression membranaire de MC2R a été quantifiée par ELISA dans des cellules soumises à différentes conditions d’incubation avec l’ACTH. Nous avons observé une diminution de l’expression des récepteurs membranaires maximale de 28% avec un t½ de 6 min sous une stimulation de 100 nM, alors que la concentration de 0.1 nM n’induit pas de diminution d’expression des MC2R membranaires. L’imagerie en temps réel réalisée à l’aide d’une protéine de fusion nommée Halo-MC2R et du ligand fluorescent HaloTag-Alexa488, qui est imperméable aux membranes cellulaires, a permis de visualiser l’internalisation des récepteurs membranaires dans des compartiments intracellulaires. Le sucrose hypertonique et la surexpression du dominant négatif de la GTPase dynamine (K44A) ont aboli l’internalisation de MC2R. Les résultats de microscopie à épi-fluorescence indiquent aussi une redistribution de MC2R et de MRAPβ dansdes compartiments intracellulaires. De plus, laβ-arrestine-1 subit une redistribution dans le cytoplasme des cellules stimulées à l’ACTH. Il reste à déterminer si MC2R recycle après son internalisation et si une ou des kinases interviennent dans la désensibilisation et dans l’internalisation de MC2R.
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